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文档简介

实验1,颊粘膜上皮细胞基因组DNA的抽提及ACE基因多态性分析,1,一、实验目的,掌握从微量来源的组织细胞中抽提基因组DNA掌握PCR技术原理了解基因多态性分析的方法。,2,二、原理,基因组DNA抽提碱裂解法抽提基因组DNA（本实验）用蛋白酶K和苯酚提取大分子DNA裂解-蛋白酶K-沉淀法快速提取DNAACE基因多态性分析PCR方法分析基因多态性,3,真核生物基因组中非编码序列多于编码序列,基因组,编码序列,非编码序列,调控序列,重复序列,高重复序列（串联排列，大卫星、小卫星、微卫星）,中重复序列（散在分布；部分编码；Alu家族）,低重复序列或单拷贝,4,Alu家族重复单位：300bp左右；130+31+130bp具Alu酶切位点30-50万次功能：基因调控Alu元件的插入、删除和重组与许多先天性遗传疾病和癌症相关,5,ACE基因多态性分析(血管紧张素转换酶,Angiotesinconvertingenzyme,ACE),基因诊断：利用现代分子生物学和分子遗传学的方法，从DNA、RNA水平检测基因的存在、结构异常和表达状态，从而对疾病做出诊断的方法。基因多态性：指在一随机婚配的群体中，染色体同一基因座位点上有两种或两种以上的基因型，它可决定人体对疾病的易感性、临床表现多样性和对药物治疗反应的差异性。,6,理论基础ACE基因第16内含子存在一段长度为287bp（Alu序列）的插入/缺失（I/D）多态性片段，I/D多态性与血液ACE水平有明确关系，DD型ACE水平最高，ID次之，II最低。左室肥大患者中DD型频率明显增高。实验原理以DNA为模板，ACE基因特异的引物序列位于287bp插入/缺失片段的两侧进行PCR扩增，故II型扩增片段长度约为490bp，DD型扩增片段长度约为190bp，ID型扩增片段为个，分别为190bp和490bp。根据PCR扩增片段的大小可进行多态性分析。,7,插入片段,插入型,缺失型,8,操作步骤,基因组DNA抽提PCR反应琼脂糖凝胶电泳检测,9,1.基因组DNA抽提,溶液10ml漱口20秒收集漱口水；3000g5minRT，弃上清；溶液250ul重悬沉淀；3000g1min，弃上清；溶液250ul重悬沉淀，振荡10秒；（变性）转至0.5ml离心管，995min；加溶液IV50ul振荡5秒；（中和）3000g1min，上清转移至新0.5ml离心管，取5ul用于PCR.,10,2.PCR反应,取消毒的0.5ml离心管，加入下列成分：10PCRBufferdNTP(2.5mMeach)mix:10lTaqDNApolymeraseDNA模板5l引物混合物(10Meach)2lddH2O3l总体系20l扩增程序为：94变性30s，55复性30s，72延伸40s，共反应35个循环。,11,琼脂糖电泳检测,制备1琼脂糖凝
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