（应用化学专业论文）大豆异黄酮提取分离技术及检测方法研究.pdf

大豆异黄酮提取分离技术及检测方法研究应用化学专业研究生潘廖明指导教师姚开大豆异黄酮具有抗氧化、抗癌、类雌激素及抗雌激素、预防心血管疾病、改善妇女更年期综合症等多种生物活性和药理活性。而且其不同单体组分的活性不同，在保健食品和医药等领域具有极大的应用价值。论文针对目前大豆异黄酮浸提得率较低的缺陷，比较了不同方法浸提大豆异黄酮的效果。正交试验结采表明。采用7 0 乙醇、料液比为2 ：6 、于5 0 条件下浸提5 h ，大豆异黄酮得率为4 0 7 r a g g ；采用5 0 7 , 醇、料液比为l ：8 、7 0 。c 、超声( 2 5 k h z ，1 6 0 w ) 浸提l h ，大豆异黄酮得率为4 2 3m g g ，较之第一种方法提高了3 9 3 ；采用5 0 乙醇、料液比为l ：8 、7 0 、超声( 2 5 k h z ，1 6 0 w ) 加搅拌( 3 0 0r r a i n ) 浸提1 h ，大豆异黄酮得率为4 3 6 m g g ，较之前两种方法分别提高了7 1 3 和3 0 7 。三种浸提方法对大豆异黄酮的抗氧化活性均无显著的影响。论文研究了大豆异黄酮的不同纯化方法。结果显示，等体积的乙酸乙酯于2 5 。c 条件下，经三次萃取可使大豆异黄酮含量由2 7 4 提高到3 1 6 1 ，收率为3 1 1 ；采用l s a 8 型大孔吸附树脂、以7 0 乙醇溶液洗脱、流速为1 0 b 、仇、于2 5 条件下洗脱，可使大豆异黄酮含量由1 1 9 提高到5 7o ：当原液浓度为2 00 m g m l 、溶液温度为4 0 c 、离心( 6 x 1 0 3 r r a i n ) 4 0 r a i n ，可使大豆异黄酮含量由原来的4 0 9 提高到7 12 ，收率为3 2 3 。研究结果表明，不同含量的大豆异黄酮制品需采用不同的纯化方法，论文比较了三种不同柱层析法对大豆异黄酮主要单体分离效果的影响。结果显示，采用3 0 0 - 4 0 0 目硅胶、洗脱体系为氯仿一甲醇( 5 ：1 ，v v ) 、流速为10 b v h ，可以使染料木苷、大豆苷、染料木黄酮和大豆苷元四种主要单体组分得到分离；采用聚酰胺柱层析法，流速为10 b w h ，用2 0 q 3 醇作为洗脱液可以分离出以大豆苷为主要成分的大豆异黄酮( 含量达9 0 3 ) ，再用4 0 甲醇洗脱可以分离出以染料木苷为主要成分的大豆异黄酮( 含量达9 2 o ) ：采用l h 2 0 葡聚糖凝胶柱，以9 0 甲醇作为洗脱剂、流速为20 b w h ，可以将染料木苷和大豆苷分离出来，其含量分别达到9 57 和9 51 。论文系统研究了大豆异黄酮的定性和定量检测方法。特征显色反应、荧光反应、双向纸层析法和薄层层析法均可鉴定大豆异黄酮及其不同单体组分。紫外全波长扫描结果显示，染料木苷、大豆苷和染料木黄酮的最大吸收为2 6 0 n m左右，大豆苷元为2 4 b n m 左右；加入移动试剂后，可以明显区分出该四种单体组分。薄层层析洗脱法、紫外分光光度法和高效液相色谱法均可用于检测大豆异黄酮及其主要单体组分的含量。其中，高效液相色谱法检测大豆异黄酮中的染料木苷、大豆苷、染料木黄酮及大豆苷元含量的准确度、精密度和灵敏度最高。论文根据大豆异黄酮的物理和化学特性，比较了不同方法对大豆异黄酮的提取效果，确定了含量不同的大豆异黄酮制品的纯化途径，探索了大豆异黄酮不同单体组分的分离技术，建立了大豆异黄酮及其主要单体组分的定性和定量检测方法，阐述了大豆异黄酮分子结构与其功能的关系。研究结果为大豆异黄酮的合理有效利用提供了有价值的参考依据，具有定的理论意义和较大的实际应用价值。关键词：大豆异黄酮提取纯化分离检测e x t r a c t i o n ，p u r i f i c a t i o n ，s e p a r a t i o na n dd e t e r m i n a t i o no fs o y b e a ni s o f l a v o n em a j o ra p p l i e dc h e m i s t r yp o s t g r a d u a t ep a nl i a o m i n gt u t o ry a ok a ia sam i x t u r eo fv a r i o u sc o m p o n e n t s ，s o y b e a ni s o f l a v o n eh a sb e e np r o v e nt op o s s e sv a r i o u sb i o l o g i c a la n dp h a r m a c o l o g i c a la c t i v i t i e ss u c ha sa n t i o x i d a t i o n ，a n t i c a n c e r , e s t r o g e n o i da n da n t i e s t r o g e n ，p r e v e n t i o no fc a r d i o v a s c u l a rd i s e a s e sa n dr e l i e f o f m e n o p a u s a ls y n d r o m e h o w e v e r , e a c hc o m p o n e n ts h o w sd i f f e r e n c e si nt h ea b o v ea c t i v i t i e sb e c a u s eo ft h e s e ，s o y b e a ni s o f l a v o n ec a nb eu s e di nf i e l d so ff u n c t i o n a lf o o da n dm e d i c i n ei nt h i st h e s i s ，f o u ra s p e c t so fr e s e a r c hi ns o y b e a ni s o f l a v o n ew e r ed o n ef i r s t ，d i f f e r e n tm e t h o d st oe x t r a c ts o y b e a ni s o f l a v o n ew e r ec o m p a r e d t h er e s u l t so fo r t h o g o n a le x p e r i m e n ts h o w e dt h a tt h ey i e l do fs o y b c a ni s o f l a v o n ew a s40 7 m g gw h e nt h ed e f a t t e ds o yf l a k e sw e r es o a k e di n7 0 e t h a n o l6t i m e sa sm u c ha st h ew e i g h to fr a wm a t e r i a lf o r5h o u r sa t5 0 c ，a n dt h a tt h ey i e l d sw e r e4 2 3 m g ga n d43 6 m g gw h e nt h ed e f a t t e ds o yf l a k e sw e r es o a k e di n5 0 e t h a n o l8t i m e sa sm u c ha st h ew e i g h to fr a wm a t e r i a lf o r1h o u ra t7 0 cu n d e ru l t r a s o n i cc o n d i t i o n s( 2 5 k h z ，16 0 w ) w i t h o u ta n dw i t hs t i r r i n ga t3 0 0 r m i n ，r e s p e c t i v e l y a n dt h r e em e t h o d sh a v en os i g n i f i c a n te f f e c t so na n t i o x i d a t i v ea c t i v i t yo fs o y b e a ni s o f l a v o n e s e c o n d ，t h r e em e t h o d st op u f f r ys o y b e a ni s o f a v o n ew e r es t u d i e d t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ec o n t e n t so fs o y b e a ni s o f l a v o n ei np u r i f i e dp r o d u c t si n c r e a s e df r o m2 7 4 t o316 f r o m119 t o5 7 0 a n df r o m4 0 9 t o7 1 2 b ye t h y la c e t a t ee x t r a c t i o na t2 5 c ，a d s o r p t i o no nm a c r o p o r o u sr e s i nl s a - 8e l u t e dw i t h7 0 e t h a n o la t10 b v ha n dc e n t r i f u g a t i o na t2 x1 0 3r m i nf o r3 0r a i na t4 0 c ，r e s p e c t i v e l yt h ey i e l d so f s o y b e a ni s o f l a v o n ew e r e31 1 a n d3 2 3 b ye x t r a c t i o na n dc e n t r i f u g a t i o n ，r e s p e c t i v e l y t h i r d ，t h r e ec o l u m nc h r o m a t o g r a p h i e st os e p a r a t et h em a i nm o n o m e r so fs o y b e a ni s o f l a v o n ew e r ec o m p a r e dt h er e s u l t ss h o w e dt h a tg e n i s t i n ，d a l d z i n ，g e n i s t e i na n dd a i d z e i nc o u l db es e p a r a t e db ye l u t i o no fs i l i c ag e l ( 3 0 0 4 0 0m e s h )c o l u m nw i t hc h l o r o f o r m m e t h a n o l ( 5 ：1 ，v v ) a t10 b v h ，a n dt h a t9 03 d a i d z i na n d9 20 g e n i s t i nw e r eo b t a i n e db yg r a d i e n te l u t i o no fp o l y a m i d ec o l u m nw i t h2 0 m e t h a n o la n d4 0 m e t h a n o la t1o b w h a n d9 57 g e n i s t i na n d9 5l d a i d z i nb ye l u t i o no fs e p h a d e xl h 2 0g e lc o l u m nw i t h9 5 m e t h a n o la t2 o b v h f o u r t h ，as y s t e m i cs t u d yo nq u a l i t a t i v ea n dq u a n t i t a t i v ea n a l y s i so fs o y b e a ni s o f l a v o n ew a sc a r r i e do u ts o y b e a ni s o f l a v o n ea n di t sm o n o m e r sc a nb eq u a l i t a t i v e l yd e t e c t e db yc o l o rr e a c t i o n s ，f l u o r e s c e n c er e a c t i o n s ，t w od i m e n s i o n a lp a p e ra n dt h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h i e sg e n i s t i n ，d a i d z i na n dg e n i s t e i na l lh a v em a x i m a la b s o r p t i o np e a ka ta b o u t2 6 0 n mw h i l ed a i d z e i na ta b o u t2 4 8 n mb yu l t r a v i o l e ts c a n ，a n dt h e s ec o m p o n e n t sc a nb ee v i d e n t l yi d e n t i f i e db ya d d i n gm o v i n gr e a g e n t st h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h y , u l t r a v i o l e ts p e c t r o p h o t o m e t r ya n dh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) c a nq u a n t i t a t i v e l yd e t e r m i n es o y b e a ni s o f l a v o n ea n di t sm o n o m e r s i nt h et h r e em e t h o d s ，i - i p l ch a st h eh i g h e s tp r e c i s i o n ，a c c u r a c ya n ds e n s i t i v i t yf o rq u a n t i t a t i v ed e t e r m i n a t i o no fg e n i s t i n ，d a i d z i n ，g e n i s t e i na n dd a i d z e i n b a s e do nt h ep h y s i c a la n dc h e m i c a lp r o p e r t i e so fs o y b e a ni s o f l a v o n e ，s y s t e m i cs t u d i e sw e r ep e r f o r m e do nt h ee x t r a c t i o n ，p u r i f i c a t i o n ，s e p a r a t i o na n dd e t e r m i n a t i o n so fs o y b e a ni s o f l a v o n et h ee x t r a c t i o na n dp u r i f i c a t i o nc o n d i t i o n sf o rs o y b e a ni s o f l a v o n ew e r eo p t i m i z e d ，a n dt h es e p a r a t i o na n dq u a l i t a t i v ea n dq u a n t i t a t i v ed e t e r m i n a t i o nm e t h o d sf o rs o y b e a ni s o f l a v o n ea n di t sm o n o m e r sw e r ea l s oe s t a b l i s h e d t h er e s u l t sc a l ln o to n l yo f f e rr e f e r e n c e so nr a t i o n a la n de f f e c t i v eu t i l i z a t i o no fs o y b e a ni s o f l a v o n e ，b u ta l s oh a v ed e f i n i t et h e o r e t i c a la n dp r a c t i c a ls i g n i f i c a n c e sk e yw o r d s ：s o y b e a ni s o f l a v o n e ，e x t r a c t i o n ，p u r i f i c a t i o n ，s e p a r a t i o n ，d e t e r m i n a t i o n四川大学硕士学位论文第一部分前言1 1 大豆异黄酮的研究概况1 1 1 大豆异黄酮的结构大豆异黄酮主要来源于豆科植物的荚豆类，是其生长过程形成的次生代谢产物，属于黄酮类化合物中的异黄酮类成分l l 钏。黄酮类化合物的基本母核结构为2 一苯基色原酮，目前泛指两个苯环( a和b ) 通过三碳链相互连结而成的一系列化合物，如图1l 所示。图1 1 黄酮类化合物的母核结构依据c 环饱和程度及b 环的连接位置的不同，可将黄酮类化合物分成黄酮、黄酮醇、双氢黄酮、双氢黄酮醇、异黄酮等几大类，其中异黄酮的基本结构如图1 2 所示。图1 2 异黄酮类化合物的母核结构目前发现的大豆异黄酮共有1 2 种，分为游离型的苷元和结合型的糖苷两大类5 ，6 1 。其中苷元约占大豆异黄酮总量的2 3 ，包括染料木黄酮四川大学硕士学位论文( g e n i s t e i n ) 、大豆苷元( d a i d z e i n ) 和黄豆苷元( g l y c i t e i n ) 。糖苷约占总量的9 7 9 8 。主要以染料木苷( g e n i s t i n ) 、大豆苷( d a i d z i n ) 、6 - 0 丙二酰基染料木苷( 6 - 0 m a l o n y l g e n i s t i n ) 和6 - 0 丙二酰基大豆苷( 6 - 0 m a l o n y l d a i d z i n ) 形式存在。由于后两种糖苷在加热、光照等条件下易脱去丙二酰基而转变为普通糖苷 7 1 0 i ，因此目前研究的重点为染料木苷和大豆苷及其脱糖苷的染料木黄酮和大豆苷元。大豆异黄酮的结构如图1 3 所示。、吖、y 。h苷元c h 2 0 r 3o ha g l y c o n e ( 苷元)d a i d z e i n ( 大豆苷元)g e n i s t e i n ( 染料术黄酮)g l y c i t e i n ( 黄豆苷元)r 3g l u c o s i d e ( 糖苷)hd a i d z i n ( 大豆苷)hg c n i s t i n ( 染料木苷)hg l y c i t i n ( 黄豆苷)c o c 屿6 - o - a c e t y l d a i d z i n ( 6 l o - 乙酰基大豆昔)c o c h 36 ”- o - a e e t y l g e n i s t i n ( 6 - o - 乙酰基染料木苷)c o c h 36 - o - a c e t y l g l y c i t i n ( 6 “- o - 乙酰基黄豆苷)c o c h 2 c o o h6 “- o - m a l o n y l d a i d z i n ( 6 ”旬丙二酰基大豆苷)c o c h 2 c o o h6 - o - m a l o n y l g e n i s t i n ( 6 ”- o 丙二酰基染料木苷)c o c h 2 c o o h6 - 0 - m a l o n y l g l y c i t i n ( 6 i 0 丙二酰基黄豆苷)图1 3 大豆异黄酮的结构2七bbb如hh哪hh洲hh删hhh叫h&h州hhhh叫h号号，：雕。：，稚。，。，。，m他四川大学硕士学位论文1 1 2 大豆异黄酮的性质ll2l 物理性质( 1 )颜色与闽值由于大豆异黄酮的a 、b 、c 环共轭程度相对较小，故颜色较浅，一股为淡黄色或灰白色粉末，具有苦味、收敛性及干涩感觉，其不同单体组分的阈值见表1 1 n a 2 1 。表1 i 大豆异黄酮的阐值大豆异黄酮闽值( n r n o i l )g c m s t c l ng e n i s t i n6 - 0 一a c e t y l g e n i s t i n6 - 0 - m a l o n y l g e n i t i nd a i d z e i nd a i d z i n6 - 0 - a c e t 5 ，l d a i d z i n6 - 0 - m a l o n y l d a i d z i ng l y o i t e i ng l y c i t i n6 - 0 一a c e t y l g l y g i t i n6 - 0 - m a l o n y l g l y c i t i n( 2 )旋光性及荧光大豆异黄酮的苷元不具有旋光性，但由于糖苷中引入了葡萄糖基。因而具有旋光性。大豆异黄酮在紫外光下荧光不明显，但与某些金属离子形成络合物后荧光有所加强【1 3 i 。( 3 )溶解性大豆异黄酮的苷元极性较弱，一般难溶于水或不溶于水，可溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有机溶剂或稀碱液中。糖瞽易溶于甲醇、乙醇、吡啶、乙酸乙酯及稀碱液中，难溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚等溶剂，可溶于热水中。四川大学硕士学位论文( 4 )酸性大豆异黄酮分子中具有酚羟基，因而显弱酸性。由于染料木黄酮比大豆苷元多一个酚羟基，因此酸性更强。( 5 )紫外吸收特性黄酮类化合物典型的光谱图上一般有二个吸收带，2 4 0 2 8 5 n m ( 带i i ) 和3 0 0 5 0 0 n m ( 带i ) 。带i 与b 环肉桂酰系统的吸收有关，带i i 与a 环苯甲酰系统的吸收有关。由于大豆异黄酮的a 环与b 环几乎不共轭，因此其紫外光谱的共同特征为强的带i i 吸收，而带i 则以带i i 的肩峰或低强度吸收峰出现1 1 4 1 。l ，l2 2 化学性质( 1 )显色反应大豆异黄酮的颜色反应多与分子中的酚羟基及y 一吡喃酮环有关”“。1 )钠汞齐还原反应向含有大豆异黄酮乙醇液中加入钠汞齐试剂，放置4 h 后过滤，滤液用1 m o l l 的盐酸酸化，溶液显红色。2 )锆盐一枸橼酸显色加入2 - - 氯氧锆( z r o c l 2 ) 的甲醇溶液到样品的甲醇溶液中，染料木黄酮及染料木苷( 因有5 0 h ) 出现黄色，再加入2 枸橼酸的甲醇溶液，黄色减退，加水稀释后转为无色。3 )硫酸一茴香醛显色将大豆异黄酮溶液加入到硫酸一茴香醛溶液中，染料木苷显深褐色，大豆苷显深蓝色，染料木黄酮显桔黄色，大豆苷元不显色。4 )醋酸镁显色喷以1 的醋酸镁甲醇溶液，通过纸斑反应，大豆异黄酮呈褐色，且在紫外光下产生荧光。( 2 )降解反应丙二酰基大豆异黄酮在光照或加热条件下易脱羧转变为乙酰基大豆异黄酮，因其不稳定，容易继续脱乙酰基转变为大豆异黄酮糖苷。大豆异黄酮糖苷在酸、碱或酶的作用下，可脱糖基转变为大豆异黄酮的苷元。( 3 )还原性还原性是酚类化合物的共性之一。大豆异黄酮分子中的多个酚羟基可以作为氢供体，使其具有还原性。如染料木黄酮为5 ，7 ，4 - 三羟基异黄酮，其7 位羟基上的氧原子同时受到a 环大冗键的p - n 共轭效应和其对位吸电子基团的诱导效应，使得氧原子上的电子云向大7 c 键方向转移，对氢原子的吸引力相对减弱，因此该酚羟基上的氢原子易与氧原子脱离而形成氢离子，发挥其还原作用。4四川大学硕士学位论文1223 生物活性( 1 )抗氧化活性大豆异黄酮分子中酚羟基的存在使其具有抗氧化性。对大豆异黄酮抗氧化活性的研究最初主要集中在抑制油脂的过氧化方面，随着流行病学、动物体内及体外实验研究的不断深入，大豆异黄酮在清除活性氧自由基、诱导抗氧化酶活性和抑制动物过氧化损伤等方面也取得了较大的研究进展【1 6 。i 。大豆异黄酮抑制脂质的过氧化主要是通过阻断脂质过氧化的链式反应来实现的。脂质过氧化的链式反应一般经历三个阶段，即启动、扩展和自由基相互作用或与其它自由基清除剂反应后的终止阶段。体外实验表明。在脂质过氧化链式反应体系中，无论是在启动脂质过氧化反应前，还是启动后，加入大豆异黄酮均能显著抑制脂质过氧化物的生成。孙克杰等比较了大豆异黄酮不同组分对猪油的抗氧化性能【2 3 i ，其抗氧化能力为染料木黄酮 大豆苷元 大豆苷 染料木苷，见表1 2 。一般认为，过渡金属离子在油脂自动氧化过程中充当催化剂的角色，而抗氧化剂的作用途径之一就是可以通过络合金属离子，从而延长油脂的稳定状态。结构分析表明，大豆异黄酮a 环上的酚羟基和羰基具有络合金属离子的能力，所以不难看出，同以苷元形式存在的染料木黄酮和大豆苷元，由于前者比后者多出一个5 位酚羟基，故其抗油脂氧化能力提高约5 0 ，说明5 位酚羟基有较强的金属络合能力。将苷元和苷的抗油脂氧化能力进行比较，可以看出前者强于后者，即染料木黄酮 染料木苷，大豆苷元 大豆苷，这是由于其两者结构中7 位酚羟基的不同所致，即7 位酚羟基被糖苷化的糖苷较之7 位酚羟基处于游离状态苷元的抗氧化能力明显降低，表明7 位羟基也有较强的络合金属离子能力。但同为糖苷的染料木苷比大豆苷的抗氧化能力降低更多，说明连接的糖基不但破坏了7 位羟基的络合能力，同时也在空间上阻碍了5 位酚羟基络合能力的发挥。大豆异黄酮由于存在着广域的共轭体系，使整个分子的电子云分布离域，因而符合自由基清除剂的条件。大豆异黄酮( s i h 2 ) 对于脂质过氧化链式反应产生的自由基( r o o ) 清除机理为：四川大学硕士学位论文s i h 2 + r o o js i h + + r o o hs i h + + s i h + j s i h 2 + s is i h + + r 0 0 s i + r 0 0 h大豆异黄酮的不同组分对超氧阴离子自由基的清除能力不同，其顺序依次为染料木黄酮 大豆苷元 大豆苷 染料木苷，对自由基的清除率分别为4 66 、4 38 、2 37 和88 t 2 ”。比较染料木黄酮与大豆苷元，尽管前者比后者多一个5 位酚羟基，但其清除自由基能力并没有显著提高，说明5 位酚羟基并不能延长大豆异黄酮的共轭体系。酚羟基的糖苷化对大豆异黄酮清除自由基的活性也有一定的影响，7 位酚羟基糖瞢化的大豆异黄酮与其对应的苷元相比，其清除自由基的能力显著降低。由此可以认为，大豆异黄酮的7 位酚羟基在自由基清除过程中是起主要作用的。在影响大豆异黄酮清除自由基活性的因素中，酚羟基的糖苷化为其一，但并非唯一影响因素，同为糖苷化的大豆苷对自由基的清除率( 2 3 7 ) 远大于染料木苷( 8 8 ) 的清除率，就能很好地说明这一点1 2 “2 6 i 。因此，有关大豆异黄酮在清除自由基方面的构效关系还有待更进一步的深入研究。表1 2 大豆异黄酮对猪油抗氧化性的比较注：样品添加量为1 5 1 m o l 2 5 9 猪油保护系数为样品诱导时间空白诱导时问细胞内的阿霉素( a t ) r ) 经氧化还原循环产生超氧阴离子自由基、羟自由基和过氧化氢等，并降低血液和组织中的超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物6四川大学硕士学位论文酶的活性，提高体内的脂质过氧化物( l p o ) 的水平。大豆异黄酮提取物( s i e )对阿霉素引起的小鼠过氧化损伤有较强的抗氧化作用，可使脂质过氧化水平降低，而使血液和组织中的抗氧化酶活性提高【2 l ”j 。( 2 )调节心血管系统活性大豆异黄酮对心血管疾病的影响已引起人们的重视，其表现出来的降血脂、抗血栓形成、抗细胞粘附、抗溶血、抗生长因子活性、影响细胞内或细胞间信息传递、抑制c a 2 + 内流、类雌激素和抗雌激索活性等，揭示了大豆异黄酮抗心血管疾病的作用机理【2 “。临床上心血管疾病常伴随着高血脂和高胆固醇病症等。大量实验表明，大豆异黄酮具有降低血清低密度脂蛋白、甘油三脂和胆圃醇水平，升高高密度脂蛋白水平的作用。其可能的机制有多种假说，其一认为大豆异黄酮通过增强低密度脂蛋白的受体活性，来降低体内胆固醇的水平。也有研究发现，与酪蛋白组相比，喂饲大豆的家兔体内h m g c o a 还原酶活性显著增强，并可使肝脏细胞及单核细胞处理低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白的能力增强，喂饲大豆蛋白的猴的肝脏7 - c t 羟化酶及i - t m g - c o a 还原酶活性均增强i ”】。当动物服用含大豆异黄酮的大豆蛋白时，首先是甲状腺素水平的提高，之后才是血脂的下降，因此推测大豆异黄酮的降血脂作用是因为它的促甲状腺分泌作用。研究表明，染料木黄酮是一种潜在的抗血栓形成的活性化合物。由于染料木黄酮对酪蛋白激酶具有较强的抑制作用，而该酶又是细胞内各类生长因子的效应分子，因此染料木黄酮可以阻断某些生长因子的作用，如血小板衍生生长因子、成纤维生长因子等，从而抑制动脉粥样硬化斑块的形成。染料木黄酮还可通过干扰血小板和凝血酶的活性，来降低与动脉粥样硬化有关的血栓形成。在血管损伤部位，血栓的形成包括血小板及纤维蛋白的聚集。由于染料木黄酮可以体外抑制血栓恶烷a 2 及胶原蛋白诱导的血小板聚集、a d p 诱导的血小板活化聚集和血栓素诱导的血小板聚集，因而可以推论染料木黄酮可以减少血管破损部位血小板的堆积和聚集，拮抗动脉粥样硬化斑块的发展1 3 0 j 。由于在血栓形成过程中，活化的血小板会释放出血小板衍生生长因子，故染料木黄酮也可能对此生长因子发挥抑制效应。正常血管的管壁由内皮、平滑肌及表皮组成。血管内皮作为血管壁的屏障，使血流中的物质选择性地进入血管壁中，感受血流速度、压力等变化，并做出7四川大学硕士学位论文相应的反应，如血管的收缩与舒张、细胞的生长迁移与死亡、分泌或合成某些生理活性物质。一旦血管或血液出现异常，将会导致血管内皮的损伤，引起巨噬细胞、成纤维细胞、单核细胞等粘附或进入内皮，形成大量泡沫细胞，导致一系列细胞因子和炎症物质的非正常释放，引起内皮细胞和平滑肌细胞的增殖，导致动脉粥样硬化。研究表明，血管内皮细胞对染料木黄酮的作用敏感，5 9 m o l l 的染料木黄酮可以抑制牛脑毛细血管内皮细胞的增殖。在其生理浓度为1 0 4 l a m o l l 时，可以抑制绵羊内皮细胞由胰岛素诱导的内皮素合成和分泌增加，抑制e t - i m r n a 的表达和e t - 1 蛋白的分泌 3 1 1 。饲料中的大豆异黄酮可增加由乙酰胆碱刺激的扩张血管效应，因而大豆异黄酮具有保护血管正常功能的活性。在抗溶血活性中，大豆异黄酮首先是作为抗氧化剂，其次大豆异黄酮可以由其特殊的化学结构与细胞膜上的磷脂及蛋白质相互作用，增强其物理和化学性质的稳定性，并降低膜的渗透性。大豆异黄酮不同组分的抗溶血作用不同，其中大豆苷元、大豆苷、染料木黄酮和染料木苷的抑制率分别为5 0 o 、7 4 、3 25 和2 6 6 1 2 ”。可以看出，大豆苷元比染料木黄酮的抗溶血能力强，说明染料木黄酮5 位羟基的存在不会增强抗溶血效应。糖苷化后的异黄酮抗溶血性均呈降低趋势，说明糖基的存在会改变配基的空间结构，破坏了其与磷脂及蛋白质的相互作用，阻碍了抗溶血的进程。此外，不同浓度的大豆苷元抗溶血作用也不同，当样品浓度( o m o l m 1 ) 为5 0 、5 5 、6 0 、6 5 、7 0 时，对溶血的抑制率分别为4 4 3 、4 8 0 、5 2 o 、5 6 9 和6 0 4 ，即随着样品浓度的增加，抗溶血活性增大。动脉粥样硬化的斑块部位由于平滑肌细胞的异常增殖，会产生斑块的破裂和脂质的堆积，引起炎性物质的释放，巨噬细胞及单核细胞等免疫细胞就会释放多种免疫分子，如血细胞介素分子( i l 一2 、i l _ 4 ) 、粘附分子( v c a m l 、i c a m - 1 ) 及e 一选择素。而染料木黄酮可以抑制由也- 2 诱导在动脉粥样硬化发展过程中起重要作用的粘多糖合成；拮抗由i l _ 4 传导的内皮细胞v c a m l及e 一选择蛋白的增加；拮抗由i l l 刺激内皮细胞i c a m 一1 、v c a m - i 及其m r n a 的表达；抑制由i l - 6 诱导的淀粉蛋白的生成等1 3 3 i 。由此可以看出，大豆异黄酮具有免疫抑制及抗细胞粘附活性，预防心血管疾病的发生。g四川大学硕士学位论文与动脉粥样硬化有关的生长因子主要包括：血小板衍生生长因子( p d g f ) 、胰岛素样生长因子( i g f ) 、血管内皮生长因子( v e g f ) 、表皮生长因子( e g f ) 、转化生长因子d 和1 3 ( t g f 一伍、t g f 一1 3 ) 、酸性或碱性生长因子( a f g f 、b f g f ) 、肿瘤坏死因子( t n f ) 等。这些生长因子可以促使细胞迁移和增殖，诱导血栓素合成以及细胞粘连和巨噬细胞对脂质的吞噬1 35 ，”】。大豆异黄酮能够抑制生长因子的活性及其表达，抑制平滑肌细胞的异常增殖，从而抵抗动脉粥样硬化的形成。酪氨酸蛋白激酶作为多肽生长因子的受体，对正常细胞的生长和分化起着重要的调节作用。大豆异黄酮中的染料木黄酮对酪氨酸蛋白激酶具有较强的抑制作用，从而可以抑制由胰岛素诱导的a t i 受体上调反应；抑制由a t i i诱导的单核细胞趋化因子一1 ( m c p 一1 ) 的作用；抑制由氧化修饰的低密度脂蛋白( o x - l d l ) 和促分裂原5 - l d l 诱导的血小板衍生因子( p d g f ) 的表达；抑制由促分裂原5 一羟色胺( 5 一h t ) 刺激的平滑肌细胞( v s m c ) 的增殖等，从而显示出在病理条件下对细胞内及细胞间信息传递的影响，拮抗动脉粥样硬化的形成i 3 7 , 3 8 1 。血管平滑肌细胞上至少存在三种钙离子的通道：钙渗透、电压依赖性钙通道和受体操纵型钙通道。平滑肌细胞的钙离子内流增加，会使其内的钙超负荷，此是引起动脉粥样硬化的重要因素之一。因为细胞中过多的钙会使钙向细胞外转运消耗大量的a t p ，钙的超负荷也会引起线粒体结构和功能的损害而造成a t p 合成不足，从而导致平滑肌细胞变性，引发动脉粥样硬化。研究显示，染料木黄酮可以拮抗平滑肌细胞的钙离子内流和d n a 的合成，抑制电压控制的钙离子通道，减少5 羟色胺引起的平滑肌细胞收缩1 3 2 , 3 3 】。流行病学研究表明，停经后的妇女采用雌激素替代治疗后，冠脉事件减少了5 0 。雌激素能纠正动脉粥样硬化发生及发展过程中的各种生理生化紊乱，其中改善脂蛋白代谢、减少细胞外脂质沉积和恢复内皮功能最为明显，从而可延缓动脉粥样硬化的生成，并提高己存斑块的稳定性。大豆异黄酮的结构与雌激素类似。作为植物雌激素，大豆异黄酮既能替代雌激素与其受体结合发挥雌激素样作用，又能干扰雌激素与其受体结合发挥抗雌激素作用1 3 8 , 3 9 i 。采用正交设计试验研究大豆异黄酮与雌激素一起应用时，发现可以降低猴的动脉胆固醇四川大学硕士学位论文含量，表明雌激素替代疗法和饮食中的大豆异黄酮对心血管疾病的危险因素均具有良好的影响。采用冠脉造影检测受试动物对静脉注射乙酰胆碱的反应，发现饮食中的大豆异黄酮和雌激素一样，可以增加雌猴动脉粥样硬化血管对乙酰胆碱刺激引起的扩张效应。( 3 )抗癌活性流行病学调查、动物体内和体外实验研究表明，大豆异黄酮具有抗肿瘤和抗癌活性，对多种癌症如乳腺癌、子宫癌、卵巢癌、肝癌、胃癌、前列腺癌、结肠癌等均有抑制作用。大豆异黄酮的抗癌作用机理主要表现为：抗雌激素作用、对酪氨酸蛋白激酶( p t k ) 的抑制、对d n a 拓扑异构酶i i 的抑制、调节细胞周期及抑制癌细胞血管生成等1 4 5 1 。雌激素被认为是与多种癌症的发生有关，特别是乳腺癌和子宫癌。子宫癌对不断增加的雌激素接触尤其敏感，长期使用雌激素可使患子宫癌的危险增加1 0 2 0 倍。凡能增加雌激素作用累积时间和用量的因素，如初潮早、闭经晚等均可增加患乳腺癌的危险。大豆异黄酮具有抗雌激素作用，因而可预防这些癌症的发生。体内外各种分析均显示异黄酮是很弱的雌激素，其生物学效应仅相当于乙烯雌酚或雌二醇的1 l o l 1 0 。【4 “3 , 4 7 。多数学者认为，大豆异黄酮抗癌的机理在于，当异黄酮与雌激素同时作用于靶器官时，二者可竞争性地与雌激素受体( e r ) 结合，从而减轻雌激素的促细胞增殖作用，降低与雌激素有关的癌症发生率。酪氨酸蛋白激酶( p t k ) 的活性与表皮生长因子、胰岛素、胰岛素样生长因子i 、血小板衍生生长因子和单核巨噬细胞生长因子的细胞受体相关联。生长因子与其质膜受体的结合对细胞的生长和分化是必需的，一旦发生结合，这些受体就会启动一系列复杂的细胞质和细胞核事件，如蛋白质磷酸化、酶激活、第二信使产生以及核中间早期基因转录等。在非肿瘤细胞中，p t k 级联受到严格的调控，然而当细胞受损伤时会引起p t k 活性提高，并可能使正常细胞转化为失控肿瘤细胞。鉴于染料木黄酮是体外p t k 活性的专一抑制剂，因此染料木黄酮可能是通过抑制生长因子受体p t k 活性发挥其抗癌作用【6 1 1 。染料木黄酮体外抑制拓扑异构酶n 的活性，其i c 5 0 为1 l l m o l l ( 3 0 g m 1 )左右，当其浓度低至1 1 i p m o l l ( 30 u g m 1 ) 时对该酶仅有微弱抑制作用，但要对该酶产生完全抑制则需其浓度大于1 8 51 u m o l l ( 5 0 p # m 1 ) 1 6 0 1 。体外研究1 0四川大学硕士学位论文发现，染料木黄酮不是d n a 双链插入剂，它是通过稳定d n a 拓扑异构酶复合物而抑制酶活性。在肿瘤细胞中，这种复合物的稳定性可导致细胞内d n a双链或单链断裂，从两引起肿瘤细胞的生长抑制或死亡。此外，大豆异黄酮还可通过抑制d n a 拓扑异构酶i i 的活性，来干扰能诱发癌病毒m r n a r 合成，从而抑制和干扰癌细胞和病毒基因的表达和转录，以达到对癌细胞的抑制。研究表明，染料木黄酮对静止非分裂细胞不产生抑制作用，而特异地抑制增殖的血管内皮细胞。还可通过多种血管生成因子，如i g f 、b f g f 、t f 、u p a 、e g f 、t g f c t 、p d g f 等抑制血管生成的多个环节，达到对肿瘤血管生成的抑制。对血管生成抑制剂和细胞毒化疗药物联合应用的临床前动物肿瘤模型实验发现，通过c d 3l 或f v i i i 免疫组化染色分析，染料木黄酮可降低l e w i s肺癌中的瘤内血管数3 0 以上，而且与具有细胞毒作用的化疗药物联用时效果更佳，可加强环磷酰胺、阿霉素、5 - f u 等化疗药物对肿瘤的疗效【6 6 1 。( 4 )预防女性骨质疏松女性绝经后的骨质疏松症是指绝经后妇女由于卵巢功能衰退，雌激素水平下降，促发甲状旁腺功能亢进，降钙素分泌不足，从而导致骨吸收大于骨形成，出现低骨量和骨组织的显微结构退行性变化等特征，临床表现为骨脆性和骨折易感性增加的一种代谢性疾病。绝经后女性骨质疏松发病率可高达2 5 5 0 ，且随年龄增大而发病率增高，绝经2 0 年以上者可高达5 3 6 2 5 7 8 9 ，平均为5 5 7 6 。流行病学和临床资料表明，大豆异黄酮具有预防骨质疏松和改善妇女更年期综合症等作用1 6 o i 。大豆等制品可缓解妇女更年期后骨质疏松的可能机制是异黄酮等可通过影响降钙素的分泌抑制骨的再吸收【7 。”i 。降钙素可抑制破骨细胞的生成和活动，促进骨中钙盐沉积，抑制骨中钙的分解和释放，减少细胞膜对钙的通透性，对抗甲状旁腺的作用，使血钙浓度下降。异黄酮与雌激素合用能升高血浆降钙素水平，黄豆苷元则主要是抑制骨转化率。非类固醇的植物雌激素在骨重建上与传统的雌激素不同，最近研究证实，在骨上存在的e r - 1 3 可与植物雌激素配体特异结合，这也许对解释异黄酮对骨组织作用机制有所帮助。大豆异黄酮也可能不是激素的直接作用，而是通过生长因子或细胞因子在破骨细胞活性中发挥作用，也可能是通过染料木黄酮诱导细胞凋亡，或染料木黄酮影响的多种酪氨酸激酶介导的通路发挥作用。目前关于大豆异黄酮预防骨质疏松的作用机理四川大学硕士学位论文还不十分清楚，这有待于进一步的深入研究。( 5 )其它生物活性大豆异黄酮对其它疾病如糖尿病、肾病、秃头病等有一定防治作用”i 。此外，大豆异黄酮还具有一定的抗菌活性，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、普通变形杆菌、鼠伤寒沙门氏菌等引起食物中毒或腐败变质的微生物都具有较强的抑制作用【7 5 】。1 1 3 大豆异黄酮生物合成途径及代谢1 l31 生物合成途径合成大豆异黄酮的前体物质是苯丙氨酸和丙二酰辅酶a ，它们在苯丙氨酸裂解酶( p a l ) ，香豆酸辅酶a 连接酶( 4 c l ) ，苯基苯乙烯酮合成酶( c h s ) ，苯基苯乙烯酮异构酶( c h i ) ，异黄酮合成酶( i f s ) 等酶的催化作用下，经过羟基化，甲氧基化和烷基化过程形成不同的异黄酮i ”i ，如图14 所示。”即“n 。i图1 4 大豆异黄酮生物合成途径1 2四川大学硕士学位论文1 132 吸收与代谢大豆异黄酮苷元通过小肠直接吸收，可能是由于苷元的脂溶性和分子空间结构较小的缘故。大豆异黄酮的糖苷在结构上与大豆异黄酮的苷元相差一个葡萄糖基，故两者的吸收速度和程度不同。大豆异黄酮的吸收和代谢与人体肠道内的微生物密切相关，异黄酮的生物利用度与肠道菌群有关，分布于小肠下端的乳酸菌和双歧杆菌能分泌葡萄糖苷酶，有利于大豆异黄酮糖苷的水解和吸收。人体实验表明，大豆异黄酮在肠道内的吸收率为1 0 - - - 4 0 _ 7 1 经肠道吸收的大豆异黄酮组织分布具有一定的靶向性，主要在肝脏中代谢，经肾脏随尿排泄。血液和尿液分析结果表明，进入人体内的大豆异黄酮可能有不同的代谢途径。一般认为大豆苷元的最终代谢产物为雌马酚( e q u 0 1 ) 和去氧甲基安哥拉紫檀素( o - m e t h y l a n g o l e n s i n ) ，而染料木黄酮最终降解为4 一乙基苯酚。有研究表明，人体摄入大豆制品几个小时后，血浆的异黄酮浓度升高，血液中的异黄酮浓度与大豆食物中异黄酮浓度存在相关性【7 9