（有机化学专业论文）毛细管电泳在酶联免疫分析及天然产物有效成分检测中的应用.pdf

青岛科技人学硕十学文论文 毛细管电泳在酶联免疫分析及天然产物 有效成分检测中的应用 中文摘要 毛细管电泳技术白2 0 世纪6 0 年代发展起来之后，已逐渐成为分析分离检测 的重要手段，本文分五章来介绍毛细管电泳在酶联免疫分析及天然产物有效成分 检测中的应用。 第一章对毛细管电泳( c e ) 的基本原理、分离模式、检测技术等进行了介绍， 列举了毛细管技术的应用进展及前景展望；对毛细管电泳电化学检测进行了介绍。 详细介绍了毛细管电泳电化学免疫分析及在分析糖类物质中的应用。提出课题并 加以简略说明。 第二章在毛细管电泳一电化学柃测研究工作的基础上，应用o p d h 2 0 2 h r p i 日j 接测定h r p 含量的体系，提出了一系列装置改进的措施。用一种简单可靠的 联用检测接口，解决了以往铂微电极与毛细管对接耗时长、对接不准确等问题： 将样品池与缓冲溶液池装入自制的密闭有机玻璃仪器中，提高实验的i 时候性及抗 干扰能力。提高样品池高度，解决了样品池与底物之问的高度差的问题；使用自 制的聚乙烯醇涂层管，节约成本，提高检测效果。 第三章采用毛细管区带电泳电化学检测( c z e e d ) 方式分别检测并分离了 d 半乳糖、乳糖、蔗糖、葡萄糖、阿拉伯糖。要用循环伏安法确定五种糖标准物 的检测电位为+ o 7 v ；并分别考察了电泳缓冲液浓度、分离电压和进样时间对d 半乳糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖的电泳迁移行为的影响，最后确定制圆 盘电极为工作电极，工作电极电位为o 7 v ( v s 饱和甘汞电极) ，电泳介质为 0 1 m o l l n a o h ，分离电压为1 5 k v ，进样电压为1 5 k v ，进样u , j - f 日j 为1 0 s 。在此 条件下，五种糖能够较好的检测并分离。 第四章采用水提醇沉法提取纯化了当归及党参中的多糖，所提珥义的多糖干燥 后，用1m o l l o 硫酸在1 0 0 0 c 水浴中将其水解。随后，建立了快速测定当归及 党参多糖中单糖组成的高效毛细管电泳电化学方法。在第二章的优化条件下，分 别考察了混合样品中五种糖的迁移时间并测定了当归及党参多糖的单糖组分。当 归水解样品中检测到三种糖，通过标准加入法及与五种糖标准混合样的电泳谱图 中的迁移日, - j f j 作比较，确定这三种单糖分别为乳糖、蔗糖、阿拉伯糖：党参水解 毛细管电泳在酶联免疫分析及天然产物有效成分检测中的应用 样品中检测到三种糖，通过标准加入法及与五种糖标准混合样的电泳谱图中的迁 移时间作比较，确定这三种单糖分别为乳糖、d 一半乳糖、蔗糖。建立了一种快 速检测中草药中糖组分含量的方法。 第五章建立了毛细管电泳电化学分离和测定蛇床子及其制剂中3 种香豆素 类活性组分的方法。系统考察了缓冲溶液中背景电解质p h 、表面活性剂浓度、 有机改性剂种类和浓度对分离的影响。实验结果表明：在缓冲液浓度为1 0m m o l l 一、缓冲液p h 为1 0 5 、s d s 浓度为2 0m m o l l 、甲醇浓度为1 0 时的优 化条件下，蛇床子及其制剂中3 种香豆素类活性组分得到基线分离，且方法具 有较好的重现性。 关键词：毛细管电泳电化学检测糖当归党参香豆素蛇床子 青岛科技人学研究生学位论文 a p p i li c a t l 0 no fc a p i l l a r ye l e t r o p h o r e sisi n e n z y m e l i n k e di m m u n o a s s a ya n dd e t e c t l 0 n 0 ft h ea c t i v ep r n n c i p l ei nn a t u r a lp r o d u c t s ab s t r a c t c a p i l l a r ye l e e t r o p h o r e s i st e c h n o l o g i e s ，d e v e l o p e di nt h ee a r l y6 0 so ft h e2 0 1 “ c e n t u r y ，a r eb e c o m i n gt h er e s e a r c h f o c u s e si nt h em o d e ma n a l y t i c a la n d s e p a r a t i o nf i e l d t h i st h e s i si ss u b d i v i d e di n t of i v ec h a p t e r s i nt h ec h a p t e ro n e ，t h ep r i n c i p l eo fc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ( c e ) ，s e p a r a t i o n m o d ea n dd e t e c t i o nm e t h o d sw e r ei n t r o d u c e db r i e f l y t h e nt h ea p p l i c a t i o n p r o g r e s s a n df u t u r e d e v e l o p m e n t o fc ew e r ed i s c u s s e d t h e c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i sc o u p l e dw i t he l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o nw a sb r i e f l yi n t r o d u c e d t h ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s e l e c t r o c h e m i c a li m m u n o a s s a ya n di t sa p p l i c a t i o ni n t h ed e t e c t i o no ft h ea c t i v ep r i n c i p l ei nn a t u r a lp r o d u c t sw e r ei n t r o d u c e di nd e t a i l f i n a l l y ，ar e s e a r c hp r o p o s a lw a sp r o p o s e df o rp r e s e n tt h e s i s i nt h ec h a p t e rt w o ，b a s e do nt h ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s e l e c t r o c h e m i c a l d e t e c t i o nt e c h n o l o g y , t h eo p d h 2 0 2 一h o r s e r a d i sh p e r o x i d a s e ( h r p ) e n z y m e - l i n k e d i m m u n o a s s a ys y s t e mw a su s e dt oi m p r o v et h es a t i a b il i t yo ft h ee q u i p m e n t a s e r i e so fm e a s u r e sw e r ea d o p t e dt oo p t i m i z et h ed e v i c e s t h ed i f f i c u l t i e ss u c ha s l o n gt i m ec o n s u m ea n di n a c c u r a t eb u t t j o i n tw h e nb u t t i n gp l a t i n u me l e c t r o d ea n d c a p i l l a r yw e r es o l v e db yu s eo fas i m p l eu n i t e dd e t e c t i o ni n t e r f a c e t h ew e a t h e r a b i l i t ya n di n t e r f e r e n c ei m m u n i t yw e r ei m p r o v e db ys e t t i n gt h es a m p l ec e l la n d b u f f e rc e l l i nap l e x i g l a s ss e a l e r t h eh e i g h td e f e n s eb e t w e e ns a m p l ec e l la n d s u b s t r a t ew a se l i m i n a t e db yr a i s i n gt h es a m p l ec e l l i nt h ec h a p t e rt h r e e ，c a p i l l a r yz o n ee l e c t r o p h o r e s i s - e l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o n ( c z e e d ) w a se m p l o y e df o rt h ea n a l y s i sa n ds e p a r a t i o no fd g a l a c t o s e ，l a c t o s e ， s u c r o s e ，g l u c o s ea n da r a bs u g a r t h ed e t e c t i o np o t e n t i a lo ff i v e s a c c h a r i d e s ( g l u c o s e ，d g a l a c t o s e ，l a c t o s e ，s u c r o s e ，a r a b i n o s e ) w a se x p e r i m e n t a l l yd e t e r m i n e d b yc y c l i cv o l t a m m e t r ya n dw a s0 7vt h ee f f e c to ft h eb u f i 、e rc o n c e n t r a t i o n ， i s o l a t i o nv o l t a g ea n di n j e c t i o nt i m eo nt h ee l e c t r o p h o r e t i cm i g r a t i o nb e h a v i o r s d g a l a c t o s e ，l a c t o s e ，g l u c o s e ，s u c r o s ea n da r a b i n o s ew e r es t u d i e d ，a n dt h ec o p p e r d i s ke l e c t r o d ea st h ew o r k i n ge l e c t r o d ew a su s e da sw o r k i n ge l e c t r o d e t h e c o n c e n t r a t i o no fe l e c t r o l y t ew a sd e t e r m i n a t e do nc o m p a r i n gt h em i g r a t i o nt i m eo f t h ef i v es a c c h a r i d e si nt h em i x e ds a m p l ea n d0 1m o l l n a o h t h eo p t i m i z e e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o nf o rf i v es u g a r sw e r el i s t e db e l o w ：w o r k i n ge l e c t r o d e p o t e n t i a li s0 7v ( 凇s a t u r a t e dc a l o m e le l e c t r o d e ) 15k vf o ri s o l a t i o nv o l t a g e ，15 k vf o ri n j e c t i o nv o l t a g e ，s a m p l i n gt i m ei s1 0s u n d e rt h e s ec o n d i t i o n s ，t h ef i v e s u g a r sc a nb ed e t e c t e de a s i l ya n d i s o l a t e d i nt h ec h a p t e rf o u r , t h ep o l y s a c c h a r i d eo fa n g e l i c aa n dc o d o n o p s i sw e r e e x t r a c t e da n dp u r i f i e db yw a t e re x t r a c t i n g a l c o h o lp r e c i p i t a t i o n a f t e rd r i e d ，t h e y w e r eh y d r o l y z e dw i t h0 1m o l l h 2 8 0 4 s u b s e q u e n t l y , am e t h o do fh p c e - e c w a sb u i l t u p f o r i n v e s t i g a t i n gr a p i d l yt h e m o n o s a c c h a r i d ec o m p o s i t i o no f a n g e l i c aa n dc o d o n o p s i s ac o p p e re l e c t r o d ew a s u s e da st h ew o r k i n ge l e c t r o d e w i t ht h ep o t e n t i a lo f + o 7v ( 坩s c e ) t h es o l u t i o no fo 1m o l l 叫n a o hw a s c h o s e na st h ee l e c t r o p h o r e s i sm e d i a t h es e p a r a t i o nv o l t a g ew a s15k v u n d e r t h o s ec o n d i t i o n s ，t h ef i v es a c c h a r i d e si nt h em i x e ds a m p l ea n dt h em o n o s a c c h r i d e o fa n g e l i c aa n dc o d o n o p s i sw e r ed e t e c t e d c o m p a r e dw i t ht h em i g r a t i o nt i m eo f f i v es t a n d a r ds a c c h a r i d e si nt h em i x e ds a m p l ew e r ed e t e c t e di na n g e l i c a , v i z 1 a c t o s e ，s u c r o s ea n da r a b i n o s e a n dt h r e e m o n o s a c c h r i d ew e r ed e t e c t e di n c o d o n o p s i sv i z 1 a c t o s e ，d g a l a c t o s ea n d s u c r o s e i nt h ec h a p t e rf i v e ，am i c e l l a r e l e c t r o k i n e t i cc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ( m e k c ) m e t h o dw a sd e v e l o p e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no ft h r e ep h a r m a c e u t i c a l l y i m p o r t a n tc o u m a r i n s ：o s t h o l e ( o s ) ，i m p e r a t o r i n ( i m ) a n di s o i m p e r a t o r i n ( i s ) i n c n i d i u m m o n n i e r i ( l ) c u s s o na n d i t sm e d i c i n a l p r e p a r a t i o n ( c a p s u l e o ps a n w u s h e n w e i ) ab u f f e rs o l u t i o n ( p h10 5 0 ) c o m p o s e do f10m 青岛科技人学研究生学位i 仑文 m 0 1 l s o d i u mb o r a t e 2 0mt o o l l 1s o d i u md o d e c y ls u l f a t e ( s d s ) a n d10 m e t h a n o lw a sf o u n dt ob et h eb e s ts u i t a b l ee l e c t r o l y t ef o rt h i ss e p a r a t i o n t h e t e m p e r a t u r ea n dt h ea p p l i e d v o l t a g ew e r e2 5 a n d2 5k v ，r e s p e c t i v e l y r e g r e s s i o ne q u a t i o n sr e v e a l e dl i n e a rr e l a t i o n s h i p ( c o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t s ：0 9 9 9 8 ， 0 9 9 9 4a n d0 9 9 8 9 ) b e t w e e nt h ep e a ka r e ao fe a c hc o m p o u n d ( o s ，i ma n di s ) a n di tsc o n c e n t r a t i o n t h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n so fm i g r a t i o nt i m e sa n d p e a ka r e a sw e r e1 8 6a n d3 8 2 w i t h i no n ed a y ，r e s p e c t i v e l y t h ee f f e c t so fp h v a l u e ，s u r f a c t a n t ( s d s ) c o n c e n t r a t i o na n do r g a n i cm o d i f i e r o nt h em i g r a t i o n b e h a v i o rw e r ea l s os t u d i e d b yt h i sw a y t h ec o n t e n t so fa c t i v ec o u m a r i n si nt h e e x t r a c t so ft h ec n i d iu m m o n n i e r i ，c u s s o na n di t sm e d i c i n a lp r e p a r a t i o nw e r e s u c c e s s f u l l yd e t e r m i n e dw i t h i n8r a i n k e yw o r d s ：c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s e l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o n s a c c h a r i d ea n g e l i c ac o d o n o p s i sc o u m a r i n s 毛细管屯泳在酶联免疫分析及天然产物有效成分检测中的应川 1 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致射中所罗列的内容以外，论文中 不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人己用于其他学位申请 的论文或成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了 明确的说明并表示了谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责f t 。 本人签名：日期：年月 闩 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解青岛科技大学有关保留、使用学位论文的规定，有 权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁 ；j ：，允许论文被查阅和借 阅。本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数掘库进行检索， 可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人离校后发表或 使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果h , 1 ，署名单位仍然为青岛科 技大学。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 本学位论文属于： 保密口，在年解密后适用于本声明。 不保密口。 ( 请存以上方框内打“妒) 本人签名： 导师签名： 日期： i ：l 期： 年j j h 年月h 青岛科技入学研究生学位论文 第一章绪论弟一早z 百v 匕 毛细管电泳技术( c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，c e ) 又称高效毛细管电泳( h p c e ) 或毛细管分离法( c e s m ) ，是近年来发展最快的分析方法之一，是一类以高压电 场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之问淌度和分配行为的 差异而实现分离的一类液相分离技术【j 】。除了具有效率更高、速度更快、样品和 试剂耗量更少、应用面广等优点外，还具有仪器结构简单的特点，只需高压直流 电源、进样装置、毛细管和检测器。由于c e 符合了以生物工程为代表的生命科 学各领域中对多肽、蛋白质( 包括酶，抗体) 、核苷酸乃至脱氧核糖核酸( d n a ) 的 分离分析要求，因此得到迅速发展。毛细管电泳是多年来发展最为迅速的分离分 析技术之一，相对于传统的电泳技术，毛细管的小孔径、高电阻、大比表面积、 抗对流等特性，使分析方法可在高电场和小电流条件下工作，实现高效、快速的 分离分析。毛细管电泳包含电泳和色谱双重分离效果，具有分离效率高( 理论塔 板数己达1 0 0 1 0 7 m 一) 、速度快( 一般2 0m i n 内即可完成一次电泳操作) 、样品用 量少( 仅需纳升级) 等特点。毛细管电泳具有的多种分离模式，使其在分析的各 个领域得到广泛的应用。如无机离子、糖类、氨基酸、药物、手性对映体的分离 分析，尤其在生物大分子如多肤、蛋白质及序列测定中，己成为卅i 可替代的重要 分析手段。是分析科学中继高效液相色谱之后的又一重要分析工具，它使分析科 学得以从微升水平进入纳升水平，并使细胞分析，乃至单分子分析成为可能【2 1 。 本章主要介绍毛细管电泳技术的方法和应用，毛细管电泳电化学检测技在免疫分 析中以及在天然药物中有效成分的检测及分离中的应用。 1 1 毛细管电泳技术的方法和应用 1 1 1 毛细管电泳的基本原理 毛细管电泳的基本原理是根据在电场作用下离子迁移的速度1 i 例而对组分 进行分离和分析，以两个电解槽和与之相连的内径为2 0 1 0 0u m 的毛细管作为分 离通道，毛细管电泳所用的石英毛细管柱，在p h 3 的情况下，其内表面带负电， 和缓冲液接触时形成双电层，在高压电场的作用下，双电层中带- f 电荷而向负极 方向移动形成电渗流。同时，在缓冲液中，带电粒子在电场的作用下，以不同的 速度向其所带电荷极性相反方向移动，形成电泳，电泳流速度即电泳淌度。在高 压电场的作用下，根据在缓冲液中各组分之问迁移速度和分配行为上的差异，带 正电荷的分子、中性分子和带负电荷的分子依次流出，带电粒子在毛细管缓冲液 毛细管电泳在酶联免疫分析及天然产物有效成分检测中的应用 中的迁移速度等于电泳淌度和电渗流的矢量和，各种粒子由于所带电荷多少、质 量、体积以及形状不同等因素引起迁移速度不同而实现分离；在毛细管靠近负极 的一端开一个视窗，可用各种检测器检测。 1 1 2 毛细管电泳的历史发展历程 毛细管电泳方法历史悠久，以毛细管等速电泳( c i t p ) 的发展为起点可以追 溯到1 9 6 0 年代甚至更远1 3j ，多数学者以1 9 6 0 年代中期毛细管区带电泳( c z e ) 为此技术的起点。 毛细管区带电泳( c z e ) 是瑞典科学家h i e r t e n 于1 9 6 7 年首先提出的。他用涂 甲基纤维素的3m m l d ( 内径) 石英管进行电泳分离。1 9 7 0 年e v e r a e r t s 等报道其 在毛细管等速电泳( c i t p ) 得c z e 结果，但效率不高。1 9 7 9 年m i k k e r s 等人在内 径为2 0 0 “mi d 的聚四氟乙烯管中进行研究，获得了小于1 0 岬板高的空前高 效率，这是c e 发展的第一次飞跃。1 9 8 1 年，j o r g e n s o n 和l u k a c s 使用直径是7 5 i t m 的熔融石英毛细管对荧光标识氨基酸化合物进行c e 测定，获得理论塔板数高 达4 0 力_ 的分离性能，并且深入地阐明了c e 的一些基本性能和分离的理论依据。 这是c e 发展史上的又一个罩程碑。1 9 8 3 年后，h e r t e n 先后提出了毛细管凝胶电 泳和毛细管等电聚焦法，分离效率大大提高。1 9 8 4 年，t e r a b e 等人提出了胶束电 动毛细管色谱法( m e k c ) ，使许多电中性化合物的分离成为可能，大大拓宽了c e 的应用范围。1 9 8 6 年，l a u e r 报道其在蛋白质c z e 中获得了的高效率。白此以 后，c e 的研究成为分析化学领域的热门课题，研究论文数直线上升，应用范围 也迅速扩大。近年来，毛细管电色谱和芯片毛细管电泳技术有较大的发展。 毛细管电泳具有高效( 理论塔板数大于1 0 5 ) 、快速( 分析时间不超过4 0 m i n ) 、微量( 进样体积一般为n l 级) 、灵敏度高、实验经济、应用面广、自动 化程度高等特点。目前在化学、生命科学和药学领域均有广泛的应用。 1 - 1 3 毛细管电泳的分离模式 毛绌管电泳按分离介质和分离原理不同，包括多科- 操作模式。各种模式的分 离方式是不同的。如今，毛细管电泳不再仅仅局限于分离荷电的大分子粒子，也 适合分离阳j 曹子、阴离子以及中性分予。 常见的毛细管电泳的分离模式有| 4 j ： ( 1 ) 毛细管区带电泳( c z e ) 毛细管区带电泳( c z e ) 亦称毛细管自由溶液区带电泳，是毛细管电泳中最基 本也是应用最广的一种操作模式，通常把它看成其它各种操作模式的母体。毛细 管和电解液池充以相同的缓冲液。样品用电迁移或重力进样，施加电压，样品离 青岛科技大学研究生学位论文 子以不同的淌度迁移，形成区带从而得到分离。c z e 中，遇到的操作变量主要是 电压、缓冲液的种类、浓度、p h 、添加剂、进样电压。通过这些因素的有效控制， 同时合理选择柱温、分离时间、柱尺寸、进样体积等均会改善分离并提高柱效。 ( 2 ) 胶束电动毛细管色谱( m e c c ) 胶束电动毛细管色谱( m i c e l l a re l e c t r o k i n e t i cc a p i l l a r yc h r o m a t o g r a p h y , m e c c ) 是以胶束为准固定相的一种电动色谱。在m e c c 中存在两相，一相是以胶束形式 存在的准固定相，另一相是作为载体的液相( 即流动相) 。试样中的组分在m e c c 中的分离，从本质上来说，是由它们的分子和胶束相及流动相之间的相互作用的 差异造成的，尽管对不同的胶束相互作用的形式不同，但是它们所反映的本质是 一样的。溶质在毛细管内受到两种作用力，一是胶束对它的作用力，_ 二是流动相 的溶解力，即溶质处于两个作用力场的平衡之中，作用力强，溶解力差时，溶质 有较大的保留，反之，则较早流出。m e c c 除了可以分析离子化合物外，对中性 化合物也可以分离分析，而c z e 做不到这一点。m e c c 将电泳技术与色谱技术 结合，把电泳分离的对象从离子化合物扩展到中性化合物，是m e c c 的一大创举。 m e c c 比较容易通过改变流动相和胶束相组成来改善分离的选择性，非常适合于 手性化合物的分离。一般形成胶束的表面活性剂有四类，即阴离子、阳离子、两 性离子和非离子表面活性剂。也有人将环糊精、胆汁盐等其它旋光异构体选择剂 及有机溶剂作为添加剂引入m e c c ，从而扩大了其研究领域。m e c c 是目前研究 较多、应用较广泛的一种毛细管电泳模式。 ( 3 ) 毛细管凝胶电泳( c g e ) 毛细管凝胶电泳( c a p i l l a r yg e le l e c t r o p h o l e s i s c g f ) 是毛细管区带电泳中派生 出的一种用凝胶物质作支持物进行电泳的方式，利用凝胶物质的多孔性和分子筛 的作用使通过凝胶的物质按照分子的尺寸大小逐一分离，是分离度极高的一种电 泳分离技术。理论上说，凝胶是毛细管电泳的理想介质，它粘度大，抗对流，能 减小溶质的扩散，同时也能阻挡毛细管壁对溶质的吸附，因此能限制谱带的展宽， 所得峰尖锐，柱效高。c g e 对于大分子物质如蛋白质、多肽、寡聚核苷酸的分离 分析，特别是d n a 序列分析显示了速度和效率方面的优越性。它的主要缺点是 制各较困难，寿命较短。 ( 4 ) 毛细管等速电泳( c i t p ) c i t p 是基于离子淌度的差异进行带电离子的分离，属于不连续介质电泳。它 采用两种不同的缓冲液系统，一种是前导电介质，充满整个毛细管杜，另一种称 尾随电介质，青1 = + 。端的电泳槽中，前者的淌度高于任何样品组分，后者吡0 低j ? 任何样品组分。当加上电压后电位梯度的扩展使所有离了最终以同一速度泳动， 样品带在给定的p h 下按其淌度和电离度大小依次连续迁移，得到互相连接而又 毛细管电泳在酶联免疫分析及天然产物有效成分检测中的戍川 不重叠的区带。带长可用于定量测定，c i t p 可在无支持电解质的条件下进行分离， 并可通过控制p h 值，改变任意两种离子间的分辨率，可观察到指纹区物质的微 小变化。c i t p 不能对阴离子和阳离子进行同时分离，且由于采用不连续缓冲体系， 空i 副分辨率较差。 ( 5 ) 毛细管等电聚焦电泳( c i e f ) 两性电介质在分离介质中的迁移造成p h 梯度，由此可以使蛋白质根据它们 不同的等电点进行分离，具有一定等电点的蛋白质顺着这一梯度迁移到相当于它 们的等电点的那个位置，并在该点停下，由此产生一种非常窄的聚集区带，并使 不同等电点的蛋白聚集在不同的位置上，这就是等电聚焦分离的基本原理。在毛 细管内实现等电聚焦过程，必须解决两个问题，一是减小电渗流，可将亲水聚合 物键合到毛细管壁表面而达到此目的，二是找到一种使区带迁移的途径，可加盐、 改变缓冲液的p h 值及利用压差等手段。与此同时也要防止蛋白质的吸附。等电 聚焦分离有很高的分辨率，一般可以分离等电点差异小于0 0 1p h 单位的两种蛋 白。 ( 6 ) 毛细管电色谱( c e c ) c e c 是将毛细管填充固定相或内壁涂上固定相，物质的运动受电渗、电迁移 及在移动相和固定相的分配影响。它具有高柱效及高选择性的特点。c e c 类型主 要有填充柱电色谱法、丌管柱毛细管电色谱法。c e c 是一种新的高效分离技术， 其仪器设备及实验技术方面有较大突破。应用范围也逐渐扩大。在免疫学研究， 药物分析，富勒烯化学等领域均有广泛应用。 ( 7 ) 亲和毛细管电泳( a c e ) 亲和毛细管电泳是在c z e 缓冲液或管内加入亲合作用试剂的一种电泳分支。 在研究生物分子之间的特异性相互作用及提高分离选择性方面有着广泛的应用。 蛋白、核酸等生物大分子能够与配体通过静电疏水、氢键等作用结合在一起，具 有特异性高，可逆等特点。a c e 在蛋白、多肽、核酸片段等生物样品的分离分析 中具有独特的优越性和应用潜力。目前，a c e 的研究主要集中在两个方面：一是 研究受体与配体之间的特异性相互作用：二是利用这种特异性相互作用提高毛细 管电泳分离的选择性。 ( 8 ) 毛细管阵列电泳 传统的聚丙烯酰胺凝胶板电泳的一大优点是可以同时进行多道分析，而一般 的c e 方式却很难做到这一点。有人利用一个共焦激光荧光扫描检测系统解决了 由多根毛细管组成的毛细管阵列的同时检测问题。他们将这一技术称为毛细管阵 列电泳。利用这一技术，在9 9 根毛细管组成的阵列中进行了d n a 序列分析的尝 试，结果令人鼓舞。 青岛科技大学研究生学位论文 ( 9 ) 芯片毛细管电泳 将反应、分离、检测集中在一个芯片上进行的毛细管电泳。 1 1 4 毛细管电泳的进样技术 毛细管分离通道十分细小，所需的样品区带不过数纳升，进样量极少，所以 象色谱那样的进样方式就会造成较大的死体积，会使分离效率严重下降。这就不 仅要求进样准确性高、重现性好，而且所进入的样品组成要与原样品组分有一致 性。避免样品失真有一种简单的办法可以实现无死体积的进样，即令毛细管直接 与样品接触，然后由重力、电场力或其它驱动力使样品流入管中。进样量可以通 过控制驱动力大小或时间的长短来控制。在保证检测器具有相当灵敏度的前提 下，应尽可能减少进样体积，以提高分离效率。 进样技术也是毛细管电泳技术研究的重要方面。目6 仃的进样技术主要有电动 进样、压差进样、电分流进样、进样阀进样。其中最常用的是电动进样和压差进 样。 电动进样也称电迁移进样，其操作简单：以充满缓冲液的毛细管高压端作为 进样端，在进样端以样品槽代替缓冲液，施加进样压力，同时记时，进样结束换 回缓冲液。采用自动进样代替人工进样，进样精度比人工进样提高3 倍左右，另 外还发现电动进样不会影响分离效率。电动进样对毛细管的填充介质没有特别的 要求，属于普适性方法，但是对离子组分存在进样歧视力现象。 压差进样分为压力进样、重力进样、真空进样。其重要的优点为消除了电 动进样时产生的不同组分进样量不同的特点。重力进样是通过毛细管两端的高多 差利用虹吸作用使样品进入毛细管的进样方法。与电动进样相比，压差进样的进 样量不受溶液组成和组分性质的影响，没有进样歧视，但是选择性差。扩散进样 是一种利用浓度差扩散原理的进样方式。将毛细管的一端插入样品溶液，样品分 子因管口界面存在浓度差而向管内扩散，扩散进样具有双相性：在样品分子进入 毛细管的同时，区带中的稀释液也向管外扩散。由此可以得到畸变较小的 j j 始区 带，能抑制稀释溶剂干扰，提高分离效率，同时又可避免进样歧视，提高定性分 析的可靠性。 1 1 5 毛细管电泳检测技术 毛绌管电泳以其高效、快速、进样量少的优势赢得了分析化学工作者的普遍 重视，但毛细管内径极细、进样体积为纳升级、组分区带超小体积的特性对检测 系统提出了很高的要求，因此检测系统成了毛绌管电泳技术的难点和薄弱环节。 目前己实现了多种检测器与毛细管电泳联用，涉及电化学检测器、质谱检测器、 毛细管电泳在酶联免疫分析及天然产物有效成分检测中的虑川 荧光检测器、紫外检测器、化学发光检测器、电致化学发光检测器等。现选择常 用的几种分述如下： 1 1 5 1 紫外检测器 当今，应用最普遍的尤其在商品化仪器中使用最多的是紫外可见吸收检测 器。该类结构简单、通用性较好、商品化仪器性能较高，其通用性好，这主要是 因为紫外是通用型的检测方式，而且由于是在柱检测，对组分区带不会引起额外 的展宽，适用于小分子如药物类分析。缺点是由于毛细管内径很细，所以光路狭 窄，影响了检测灵敏度( 一般为1 0 4 _ 1 0 。6m o l l ) 。为了克服其存在的不足，己采 取了许多改进的拮施，如采用泡型或z 型检测池f 5 】和平面积分榆测池【6 】。t t u s d a t 7 j 采用5 0l a i n 1 0 0 0g m 的毛细管，将光路长度扩展了2 0 倍，同时也增大了检测体 积，检测限达到了1 0 m o l l 。 1 1 5 2 质谱检测器 质谱本身就是一种重要的分析手段，质谱检测的原理与其他检测方法不同， 它是根据分子荷质比的不同达到分离的目的。它不仅可以区分不同分子质量的分 析物，还可以区分不同质量分裂模式的分析物，能提供分子结构信息。毛细管电 泳与质谱联用实现了分离与检测的“强强联合”。目前，该技术主要用于基因和 重要复杂体系的分析。质谱检测的灵敏度高，结构分析能力强，但是也有成本高、 与其他方法联用技术难度大等缺点0 1 。近年来，m o i n i 等 1 0 a1 1 对毛细管电泳和 质瑶的接口进行了研究，对分离和检测多肤和蛋白质的混合物取得了满意的结 果，它可以测定5 1 0 个红细胞当中的血红蛋白。2 i 。 1 1 5 3 电化学检测器 在众多检测方法中，电化学检测以其质量检出限低、线性范围宽、选择性好、 设备简单、价格低廉而得到广泛的使用。电化学检测主要有三科一方法电导检测! 电位检测和安培检测。 1 1 5 4 化学发光检测器 化学发光检测具有灵敏度高、仪器结构相对简单等优点，近年来己经开始同 毛细管电泳联用。化学发光检测的原理是在检测窗口引入发光试剂，使它与分析 物复合发光，通过检测此光信号达到检测分析物的目的。g i l m a nsd 1 1 3 1 等采用电 产生的化学发光检测鲁米诺，达到了9 2 1 0 。9 m o l l 的检测限。如用此联用技术 分析蛋白质，检测限比紫外检测降低4 个数量级4 l 。 6 青岛科技人学研究生学位论文 1 1 5 5 荧光检测器 荧光检测器灵敏度高，选择性好，已在生物分析领域占有重要地位，尤其是 激光诱导荧光检测器，已达到光谱分析方法的极限单原子和单分子检测。激 光诱导检测器灵敏度可比紫外可见检测器高1 0 0 0 倍，d n a 序列的分析必须用激 光诱导检测器。但是因为其造价昂贵，并且由于分析物般需经过衍生才可以进 行荧光检测，使得其通用性受到限制。 1 1 6 毛细管电泳技术的特点 毛细管电泳具有分析时问短、分离效率高、适应性广、检测性低、进样量小、 溶剂耗量少、自动化程度高等优点。它一出现就引起分离界极人的关注，目日，j ， 它己成为和2 0 世纪5 0 年代术、6 0 年代仞出现的气相色谱( g c ) 以及2 0 世纪7 0 年代初出现的液相色谱( h p l c ) 相媲美的一种分离技术，并被认为是当代分析 科学最具活力的前沿课题【l5 。 与传统的分离方法相比，毛细管电泳的显著特点是简单、高效、快速和微量。 此外，毛细管电泳还具备了经济、清洁、易于自动化、一机多用和环境污染少等 优点。所有这些特点使得毛细管电泳迅速成为一种极为有效的分离技术，广泛应 用于分离多种化合物，如氨基酸、糖类、维生素、杀虫剂、有机酸、无机离子、 染料、表面活性剂、药物、多肽和蛋白质、神经递质、低聚核苷酸( r n a ) 和 d n a 片段等。近年来，毛细管电泳在手性化合物分离、药物分析、d n a 分析和 环境分析等领域得到越来越广泛的应用。 与传统电泳相比，毛细管电泳具有如下特点1 1 6 1 ： ( 1 ) 毛细管电泳的分离效能更高。在毛细管区带电泳中，分离效能。般为 每米几十月理论板数，高的可达每米1 0 0 力_ 以上；在毛细管凝胶电泳中分离效能 达到几百万乃至六千万； ( 2 ) 分析速度更快。在高电场驱动下，荷电粒子的分析时j 叫一般不超3 0m i n ； ( 3 ) 高灵敏度检测技术的应用，使毛细管电泳的最低检测限大幅度下降； ( 4 ) 应用范围更广。毛细管电泳的不同分离模式，扩大了毛细管电泳的应 用范围； ( 5 ) 进样量更少，一般进样量为1n l 5 0n l ； ( 6 ) 自动化程度更高。 1 1 7 毛细管电泳应用研究进展 毛细管电泳的小孔径、高电阻、抗对流等特性使毛细管电泳( c e ) 可在高电场、 小电流下工作，实现高效、快速的分析。如今，c e 已象g c 和h p l c 一样，通 毛细管电泳在酶联免疫分析及天然产物有效成分检测中的应用 过多种模式在分析的各个领域成为重要分析手段。 1 1 7 i 糖及其缀合物的分析 目- 自0 自匕i - 用于糖测定的方法有核磁共振( n m r ) 、质谱( m s ) 、色谱、电泳等。n m r 适合于结构测定，包括异头分析，但对十分微量生物来源糖样往往力不从心。 m s 可以同时提供糖的分子量和结构信息，但是质潜法不能用于研究异头结构。 色谱技术门类比较齐全，是糖分离分析的有效工具，其中常用的有离子色谱( i c ) ， 反相高效液相色谱( r p h p l c ) 和气相色谱等。色谱法的主要问题是效率不高，操 作烦琐，分离时例较长。最近这些年来，