（遗传学专业论文）新型牛溶菌酶基因的构建、表达及活性研究.pdf

四川大学硕士学位论文 新型牛溶菌酶基因的构建、表达及活性研究 专业：遗传学 研究生：章欢指导教师：高荣教授 摘要：为构建具有高效抗菌、活性持久的抗菌基因，探索研制新型抗菌制剂， 克服耐药性细菌感染日益严重的问题，本实验室应用重叠区p c r 技术对牛奶 溶菌酶基因加以改造。在其c 端引入屁蒯i 的酶切位点，n 端引入b g l i i 和 e c o r i 酶切位点和终止密码子，并在酶切位点之前添加保护性碱基。去除了 部分非。螺旋、b 折叠的序列，保留其两个活性部位，并在序列中间引入编 码s e r - g l y - g l y 柔性连接肽的序列。测序结果显示，p c r 产物大小为3 4 9 b p ， 编码1 0 8 个氨基酸，与目的片断大小一致。克隆p c r 产物，并构建了 p g e x 一4 t l - b l y 原核表达载体。经b a r 廿i i 和6 c o r i 酶切及质粒p c r 鉴定，证 实本实验构建的新型牛溶菌酶基因已克隆到原核表达载体p g e x 一4 t - i 上，为 进一步研究其诱导表达条件及生物学功能奠定了基础。 一 将已构建的p g b l y 蛋白表达载体质粒转化大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) ，用 2 y t 培养基培养，以彤r g 诱导融合蛋白表达，作s d s p a g e 分析表达情 况。结果显示，表达蛋白分子量为3 8 2 k d a ，与预期目标带大小一致。将诱 导条件经过温度梯度、时间梯度以及叮g 浓度梯度的分析选择进行优化。 通过优化原核诱导表达条件，发现g s t b l y 蛋白在2 8 0 c ，i p t g 终浓度为i m m 的条件下诱导5 小时，蛋白表达效果较佳。 将菌体反复冻融后超声破碎，将破碎后的上清及沉淀分别作s d s p a g e 分析，发现融合蛋白的表达产物以可溶形式存在。将融合蛋白用g l u t a t h i o n e s e p h a r o s e4 b 纯化后，进行抑菌实验。用四种标准菌株，即大肠杆菌 ( e s o h e r i c h 妇c o l j ) a t c c ( a m e r i c at y p ec u l t u r ec o l l e c t i o n 美国标准菌 库) 2 5 9 2 2 ，绿脓杆菌( p s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a ) a t c c l 0 2 1 1 ，金黄色葡萄 四川大学硕士学位论文 球菌( s t a p h y l o c o c c u sd u r c u $ ) a t c c 2 6 1 1 2 ，肺炎链球菌( s t r e p t o c o c c u s p n e u m o n i a e ) a t c c 4 9 6 1 9 检测终浓度为l o u g m l 时蛋白的抑菌效果，发现该 融合蛋白具有明显的抑制革兰氏阳性菌活性( p 如0 5 ) ，优于对照g s t 蛋白 和正常溶菌酶。提示我们所构建的新型牛奶溶菌酶有望成为一种新型高效的 抗菌分子，应用于抗菌研究，研制新型抗菌制剂，提高机体抵抗病菌感染的 能力。 关键词：牛、溶菌酶、p g e ) 【- 4 t 一1 、构建、原核表达、抗菌活性 4 四川大学硬士学位论文 c o n s t r u c t i o n , e x p r e s s i o na n db i o a c t i v i t ya n a l s i so f an o v e lb o v i n el y s o z y m eg e n e m a j o r ：g e n e t i c s g r a d u a t e ：z h a n gh u a n t u t o r ：p r o lg a or o n g a b s t r a c t ：i no r d e rt oc o n s t r u c tan o v e ll y s o z y m eg e n et oi m p r o v ei t sa n t i b a c t e r i a l a c t i v i t ya n dd e v e l o pe f f e c t i v em e d i c i n et oo v e r c o m et h ei n c r e a s i n gi n f e c t i o no f a n i m a l sb yd r u gr e s i s t a n tb a c t e r i a , t h ee x p e r i m e n tw a sc a r r i e do u tt or e c o n s t r u c t t h eb o v i n em i l kl y s o z y m eg e n eb yu o fo v e r l a p p i n gp c rt e c h n i q u e t h e e n z y m es i t e s o fb a m h lw e r ei n t r o d u c e dt ot h ec - a n d , b g l l i ，e c o r ia n d t e r m i n a t i o nc o d ei n s e r t e dt ot h en - e n do ft h eb o v i n el y s o z y m eg e n e t w o p r o t e c t i v eb a s e sw e r ea d d e dt ot h eo u t s i d eo fe 1 1 z y m es i t e s ，a n ds o m ep a r to f s e q u e n c e sb e t w e e nd - h e l i xo f b f o l d t s t r u c t u r ew e r ed e l e t e d t h er e c o n s t r u c t e d n o v e lb o v i n em i l kl y s o z y m ec d n a sw a si n t r o d u c e dw i t hal i n k e rs e q u e n c e e n c o d i n gs e r - g l y g l ya m i n oa c i dr e s i d u e s t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h ec l o n e d e d n as e q u e n c ew a s3 4 9 b pl o n g ，c o d i n g1 0 8a r l 血oa c i d s ，w h i c ha c c o r d e dw i t h t h ee x p e c t e ds i z e t h e nt h eb l y c d n af r a g m e n tw a ss u b e l o n e di n t op m k a r y o t i c e x p r e s s i o nv e c t o rp g e x 4 t 1 ，f o r m i n gt h ep r o k a r y o t i ce x p r e s s i o np l a s m i d ( p g - b l y ) t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dw a sd i g e s t e db yb a m h ia n de c o r i , a n d i d e n t i f yb yp l a s m i dp c r i tw a ss h o w e dt h a tt h eb l ye d n af r a g m e n tw a s m e c e s s f u l l yi n s e r t e d i n t ot h e p l a s m i d i nc o r r e c to r i e n t a t i o n t l l i sl a i dt h e f o u n d a t i o nf o rf u r t h e rr e s e a r c ht h ec o n d i t i o n so f t h ei n d u c i n ge x p r e s s i o n t h er e c o m b i n a n tp l a s m i do fp g - b l yw a st r a n s f o r m e di n t ot h eb l 2 1 ( d e 3 ) c o m p e t e mc e l l s ，i n c u b a t e di n2 x y rc u l t u r e t h ee x p r e s s i o no f t h ef u s i o np r o t e i n w a si n d u c e d 、i t hi p t g t h ep r o t e i ne x p r e s s i o nw a sa s s a y e db ys d s p a g e t h e 5 四川大学硕士学位论文 r e s u l tw a sf o u n dt h a tt h em o l e c u l a rw e i g h to ft h ef u s i o np r o t e i nw a s3 8 2 k d a , w h i c hw a sa c c o r d e dw i t ht h ea i mp r o t e i n t of o u n dt h eb e s ti n d u c i n gc o n d i t i o n , t h ee x p r e s s i o no f t h ef u s i o np r o t e i nw a si n d u c e du n d e rd i f f e r e n ti n c u b a t i o nl i m e s , t e l 】n p e r a t u r e sa n di p t gc o n c e n t r a t i o n s i tw a sd i s p l a y e dt h a tt h ee x p r e s s i o nl e v e l o ft h ef u s i o np r o t e i n 辅舔e s p e c i a l l yh i g hw h e ni n d u c e d 埘也l m mi p t ga l2 8 0 c a 矗e r5h o u r s a f t e rf r o z e na n dt h a w e dm a n yt i m e s ，t h eb a c t e r i aw e r eb r o k e nu pb y u l t r a s o n i c ，a n dt h e nt h es p l i tp r o d u c t sw e r ec e n t r i f u g e da n da n a l y z e db y s d s p a g e t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h ee x p r e s s e df u s i o np r o t e i ne x i s t si nt h e f o r mo f s o l u b l ep i 晒n ，a n dw a sp u r i f i e dw i t hg l u t a t h i o n es e p h a r o s e4 bt oc a l t y o u ta n t i b a c t e r i a le x p e r i m e n l1 1 l er e s u l t sw e f ef o u n dt h a tt h ef u s i o np r o t e i nh a d s i g n i f i c a n th i g h e ra n t i b a c t e r i a la c t i v i t yi nc o m p a r i s o nw i t ht h a to fc o n t r o lg s t p r o t e i na n dn o r m o ll y s o z y m em t h ec o n c e n t r a t i o no fl o u g m 1 rs u g g e s t e dt h a t t h en o v e lb o v i n el y s o z y m eh a dr e m a r k a b l eb i o a c t i v i t yt oi n h i b i tb a c t e r i a lg r o w t h , w h i c hc o u l db ep u t a t i v e l ya p p l i e df o rt r e a t m e n to fa n i m a li n f e c t i o n 、i t hb a c t e r i a , a n dw a sh o p e f u lt o d e v e l o p an e wa n t i b a c t e r i a lm e d i c i n et oe n h a n c et h e a n t i m i c r o b i a la b i l i t yo f a n i m a l k e yw o r d s ：b o v i n e ，l y s o z y m e ，p g e x - 4 t 1 ，c o n s t r u c t i o n , p r o k a r y o t i c e x p r e s s i o n , a n t i b a c t e r i a la c t i v i t y 6 四川大学硕士学位论文 刖吾 奶牛乳房炎是奶牛业最常见、最多发的一种疾病，是危害奶牛业发展的 一大主要疾患。据世界奶牛协会统计，奶牛隐性乳房炎的发病率高达5 0 9 6 左 右，平均降低奶量i o 1 5 ，延长产后发情和妊娠时间降低牛奶的营养成分 和品质，影响人体健康( 胡士明，1 9 9 8 ；杨龙骐等，2 0 0 1 ) ，病情严重者因 产乳量明显减少或失去泌乳能力而被淘汰。其发病的主要原因是病原微生物 感染，病原菌多达1 5 0 多种，一类是革兰氏阳性的金色葡萄球菌和无乳链球菌 等传染性病原，另一类是革兰氏阴性的大肠杆菌、克雷伯氏杆菌和乳房链球 菌等条件性病原菌，两类细菌约占据奶牛乳房炎致病菌的9 0 9 6 ( 胡松华等， 1 9 9 8 ) 。一些真菌、霉形体、病毒也是引起乳房炎的病原( 刘宝良等，2 0 0 5 ) 目前治疗奶牛乳房炎多用抗生素，治疗效果一般在5 0 9 0 9 6 ( 母安雄等， 2 0 0 2 ) ，该疗法的疗效好，见效快，同时也存在许多不利因素。如容易使 细菌产生耐药性，破坏生态环境；单一药物抗菌谱不广；容易造成抗生 素残留，导致在动物体内的蓄积，从而严重威胁人类健康；其它副作用 ( r e b h u nw c 等，1 9 9 9 ) 。中药治疗奶牛乳房炎，毒性低，效果与抗生素接 近或稍低，但其使用剂量普遍较大，治疗成本较高( 孙怀昌等，2 0 0 4 ) 。疫 苗免疫预防奶牛乳房炎目前尚处于研究阶段( 林锋强等，2 0 0 2 ) 。 牛乳中含有许多活性酶，主要分为三大类，水解酶、氧化还原酶和还原 酶( 刘世清，2 0 0 5 ) 溶菌酶( l y s o z y m e ) 是一种能水解细菌细胞壁中粘多糖 的6 - i - 4 糖苷键的胞壁质酶，通过裂解细胞壁而溶解和杀死多种致病菌。研 究显示其对球菌、杆菌、螺形菌等均具有杀灭作用，对革兰氏阳性细菌具有 直接的溶解作用，效果尤佳。在分泌型免疫球蛋白a 和补体的参与下，对革 兰氏阴性细菌具有间接的溶解作用。溶菌酶还能增强巨噬细胞和白细胞的吞 噬和消化功能、灭活诱发炎症的酸性物质和增强抗菌素及其它药物的疗效， 因此具有消炎、消肿、组织修复、改善组织局部血液循环和分解脓液等药理 作用( 荣晓花等，1 9 9 9 ) 。它广泛存在于哺乳动物的泪液、唾液、血浆、尿、 乳汁、白细胞及其他体液( 如淋液) 和组织( 如肝、肾) 细胞内。 7 四川大学硕士学位论文 目前，将溶菌酶应用于治疗奶牛乳房炎的研究已经展开溶菌酶杀菌效 果强，杀菌谱广，稳定性强，克服了传统化学类制剂对机体具有刺激性、细 菌容易产生耐药性的缺点，易被机体所接受，且没有任何毒副作用，可避免 传统的抗生素治疗奶牛乳房炎对奶牛本身和牛奶所造成的影响，治疗作用 快，使用方便，不仅可用于预防和治疗奶牛的乳腺炎，还可以用于预防和 治疗奶牛或其他动物的急慢性子宫内膜炎、阴道炎、口蹄疫、口腔炎、皮肤 溃疡、皮肤外伤、全身性感染、外耳道炎症等细菌感染性疾病，具有广阔的 市场前景和应用前景孙怀昌等( 2 0 0 4 ) 将溶菌酶的广谱抗菌作用与基因治 疗原理相结合，以表达人溶菌酶的重组质粒为药物，对奶牛乳房炎进行了一 系列治疗试验。结果显示，用人溶菌酶的重组质粒治疗的有效率为8 6 4 ， 与抗生素的治疗效果接近，并明显高于中药乳炎消的治疗效果。经过治疗后。 不仅奶样的c m t 结果有明显变化，而且细菌总数及代表性致病菌数均明显降 低，产奶量也有明显提高，治疗作用较为持久和可靠。但是其使用剂量大， 有待进一步降低。虽然用人溶菌酶有利于牛奶“人乳化”，但是，对于奶牛 本身来说，该基因仍然属于外来物质，机体是否对其产生防御机制还有待考 证。 本实验在牛奶溶菌酶的基础上，对其进行蛋白质的修饰改造。与编码牛 奶溶菌酶模板序列相比，在其c 端引入b a m h i 的酶切位点，n 端弓1 x b g m 和 e c o r i 酶切位点，并在酶切位点之前添加保护性碱基。去除了部分非。螺旋、 1 3 折叠的序列，保留其两个活性部位，并在序列中间引入编码s e r - g l y - g l y 柔 性连接肽的序列。将这种新型溶菌酶( n o v e lb o v i n el y s o z y m e ，b l y ) 与原 核表达载体p g e x - 4 t - i 连接得到重组表达质粒p g b l y ，转化大肠杆菌d h 5 e t ， 经氨苄青霉素抗性筛选，经质粒p c r 及酶切鉴定，获得了b l y 表达的工程菌 株。再将p g - b l y 转化入大肠杆菌b l 2 1 中进行表达。采用s d s p a g e 凝胶电 泳检测表达蛋白，并研究其抗菌活性。为其在相关真核表达研究、研制新型 的高效抗菌制剂及在奶牛疾病治疗等方面，提供了坚实的基础，具有重要的 现实意义。 四川大学硕士学位论文 第一章新型牛溶菌酶基因的构建 摘要 为了构建一种可能具有抗菌活性，增加或增强溶菌酶活性的新型牛溶菌 酶基因，本实验室应用p c r 技术对牛奶溶菌酶基因加以改造。去除部分非活 性基团的短肽，保留两个活性部位，同时在序列中加上s e r - g 1 y - g 1 y 柔性连 接肽序列，并在两端引入b a 皿h i 、b g i i i 和e c o r i 酶切位点，在末端设计终 止密码子，克隆p c r 产物，并构建了p g e x _ 4 t 一卜b l y 基因表达载体。经b a l i ， e c o r i 酶切及质粒p c r 鉴定，证实b l y 基因已克隆到原核表达载体p g e 卜4 t l ， 为进一步研究其诱导表达条件及生物学功能奠定了基础。 关键词；b l y ，溶菌酶，p g e x - 4 t 一1 ，p c r 反应 口 溶菌酶( 1 y s o z y m e 。l y z ) 是一种专门作用于微生物细胞壁的水解细菌细 胞壁中粘多糖的b 1 , 4 糖苷键的胞壁质酶，常与氯离子结合成为溶酶氯化 物，是一种碱性蛋白质，存在于许多动物、植物和微生物中。自上世纪2 0 年代被发现以来，人们对溶菌酶的研究得到了蓬勃发展，已在食品工业、医 疗卫生、动物饲养以及包装工业等方面显示出广阔的应用前景。研究发现， 溶菌酶对革兰氏阳性细菌具有直接的溶解作用，催化革兰氏阳性菌细胞壁不 溶性多糖水解，生成可溶性黏肽。在分泌型免疫球蛋白a 和补体的参与下， 溶菌酶还对革兰氏阴性细菌具有间接的溶解作用，是一种天然的抗菌物质。 由于其能够增强巨噬细胞和白细胞的吞噬和消化功能、将诱发炎症的酸性物 质灭活、增强抗菌素及其它药物的疗效，具有消炎消肿、帮助组织修复、改 善组织局部血液循环和分解脓液等药理作用( 荣晓花等，1 9 9 9 ) ，溶菌酶在 医疗界中倍受关注。牛体内溶菌酶( b o v i n el y s 0 z y m e ，b l y s ) 有大约l o 种， q 四川大学硕士学位论文 表达的潜在位点有：乳腺、唾液、泪液、胃、气管组织以及中性粒细胞、嗜 红细胞、巨噬细胞、白细胞等( d a v i dm ie ta 1 1 9 8 9 ；k a z u h i k ot a k e u c h ie la 1 1 9 9 3 ) 。由于牛奶与人们的生活息息相关，其质量的好坏关系着人们的健康， 因此，对牛奶溶菌酶的研究尤为突出。 本实验室首次在牛奶溶菌酶的基础上，对其蛋白质结构进行改造，以期 望它可能构成一种新的具有比原初的牛奶溶菌酶有更好抗菌活性的蛋白。通 过基因工程手段获取具有该蛋白，进一步工作拟就其生物学与免疫学特性深 入研究，为新的多功能活性分子的构建及疫苗免疫和疾病中应用的可能性进 行有益的探讨。 2 材料和方法 2 1 材料 2 1 1 质粒和宿主菌 ec o l id h 5 a s u p e4 4al a cu 1 6 9 ( 中8 0 1 a c z m 1 5 ) h s d r l 7r e c a le n d a l g y r a 9 6t h i lr e l a l 为本室保存。 ： p g e x 一4 t l ：购自p h a r m a c i a 公司，其物理图谱见图l 。 2 1 2 主要试剂 高保真p f u 酶及限制性内切酶( 占勘斌，e c o l 西) ：均购自m b i 公司 t , d n a 连接酶：购白t a k a r a 公司 d n a 胶回收试剂盒：购自m b i 公司 牛小肠碱性磷酸酶c l a p ：购自惦i 公司 1 0 璺业查兰堡主兰垡堡兰 图lp g e x 4 t - 1 载体的物理图谱 f i g 1p h y s i c a lm a po fp g e x 4 t 一1v e c t o r 2 1 3 培养基及溶液配制 1 ) l b 培养基( 1 0 0 0 m 1 ) ：胰蛋白胨 1 0 9 酵母提取物 5 9 n a c i 1 0 9 用1 nn a o h 调节p h 至7 5 ，高压蒸汽灭菌2 0 分钟 四川大学硕士学位论文 2 ) l m 培养基( 1 0 0 0 m 1 ) ,胰蛋白胨l o g 酵母提取物 5 9 n a c i l o g m g s o 广7 h 如 2 4 9 琼脂1 8g 用1 nn a o h 调节p h 至7 0 ，高压蒸汽灭菌2 0 分钟。 3 ) s o b 培养基 配制每升培养基应在9 5 0 m l 去离子水中加入： 胰蛋白胨 2 0 9 酵母提取物 5 9 n a c l o 5 8 9 震荡容器使溶质全部溶解，然后加入2 5 0 m m o l lk c i 溶液1 0 m l ( 在 1 0 0 m l 去离子水中溶解1 8 6 9k c i ( 配成2 5 0 m m o f lk c i 溶液) ，用 5 m o l l n a o h ( 约0 e n d ) 调p h 值至7 0 ，然后加入去离子水至总体积为1 l 。 ，1 1 k g c m z 压力，1 2 l 压蒸汽灭菌1 5 分钟。， 该溶液在使用前加入5 m l 灭过菌的2 m o f lm g c h 溶液( 2 m o l lm g c l z 溶液的配置方法如下：在9 0 m l 去离子水中溶解l9 克m g c h ，然后加入去离 子水至总体积达到l o o m l 1 1 k g m 2j f i , j j ，1 2 1 x 2 b i , 蒸汽灭菌2 0 分钟。 4 ) s o c 培养基：s o b + 2 0 m m o l l 葡萄糖 2 2 方法 2 2 1b l y 基因引物的设计与合成 根据编码牛奶溶菌酶成熟肽的e d n a 碱基序列，设计出新型溶菌酶基因。 根据互补重叠区扩增方法设计并人工合成如下六条引物，在p 1 端引入b a g b i 位点，在p 6 端引入b g l i i 和e c o r i 酶切位点以及终止密码子t g a ，并在n 端引入a g cg g tg g c ，即编码s e r - g l y - g l y 的柔性连接肽序列，以利于溶菌 酶自身的空间折叠。引物序列如下： 1 2 四川大学硕士学位论文 p l ：b a r n m 5 g c 鱼螋a a g t t t a g g t g t g a c r c t t g c c a g a a c t c t g a a g a a a c t tg g a t t g g a r g g c t a t c g a o g a ( 玎c a g - 3 p 3 ： p 4 p 5 ： 5 - g c a c g t g t g r r l 了l 气a r r g c t l l c c 蛆t g g c c a aa c a c a c c c a g 兀- r g c c a g ( 把t g a c t c c t c g 加隗g c c a t c c a a t ：3 5 a ：r r r g a a a i a t c c c a ：i ：c 气a = r c a g t g c t r r r g t c t c c a c g a r r g t a g r 盯g 1 ：c 气( 记a c g t g t g t t g t a 加盯g c t 兀3 5 - c a c c g c t a c a g ( t o g g g r 兀_ r ( 圮c a t c a t t g c a c c a c c a g c g g c t 戌r r ga ：r 1 t g a aa ：i a i c c a t a a t c a g t g c - 3 5 - g c t c g a a t g c c t t g r g g a t c t c t g a c a a c c c t c l t r c r c a c a t g c t a c a c r c a g c g c t g c a g c c a c c g c l a c a g g c t g c r c r g 3 p 6 ： e c o r l b g l l i、 5 一c g 鱼迎鱼叁殴r r c a g c a a c c c t g a a c 觚a a c l a c a c c g g t t t c t c c a t g c c a c c c a r g c t c g a a t c e c r r g t g g a ：r 3 上述引物由上海生物工程公司合成。 2 2 2b t y 基因的p e r 扩增 主要采用重叠区扩增法( s o e i n g ) ( h o r t o nr e ta l1 9 8 9 ) 和热启动 法。 ( 1 ) p i 、p 2 扩增条件如下：在薄壁p c re p 管中加入3 8 5 v a 的d d h z o ，l m 1 0 r a md n t p ，p 1 、p 2 各3 山( 各为l o p m o l 1 d ) 。5 m1 0 * p c rb u f f e r ， 0 5 山p f u 酶。将上述液体配制好后，充分混合。然后用t h e r m o 公司 的4 8 0p c r 仪进行p c r 扩增。9 4 预变性2 分钟后，9 4 3 0 秒、6 0 3 0 秒、7 2 3 0 秒共3 0 个循环，然后7 2 延伸2 分钟，至4 保存。 扩增产物命名为：z 2 。 四川大学硕士学位论文 ( 2 ) z 2 、p 3 扩增条件如下：取前次反应液( 即z 2 ) 1 7 m ，p 3 1 山( 1 0 p m o l p 1 ) 加入薄壁p c re p 管中，并加入1 ml o m md n t p ，3 3 山1 0 p c rb u f f e r ， 0 5 山p f u 酶，用d d h z o 将总体积补至5 0 m 。将上述液体配制好后， 充分混合然后用t h e r m o 公司的4 8 0p c r 仅进行p c r 扩增。9 4 预 变性4 分钟后，9 4 3 0 秒、6 0 3 0 秒、7 2 3 0 秒共3 0 个循环，然后 7 2 延伸2 分钟，至4 保存。扩增产物命名为：z 3 。 ( 3 ) z 3 、p 4 扩增条件如下：取前次反应液( 即z 3 ) 1 5 p i ，p 40 3 m ( 1 0 p m o l p 1 ) 加入薄壁p c re p 管中，并加入1 ml o m md n t p ，3 5 m1 0 p c rb u f f e r ， 0 5 山p f u 酶，用d d h 。0 将总体积补至5 0 肛l 。将上述液体配制好后， 充分混合然后用t h e r m o 公司的4 8 0p c r 仪进行p c r 扩增。9 4 预 变性4 分钟后，9 4 3 0 秒、5 7 3 0 秒、7 2 3 0 秒共3 0 个循环，然后 7 2 延伸3 分钟，至4 保存。扩增产物命名为：z 4 。 ( 4 ) 为增加反应液中z 4 的含量，以z 4 为模板，以p l 、p 4 为引物，进行 常规p c r 扩增。方法如下：在薄壁p c re p 管中加入1 9 2 5 m 的d d h 2 0 ， 0 5 ml o m md n t p ，p 1 、p 4 各l m ( 各为l o p m o l l - l d ，0 5 m z 3 ，2 5 v j i o * p c rb u f f e r ，0 2 5 mp f u 酶。将上述液体配制好后，充分混合。 然后用t h e r m o 公司的4 8 0p c r 仪进行p c r 扩增。9 4 预变性4 分钟 后，9 4 3 0 秒、5 7 3 0 秒、7 2 3 0 秒共3 0 个循环，然后7 2 延伸3 分钟，至4 保存。扩增产物命名为：z 4 ( 5 ) z 4 、p 5 扩增条件如下：取前次反应液( 即z 4 ) 7 5 m ，p 50 3 v a ( 1 0 p m o l p d 加入薄壁p c re p 管中，并加入0 5 ml o m md n t p ，1 8 沮 i o * p c rb u f f e r ，0 2 5 mp f u 酶，用d d h 。0 将总体积补至2 5 山。将上 述液体配制好后，充分混合。然后用t h e r m o 公司的4 8 0p c r 仪进行 p c r 扩增。9 4 预变性4 分钟后，9 4 3 0 秒、5 9 3 0 秒、7 2 3 0 秒 共3 0 个循环，然后7 2 延伸3 分钟，至4 保存。扩增产物命名为： z 5 。再重复进行常规p c r 扩增，方法同z 4 的扩增，以p l 、p 5 为引 物，但退火温度为6 8 。产物命名为：z 5 。 ( 6 ) z 5 、p 6 扩增方法同z 5 的扩增，但退火温度为5 5 。再重复进行常 规p c r 扩增，方法同z 5 的扩增，以p 1 、p 6 为引物。产物命名为z 6 ， 即本实验设计的新型溶菌酶基因b l y 。 1 4 四川大学硕士学位论文 每次p c r 反应后，均取扩增产物进行2 的琼脂糖凝胶电泳，紫外观察。 根据相对分子量m a r k e r 标示，确定片断大小与预期大小相符后才进行下一 步p c r 操作 2 2 3 扩增片段回收 按照d n a 快速纯化回收试剂盒操作步骤纯化回收扩增产物。 ( 1 ) 扩增产物进行1 的琼脂糖凝胶电泳紫外观察，根据相对分子量 m a r k e r 标示，从琼脂糖凝胶上切下含目的基因片段的凝胶。 ( 2 ) 加入3 倍体积溶液( 如果凝胶重为o 1 9 ，其体积可视为l o o p j ，则加 入3 0 0 v d 溶胶液。如果凝胶更大，可按比例加大溶胶液用量) 。 ( 3 ) 5 5 水浴放置5 分钟，每2 分钟漩涡混合一次，确保胶块充分溶解， 如果还有未溶的胶块，可再补充加一些溶胶液或继续放置几分钟，直 至胶块完全溶解。 。 ( 4 ) 待完全溶解后，加入5 山悬浮的硅粉液，混匀，并于5 5 0 c 温浴5 分 钟，每2 分钟漩涡混合一次；1 2 ，0 0 0 r p m 离心5 秒钟，弃上清。 ( 5 ) 加入5 0 0 p ! 的洗脱缓冲液，打散沉淀，1 2 ，0 0 0 r p m 离心5 秒，弃上 清。重复3 次，最后一次弃上清后再1 2 ，0 0 0 r p m 离心5 秒，以便去 掉痕量的上清。 ( 6 ) 加入2 0 “l 无菌双蒸水悬浮沉淀，5 5 0 c 温浴5 分钟，离心收集上清于 一干净e p 管中，- 2 0 0 c 保存。 ( 7 ) 以2 o 的琼脂糖凝胶电泳检测回收片段。 2 2 4 酶切片断的制备 2 2 4 1 扩增片断的双酶切 p c r 回收产物进行b a m h i ，e c o r i 双酶切。取回收产物2 0 1 a l ，n 3 , 1 0 v i 1 0 x 酶切缓冲液，5 m ( 1 0 u 肛1 ) b a m h i ，5 m ( 1 0 u 9 1 ) e c o r i ，6 5 i , 1d d h 2 0 ， 3 7 0 c 温浴3 小时。产物进行1 o 琼脂糖凝胶电泳，5 v c m 电泳1 小时后， 1 5 四川大学硕士学位论文 溴乙锭染色，在紫外灯下切下3 5 0 b p 左右大小片段的凝胶，采用m b i 琼脂 糖凝胶d n a 抽提试剂盒回收d n a 片段 2 2 4 2p g e x 一4 t _ 1 栽体双酶切片断的制备 将载体p g e x 4 t - i 进行b a d l i 、点勰i 双酶切。2 0 m 体系中加入d n a5 m ， 1 0 x b u f f e r2 m ，历硪i 艮。r i 各0 5 m ，3 7 水浴3 小时。 为防止载体自连，在双酶切之后即进行去磷酸化处理。加入5 m1 0 x 碱 性磷酸酶缓冲液，l m 碱性磷酸酶，3 7 处理3 0 分钟。点样于0 7 的琼脂 糖凝胶，电泳检测。胶回收酶切产物 2 2 58 l y 与p g e x - 4 t - 1 载体的连接 连接体系( 1 0 山) 1 6 0 c 水浴过夜连接1 6 h 2 2 6 连接产物的转化 2 2 6 1 感受态细胞的制备 参照h i r o a k i ( h i r o a k i i ，1 9 9 0 ) 等方法进行，稍作改动。 6 四川大学硕士学位论文 ( 1 ) 从冻封保存的ec o l id h 5 a 中挑取单菌落，接种于2 m l s o b ，3 7 。c 振 摇过夜培养。 ( 2 ) 取0 5 m l 过夜培养的菌液接种于5 0 m l s o b 中，继续振摇2 3 小时， 至培养液o d 砷o = o 4 左右 ( 3 ) 冰浴3 0 分钟，4 。0 0 0 r p m4 0 c 离心1 分钟，去上清。 ( 4 ) 用i m l 预冷的t b ( o 2 m o l 几k c l ，0 0 5 4 m o i um n c l 2 ，0 0 1 5 m o l lc a c l 0 0 1 2 5 m o i 几k 忸s ) 悬浮菌体，再加入1 4 m l t b ，冰浴1 0 分钟，4 ，0 0 0 r p m 4 0 c 离心1 0 分钟，去上清。 ( 5 ) 4 m l t b 悬浮细胞，滴加2 8 0 1 j i 高纯度的二甲基亚砜( d h n c t h y l s u l f o x i d e ，d 骼o ) ，混匀，并冰浴l o 分钟。分装小管后，液氮冻存。 2 2 5 2 质粒d n a 对大肠杆菌的转化 参照z h a n gy i z h e n g 方法进行。 ( 1 ) 自液氮中取出取出感受态细胞，放在冰上直至完全溶解。 ( 2 ) 取l o d 连接产物与2 0 0 p l 感受态细胞混匀，冰浴3 0 分钟。 ( 3 ) 4 2 0 c 热冲击9 0 秒，冰浴静置2 分钟。 ( 4 ) 加入8 0 0 p is o c ，3 7 0 c 缓慢振摇l 小时。 ( 5 ) 5 ，0 0 0 r p m 离心5 分钟，去部分上清，余5 0 “l 上清悬浮细胞，涂布于 含5 0 p g m la m p 的l m ，3 7 。c 倒置培养1 8 小时。 2 2 7 重组质粒的筛选和初步鉴定 2 2 7 1 质粒d n a 的小规模提取 参照分子生物学实验指南方法进行。 ( i ) 选取较大的菌落于含6 0 p g m 1a m p 的l b 中，3 7 。c 、1 8 0 r p m 培养过夜， 提取质粒。 ( 2 ) 取1 s m l 培养的菌液于e p 管中，1 2 ，0 0 0 r p m 离心2 r a i n ，弃上清液。 1 7 四川大学硕士学位论文 ( 3 ) 加入o 5 m ls t e 溶液重悬菌体，1 2 ，0 0 0 r p m 离心2 m i n , 弃上清。 ( 4 ) 加入0 2 m l 溶液l 充分混合加入0 3 m l 溶液轻柔混匀，室温放置 5 m i n 后，加入0 2 5 m i 溶液，轻柔混匀后冰浴1 0 m i n ( 5 ) 1 2 ，0 0 0 r p m 离心1 0 m i n 。将上清液转至新e p 管，加入o 7 倍体积的异 丙醇，颠倒混匀，冰浴静置1 0 m i n 。 ( 6 ) 1 2 ，0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ，弃上清液。 ( 7 ) 7 0 的乙醇洗两次，干燥沉淀，溶于5 0 i t ld d h 2 0 中 s t e ：t f i s c l ( p h 8 0 ) n a c l e d t a ( p h $ 们 溶液i ：葡萄糖 e d t a ( p h 8 o ) i r i s c 10 h 8 o ) 溶液1 1 ：n a o h s d s 用前配制。 1 0m m o i l 1 0i b i l l o l l l m o l 几 5 0 m m 0 1 l 1 0 m m o i l 2 5 m m o i l 0 2 m o f l ( 1 0 m o f l 贮存液) i 、 溶液：5 m o f lk a c 6 0 m l 冰乙酸 1 1 5 m l 加蒸馏水定容至1 0 0 m l ，所得溶液含3 m o l lk + 、5 m o l l a c 一。 2 2 7 2 重组质柱的筛选 提取的质粒进行o 7 琼脂糖凝胶电泳，5 v c m 电泳l 小时后，溴乙锭 染色，选较空载大的质粒迸行彪棚r 、e c o r i 酶切，确定酶切片段的大小， 并进一步用质粒p c r 验证。 四川大学硕士学位论文 2 2 8 重组质粒中插入片段的序列测定及结果分析 确定重组质粒中的插入片段的大小同目的片段大小一样以后，保存该重 组子菌种，取其中一管送北京三博远志生物测序测序结果用d n a t o o l 5 1 进行分析。 3 结果 3 1p c r 扩增产物的鉴定 使用p 1 、p 2 、p 3 、p 4 、p 5 及p 6 六条引物分别互为模板互为引物扩增， 通过p c r 反应获得的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，分别在1 2 7 、1 7 8 、2 2 8 、 2 8 8 、3 4 9 b p 处呈现一条与预期产物相对分子质量大小相符的d n a 条带。与 编码牛奶溶菌酶模板序列相比，在其c 端引入b a m h i 的酶切位点，n 端引 入b g l i i 和e c o r i 酶切位点，并在酶切位点之前添加保护性碱基。去除了部 分非a 螺旋。b 折叠的序列，保留其两个活性部位，并在序列中间引入编码 s e r - g l y - g l y 柔性连接肽的序列( 结果见图2 ) 。 图2b l y 的p c r 扩增电泳图谱( 2 o 琼脂糖凝胶) f i g2e l e c t r o p h o r e s i so fp c rp r o d u c t so fc d n ao fb l y ( 2 0 9 6a g a r o s eg e l ) 1 9 四川大学硕士学位论文 3 2 重组原核表达质粒的构建 将p g e x 4 t - 1 进行b a m h ，e c o r i 酶切去磷酸化后，同经b a m h i ，e c o r i 酶切的b l y 片段在1 4d n a 连接酶作用下进行连接反应。连接产物转化 d h 5 c x 感受态细胞，抽提转化子质粒，进行酶切和p c r 鉴定，得到含b l y