（生物化学与分子生物学专业论文）mif细胞信号转导与功能的研究.pdf

p4 l：。 i j 0 酉 狐 弋 thesign alt r ans duc t ion a nd func t ions t u d y o fmif a u t h o r sn a m e ： q i y uw a n g s p e c i a l i t y ：b i o c h e m i s t r ya n dm o l e c u l a rb i o l o g y s u p e r v i s o r ：p r o f j i et a n g f i n i s h e dt i m e ：j u n e5 ，2 0 0 7 48 4川9m哪mi洲8 iii1洲y 中国科学技术大学学位论文原创性和授权使用声明 本人声明所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作 所取得的成果。除已特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含任 何他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究 所做的贡献均己在论文中作了明确的说明。 本人授权中国科学技术大学拥有学位论文的部分使用权，即：学 校有权按有关规定向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 作者签名：王名翌 知d7 年歹月5 日 隶檀 z p o7 c 5 l 。 摘要 摘要 巨噬细胞迁移抑制因子( m i f ) 在调节固有免疫和获得性免疫中发挥重要作 用，在炎症、败血症和自身免疫疾病中都有它的参与。m i f 可以刺激巨噬细胞 表达t n f 扒i l 1 、i l 6 和i l 8 等多种细胞因子，同时诱导i n o s 等多种蛋白的表 达。我们对于m i f 的功能和细胞信号转导做了一些比较深入的研究。此外，我们 还对另一个细胞因子h m g b l 的核内功能做了一些研究。 1 我们在最近的研究中首次发现外源性的m i f 可以上调r a w 2 6 4 7 细胞t n f q i i 型受体的m r n a 水平。通过m i f 抑制剂、抗体、以及s i r n a 处理，发现细胞 自分泌的m i f 对维持t n f ai i 型受体的基线水平有很大作用。使用特异性信 号转导抑制剂发现这种调节作用可以被s r c 和j n k 抑制剂所阻断。在巨噬细胞 活化过程中，m i f 这一新发现的功能提示它在放大炎症信号的同时，还能消 减t n f a 可能引起的凋亡和细胞毒等副作用。 2 巨噬细胞中i n o s 的上调以及n o 的合成在炎症反应中非常重要。我们在研究 l p s 束t j 激巨噬细胞产生n o 的实验当中发现，l p s 刺激所引发的i n o s 的上调， 需要受到先因刺激而分泌出来的m i f 的调节。而且这种调节是通过s r c - p 3 8 j 直 路来完成的。这一发现证明了l p s 引发的n o 的释放，并非是由它的下游信号 直接导致，而是需要m i f 的参与。 3 h m g b l 具有可以和d n a 结合的两个区域以及一个酸性的尾巴。我们提出了 关于h m g b l 的c t a i l 功能的一个全新的模型。c t a i l 与a bb o x e s 结合，作为 选择性开关，来调节h m g b l 识别特殊结构的d n a 。 关键词m i f , t n f ri i ，i n o s ，h m g b1 ，c t a i l a b s t r a c t a b s t r a c t m a c r o p h a g em i g r a t i o ni n h i b i t o r yf a c t o r ( m i f ) p l a y sa ni m p o r t a n t r o l ei nt h e r e g u l a t i o no ft h ei n n a t ea n da d a p t i v ei m m u n i t ya n di si m p l i c a t e di ni n f l a m m a t i o n ， s e p s i sa n da u t o i m m u n ed i s e a s e p r e v i o u sw o r k sh a v es h o w nt h a tm i fc o u l di n d u c e t h ee x p r e s s i o no fm a n yc y t o k i n e s ，s u c h 嬲t n f 一0 【，i l - 1 ，i l 6a n di l 一8i n m a c r o p h a g e m i fc o u l da l s oi n d u c ei n o se x p r e s s i o n i nt h ep r e s e n tw o r k ，w ed i d s o m er e s e a r c hw o r ko nt h es i g n a lt r a n s d u c t i o na n df u n c t i o no fm if w ea l s od i ds o m e s t u d yo nt h ef u n c t i o no fh m g b 1i nt h en u c l e u s 1 w er e p o r t e dh e r ef o rt h ef i r s tt i m et h a tm i f u p - r e g u l a t e st h et y p ei it n f q r e c e p t o r ( p 7 5t n f r ) e x p r e s s i o na tm r n al e v e li nr a w 2 6 4 7c e l ll i n e w h e n r a w 2 6 4 7c e l l sw e r et r e a t e dw i t hm i fi n h i b i t o r , a n t i b o d y n e u t r a l i z i n gm i f a c t i v i t i e so rt h es i r n as p e c i f i ct om i fr e c e p t o rc d 7 4 ，t h eb a s e l i n et n f ri i m r n al e v e lw a sr e d u c e d u s i n gi n h i b i t o r ss p e c i f i ct oe r k ，j n k ，p 3 8 ，s r co r p k a ，w ed e m o n s t r a t e dt h a tm i fr e g u l a t i o no ft n f ri im r n ae x p r e s s i o ni s m e di a t e db ys r ca n dj n k t h eu p r e g u l a t i o no ft h et n f - 0 it y p ei ir e c e p t o rb y m i fs u g g e s t sam e c h a n i s mo fa m p l i f y i n gi n f l a m m a t o r ys i g n a l sw h i l ea v o i d i n g s i d ee f f e c t so ft n f q ，s u c ha sa p o p t o s i so r c y t o t o x i c i t yd u r i n gm a c r o p h a g e a c t iv a t i o n 2 i n o su p r e g u l a t i o na n ds u b s e q u e n tn i t r i co x i d es e c r e t i o nf r o mm a c r o p h a g ei sa c r u c i a le v e n ti n i n f l a m m a t o r yr e s p o n s e l p sa n daf e wp r o - i n f l a m m a t o r y c y t o k in e sh a v e b e e n r e p o r t e d t o u p r e g u l a t e i n o s e x p r e s s i o n u s i n g n e u t r a l i z i n ga n t i b o d ya n ds p e c i a li n h i b i t o ra g a i n s tm i f , w ed e m o n s t r a t e dt h a t l p sd i dn o ti n d u c ei n o sg e n et r a n s c r i p t i o n d i r e c t l y i tw a st h ee y t o k i n e s i n d u c e db yl p st h a tw e r er e s p o n s i b l ef o rt h eu p - r e g u l a t i o no fi n o se x p r e s s i o n f u r t h e re x p e r i m e n t sw i t hs r ca n dm a p ki n h i t i b o r sa sw e l la ss i r n as p e c i f i ct o c d7 4o rm i fs u g g e s t e dt h a tm i fs i g n a lt r a n d u c t i o np a t h w a yw a si m p o r t a n tf o r i i a b s t r a c t i n o sm r n a u p - r e g u l a t i o n 3 h m g b1i sac o n s e r v e dc h r o m o s o m a lp r o t e i nc o m p o s e do ft w od n ab i n d i n g d o m a i n sa n da na c i d i cc - t e r m i n a lt a i l t h e r ew e r ee v i d e n c e ss u g g e s t i n gt h a tt h e c - t e r m i n a lt a i lc o n t r i b u t e dt ot h ed n a b i n d i n gs p e c i f i c i t yo f t h en - t e r m i n a l d n a b i n d i n gd o m a i n s h o w e v e r , t h em e c h a n i s mu n d e r l i n i n gt h i so b s e r v a t i o n i sl a r g e l yu n k n o w n o u rd a t af i r s tc o n f i r m e dt h ep r e v i o u ss t u d y 、航mn m rt h a t s h o w e dad i r e c ti n t e r a c t i o nb e t w e e nh m g b1 sc t e r m i n a lt a i la n di t sn - t e r m i n a l d o m a i n s w ef u r t h e rd e m o n s t r a t e dt h a tt h i si n t e r a c t i o nc a nb ec o m p e t e dm o r e e f f i c i e n t l yb ya d n a 、析t l lf o u rw a yj u n c t i o ns t r u c t u r et h a nb yal i n e a rd o u b l e s t r a n d e dd n a m u t a t i o n sw i t h i nt h en t e r m i n a lr e g i o n ，t h a td i s r u p ti t sb i n d i n g t ot h ec t e r m i n a lt a i l ，a b o l i s h e dh m g b 1 sa b i l i t yt od i s t i n g u i s ht h el i n e a rd n a a n dt h ef o u rw a yj u n c t i o nd n a t h o s ed a t as u g g e s t e dau n i q u em e c h a n i s m d e s i g n e db yn a t u r et h a tu t i l i z e sap r o t e i n sn e g a t i v e l yc h a r g e dc - t e r m i n a lt a i lt o e n h a n c ei t sd n a b i n d i n gd o m a i n ss p e c i f i c i t yt oc e r t a i ns t r u c t u r e dd n a s k e yw o r d s ：m i f , t n f ri i ，i n o s ，h m g bi ，c - t a i l i i 1 目录 目录 第一章绪论。1 1 1m i f 的研究历史1 1 2m i f 基因、蛋白结构l 1 3m i f 的分泌和分布2 1 4m i f 细胞信号转导3 1 4 1m i f 受体3 1 4 2 激活m a p k s 信号转导途径。4 1 4 3 与j a b 。l 相互作用5 1 4 4m i f 的胞吞作用5 1 5m i f 的生物学功能6 1 5 1 刺激炎症因子释放6 、 1 5 2 上调细胞表面受体的表达6 l ，5 3m 1 f 具有的酶的活性7 1 5 4 抑制凋亡，调节细胞周期8 1 5 5m i f 与g c 1o 1 5 6m i f 与疾病1 1 1 6h m g b l 酸性尾巴调节h m g b ld n a 结合特异性1 3 1 7 课题的新意和研究策略1 4 第二章材料与方法1 6 2 1 毫要试剂及实验用品1 6 2 2 细胞培养17 2 3 细菌培养1 7 2 4 重组人m i f 蛋白的构建1 7 2 5 电泳1 9 2 6w e s t e r nb l o t 分析2 0 2 7 内毒素的去除2 1 2 8g i l e s s 法测定n o 浓度2 2 2 9m t t 细胞增殖和毒性检测2 3 2 1 0 核质分离2 4 2 1 l 抗体中和实验2 5 2 1 2r n a 干扰2 5 i i i 目录 2 1 3 总r n a 的提取及r t - p c r 2 5 2 1 4 $ 3 5 和b i o t i n 标记m i f 2 7 第三章实验结果2 8 3 1 重组人m i f 蛋白的表达纯化及功能检测2 8 3 2m i f 调节巨噬细胞系r a w 2 6 4 7 中t n f a l p h ai i 型受体的表达2 9 3 2 1m i f 上调t n f r i i 的表达，而不影响t n f r - i 一2 9 3 2 2t n f r - i i 的正常表达需要细胞自分泌的m i f 来维持3 0 3 2 3m i f 通过激活s r e - j n k 信号通路来上调t n f r i i 的表达31 3 3l p s 通过刺激巨噬细胞分泌m i f 来调节i n o s 的产生一3 2 3 3 1l p s 刺激巨噬细胞产生i n o s ，需要新分泌到上清中的其他蛋白来 完成一3 2 3 3 2l p s 刺激产生i n o s 需要新分泌的m i f 来完成3 3 3 3 3l p s 诱导i n o s 的产生需要m i f 与c d 7 4 的结合传递信号3 5 3 3 4l p s 诱导i n o s 的产生，需要新分泌的m i f 激活s r e - p 3 8 通路来完 j 自3 i ：。：1 6 3 4m i f 可以被巨噬细胞经过胞吞进入细胞核发挥功能3 8 3 4 1 液闪仪和放射自显影检测s 3 5 m i f 被胞吞进入细胞。3 8 3 4 2s 3 5 m l f 可以被胞吞进核。3 9 3 4 3b i o t i n 标记m i f 验证其进核。4 3 3 5m i f 与糖皮质激素之间的相互影响4 5 3 6 其他m i f 相关研究工作5 0 3 7h m g b l 酸性尾巴调节h m g b l d n a 结合特异性5 4 3 7 1c t a i l 与a b 结合5 4 3 7 24 w j sd n a 与c - t a i l 竞争结合到a b 上5 6 3 7 3 a bb x o e s 突变蛋白失去了与c - t a i l 的结合作用，但是却增强了与线 形d n a 之间的结合5 7 3 7 4h m g b l 全长蛋白的突变体失去了它对弯曲d n a 的选择作用5 7 3 8h m g b l 其他相关研究5 9 第四章讨论61 参考文献“ 附录7 5 致谢7 7 攻读学位期间发表的学术论文与取得的其他研究成果7 8 i i i 第l 章绪论 第1 章绪论 1 1m l f 的研究历史 早在1 9 3 2 年，r i c h 和l e w i s 首次在体外实验中发现一种可以抑制炎症细胞 迁移的因子存在。从5 0 年代后期开始，巨噬细胞迁移抑制因子这个名字逐渐被 人们用来定义在实验中发现的影响单核细胞运动的因子。1 9 6 2 年，研究者发现 预先用抗原致敏的巨噬细胞在体外培养时加入特异性抗原和致敏的t 淋巴细胞 后，巨噬细胞的移动受到明显抑制。1 9 6 6 年，b l o o m ，b e n n e t t 与d a v i d 发现该抑 制作用是由特异性抗原激活后致敏的t 淋巴细胞分泌的一种水溶性的蛋白分子 介导的1 2 0 由于它可抑制离体巨噬细胞的迁移，并在皮肤迟发性超敏反应中促 进巨噬细胞的聚集，因此被命名为巨噬细胞迁移抑制因子。 然而，直到2 0 多年后的1 9 8 9 年，由w e i s e r 等人第一次成功得到巨噬细胞 迁移抑制因子分子水平的相关信息3 。在1 9 9 1 年，为寻找新的炎症调节因子而 导致了m i f 的重新发现。1 9 9 8 年以后，国际上有关m i f 的研究报道显着增加。 初步研究显示几乎全身所有组织均可表达m i f ，正因为如此，m i f 引起了人们 的重新重视，正逐渐成为新的研究热点。近几年来，m i f 被认为是充当固有性 免疫中枢的调节因子这样一个重要的角色。m i f 是宿主抗微生物防卫系统和应 激反应中不可缺少的成员，而抗微生物防卫系统和应激反应可激发免疫细胞炎 症反应前的功能。越来越多的文献表明，m i f 涉及败血症、炎症和自身免疫性 疾病的发病机制4 - 7 , 这些都显示了在未来，以m i f 为方向的治疗可能为人类疾 病提供新的治疗机会。 1 2m if 基因、蛋白结构 人类只有一个m i f 基因位于2 2 号染色体长臂( 2 2 q 1 1 2 ) ，含3 个外显子 2 0 5 、1 7 3 和1 8 3 b p ，2 个内含子1 8 9 和9 5 b p 8 。m i f 启动子包含多个g c ，不含 t a t ab o x ，说明其多个转录起始位点的存在。此外，m i f 基因上游的启动区可 含有a p i ，n f k b ，e t s ，g a t a ，s p l 和c a m p 识别序列，可以被相应的转录因子 所激活。然而，多个组织m i fm r n a 分析只显示出其单个转录位点的存在，约 含8 0 0 个核苷酸，使用高显液相染色体图谱分析技术证明了m i f 基因存在多态 第1 章绪论 性。其中一种是在57 侧翼区单核苷酸突变( 在一1 7 3 处g - c ) 和全身发作型 幼年期关节炎有关9 。另一种多态性c a t t 四核苷酸在7 9 4 处重复，一部分病人 比较严重的风湿性关节炎与此有关联1 0 。 人类m i f 基因小鼠1 0 号染色体m f 基因部分同线保守。在小鼠基因组中至 少发现有9 个假基因1 1 ，1 2 。在人类基因组中寻找m i f 的同源基因，显示d 一多巴 色素互变异构酶( d d t ) 基因是唯一和m i f 同源的1 3 。这两个基因都位于2 2 号 染色体，距离较近。有理由推测，m i f 和d d t 基因是同一个原始基因的拷贝， 在不断进化中，演变成或具有不同生物学功能。 在人类、小鼠、大鼠等多种种系中发现，单个m i f 信使r n a 约0 8 k b 。它 编码1 1 4 个氨基酸组成的无糖基化的分子量为1 2 5 k d 的蛋白质。m i f 也叫糖基 化抑制因子( g i f ) ，报道称，它能抑制i g e 的合成，并且它具有特异性抗原抑 制因子的活性。令人惊奇的是，m i f 并不属于任何一个细胞因子超家族，与哺 乳动物细胞中其它任何蛋白都不具有很强同源性。放射图谱分析显示，所有哺 乳类动物的m i f 蛋白( 包括人、大鼠、小鼠、牛) 大约有9 0 的同源性。哺乳 动物的m i f 在鱼类、蜱、寄生虫，甚至某些植物和蓝细菌中都能找到同源蛋白。 物种间m i f 的保守性显示了m i f 可能有重要的生物学功能。 h u m a nm p m f i v n t n v p r a s v p d g f l s e l t q q l a q a t g k p p q y i a v m o u s em p m f i v n t n v p r a s v p e g f l s e l t q q l a q a t g k p a q y i a v h v v p d q l m a f g g 鼬p c a l c s l h s i g i r d g g a q n r s y s k l l h v v p d q l m t f s g 迦p c a l c s l h s i g k i g g a q n r n y s k l l c g l l 垦r l 壁is p d r v y i n y yd m n a a n v g w n n s t f a c g l l s = d = d r l _ ms p d r v y i n y yd m n a a n v g w n g _ s t f a 人和大鼠m i f 的x 射线晶体结构显示，它是由含2 个反向平行a 螺旋和6 个b 片层的三个单体组成的同源三聚体，形成一个末端开放的中空结构1 4 - 1 7 0 它 的三维立体构象与草酰乙酸丁烯酸酯互变异构酶，5 一羧甲基一2 羟基粘康酸酯 酶，分支酸变位酶相似哺。 m i f 可以介导d d t 、苯丙酮酸烯醇酮异构酶以及硫醇蛋白氧化还原酶类活 性。氨基端的脯氨酸残基对接触反应活性很重要。然而，m i f 的功能性酶活性 是否是它生物学功能所必需的这一点还尚未清楚，可能m i f 的酶活性是m i f 、 2 第l 章绪论 d d t 基因的原始基因残留的功能。 1 3m l f 的分泌和分布 免疫系统中t 细胞是产生细胞源性m i f 的主要细胞，然而单核细胞、巨噬 细胞、血液中的树突状细胞、b 细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、 嗜碱性粒细胞也表达m i f 。和大多数细胞因子相比，m i f 组成型表达，并贮存 在细胞内池中，因此并不需要在分泌前重新合成蛋白。m i f 在氨基端缺少信号 肽序列，并且用内毒素刺激单核细胞，显示m i f 不经过内质网而是通过非传统 蛋白分泌路径释放出胞。非传统蛋白出胞的典型抑制剂g l y b u r i d e 和p r o b e n i c i d 能够强烈抑制m i f 的分泌，说明m i f 分泌出胞时有a b c a l 通道蛋白的参与旧。 m i f 的另一个与众不同的性质是，一些内分泌系统的组织可以高水平表达， 特别是那些和应激反应有关的器官，如下丘脑、垂体、肾上腺。目前认为，m i f 的分泌是机体系统性应激反应的重要组成部分。小鼠腹腔内注射l p s 后，小鼠 垂体m 1 f 含量明显下降，并伴随血浆m i f 升高，垂体组织m i fm r n a 表达也逐 渐增加2 0 - 2 2 暴露于应激状态3 。4 小时后可以观察到循环m i f 水平升高，这种现 象与应激后a c t h 和糖皮质激素水平升高很相似“。因此，m i f 被认为是垂体 起源的机体应激反应的介导因子。值得注意的是，细胞或是组织表达m i f ，如 肺、皮肤上皮层、胃肠道、泌尿生殖道，和宿主自然环境直接相关。 1 4m 1 f 细胞信号转导 1 4 1m i f 受体 迄今为止，关于m i f 细胞膜受体尚不清楚。2 0 0 3 年l e n g 等研究发现，m i f 可能通过与细胞膜表面蛋i 兰i c d 7 4 的细胞外基团结合而发挥作用，提出c d 7 4 作为 m i f 受体的可能性乃。c d 7 4 为i i 型跨膜分子，又称为i i 类m h c , l i 关恒定链，在 胞内参与i i 类m h c 的组装，也有一部分表达在细胞表面上。m i f 与c d 7 4 分子 的胞外部分即7 3 2 3 2 位氨基酸残基高亲和力结合后，激活e r k 磷酸化级联反 应，从而引起各种细胞的增生及炎性介质的合成与释放，产生各种生理效应， 而抗c d 7 4 抗体能够阻断m i f 介导的人b 细胞系r a j i 细胞的增殖。m i f 与c d 7 4 分 子的结合可能是m i f 发挥诱导e r k l 2 磷酸化和促使细胞增生作用中必需的一 个步骤。含c d 7 4 胞外部分的可溶性片段s c d 7 4 7 3 。2 3 2 及抗c d 7 4 中和性抗体均可 3 第1 章绪论 抑制细胞膜上的c d 7 4 分子与m i f 的结合，从而阻抑m i f 的炎性作用。因而制备高 1 4 2 激活m a p k s 信号转导途径 1 4 2 1e r k l ，e r k 2 m i f 促进细胞增殖与p 4 4 4 2 细胞外信号调节激酶( e r k ) ，有丝分裂原激活 蛋白激酶( m a p k ) 的激活有关，主要通过r a s _ r a f _ m a pk e r kk i n a s e _ e r k 途径。e r k 磷酸化级联途径，是导致细胞增殖最常见的途径，需要蛋白激酶a 的 存在。m i t c h e l l 等发现，m i f 可诱导快速和持续磷酸化激活e r k i 2m a p k 信号 转导途径，使处于生长静止期的n i h 3 t 3 胚胎成纤维细胞活化增生2 6 。e r k 、 m a p k 途径可活化胞浆内各种蛋白，如p 9 0 r s k 、c m y e 、e p l 吣等，而c p l a 2 是炎 症级联反应最关键的组分。c p l a 2 的花生四烯酸产物，如白三烯、p g e i 都是重 4 第1 章绪论 要的炎性介质，可激活州k 级联反应，引起炎症发应。 1 4 2 2p 3 8 用g c 年 i l p s 处理m i f 和野生型小鼠腹腔巨噬细胞，发现m i f 缺失与g c 的 敏感相关。这现象与m k p l 的表达上调相关，并伴随着p 3 8m a p k 磷酸化下降。 这些结果证明m i f 通过磷酸化p 3 8m a p k 来调节g c 敏感性。此外，在那些难控制 肠炎病例当中，m i f 抗体在改善g c 耐受的同时，也降低了l p m c 当中的 p 3 8 一m a p k 活性。并且p 3 8 m a p k 抑制剂s b 2 3 0 5 8 0 可以改善g c 耐受情况2 7 。2 9 。 1 4 2 3j n k 实验发现经过u v a 照射，m i f 缺失小鼠中的皮肤纤维原细胞与野生b a l b c 中的相比表达m m p 1 3 的量明显降低。此外，可以被m i f j 轻u 激而上调的m m p 1 m r n a 可以被s r c 抑制剂、y n k 抑制剂等明显得降低，然而p 3 8 抑制剂对此却没有 什么影响。同时还发现，在m i f 束i j 激两个小时后，a p 1 的d n a 结合能力被明显 提高3 0 。 1 a 3 与j a b 1 相互作用 j a b l 是一个约4 0 k d 的可溶性胞浆蛋白，和其它的c s n 亚单位一样在其n 末 端含有一个m p n ( m p r l p a d l - n t e r m ) 结构域引。m p n 结构域在c o p 9 信号体 的几个亚单位、2 6 s 蛋白酶体的调节盖、转录起始因子e l f 3 等蛋白中出现，其功 能尚不清楚。作为a p - 1 ( 一种控制细胞生长转化、上调炎性因子基因表达的转 录因子) 的共刺激因子，j a b l 可使j n k 磷酸化，促进细胞生长，并激活a p l 。 j a b l 还可通过蛋白酶体途径促使细胞周期抑制物p 2 7 r 中瘤抑制物p 5 3 的降解。 尽管c d 7 4 可能是m i f 位于胞膜上的受体，但m i f 同时也可以通过其它方式发 挥作用。运用酵母双杂交系统，k l e e m a n n 等证实，m i f 可以与胞内蛋白j a b l 直接 结合，且m i f 和j a b l 共同存在于胞质中3 2 。还发现无论内源性或外源性的m i f 均 可与胞浆内的j a b l 结合，反向调节j a b l 的作用，抑$ l j j a b l 对j n k 、a p 1 活性的正 性协调效应。从而维持了细胞周期蛋白p 2 7 在核内的积累，防止其出核而被降解， 细胞停滞在g l 期。其中，m i f 主要位于胞外，而j a b l 位于胞内，胞外的m i f 可通 过胞吞作用进入胞浆，其5 0 - - - - 6 5 位氨基酸残基与j a b l 相关区域特异性结合后， 可抑带o j a b l 所引起的促细胞生长、炎症反应发生的作用，且这种抑制是剂量依赖 性的，2 0 0 n m 左右浓度的重组m i f 即可完全抑sj j j a b l 激活j n k 的作用。l i 等报道， m i f 还可增强肝细胞瘤h e p g 2 细胞内h p o 的表达，后者通过j a b l a p 1 途径促进肝 5 第l 章绪论 癌细胞增殖3 3 。h p o 可与m i f 竞争结合j a b l ，而m 1 f 虽不能影响h p o 与j a b l 的结合， 但可显着降低h p o 增强a p 1 活性的作用而引起生长抑制效应，这说明m i f 对细胞 生长有促进和抑制的双重调节作用。 1 4 4m i f 的胞吞作用 众多的实验证实了m i f 可以通过内吞作用进入细胞，与胞质中的j a b l 结合， 从而抑f l ；l j j a b l 对j n k 、a p l 活性的正性协调效应。胞吞的m i f 也可能参与受体介 导的信号通路，也可以通过与j a b l 结合，而传导信号通路。 内吞作用是大分子及颗粒物质进入细胞的方式，质膜通过变形运动将胞外 物质转入胞内的过程。内吞作用广义地分为两类，吞噬作用和胞饮作用。吞噬 作用是指内吞大的颗粒物质( 2 0 0r i m ) ；胞饮作用是指内吞细胞外的液体。人类 和动物的许多细胞均靠胞吞作用摄取物质。质膜运输是与生物发生、细胞器膜 的形成和细胞器间物质交流紧密相连的一个过程。内吞作用是目前公认的生物 体摄取生物大分子的主要途径。m i f 细胞是采取什么样的内吞方式目前尚不清 楚。我们将从内吞的几种作用方式中寻找突破点，确定m i f 所走的胞吞形式，研 究其胞吞与信号转导以及促有丝分裂和相应j a b l 对细胞周期的调节方面的关联。 1 5m i f 的生物学功能 1 5 1 刺激炎症因子释放 m i f 作为一个细胞因子在固有性免疫系统中有着重要的作用。l p s ，t n f a l p h a ，i f n 吖等刺激巨噬细胞释放m i f ，当m i f 释放到组织或在全身循环时，它 就充当一个经典的促炎症细胞因子，通过巨噬细胞、t 细胞活化而促进固有性和 适应性免疫应答。用m i f 缺失细胞，特异性m i f 抗体或重组m i f 做实验，发现m i f 直接或间接促进一组促炎症分子的生成和表达，包括细胞因子( t n f 、n 吖、 i l - i 、i l 2 、i l 6 、i l 8 ) ，巨噬细胞炎症蛋白2 ，n o ，c o x 2 和花生四烯酸途径 产物，还有一些基质金属蛋白酶和它们的抑制因子只3 4 - 37 。 1 5 2 上调细胞表面受体的表达 1 5 2 1 上调t l r - 4 的表达 t l r - 4 是内毒素( l p s ) 的主要受体。机体对l p s 和革兰氏阴性菌的识别需 要l p s 、l b p 、c d l 4 和t l r 4 之间的相互作用。而t l r 4 可以激活下游的转录因 6 第l 章绪论 子n f k b ，引起巨噬细胞活化增生、释放炎症因子的作用。m i f 上调t l r 4 的表达 是通过对转录因子的e t s 家族作用而实现的。e t s 家族包括p u 1 ，它对小鼠t 1 r 4 基因的转录很重要。巨噬细胞中m i f 表达下降时，会损伤p u 1d n a 结合能力和 p u 1 依赖的t l r 4 基因的转录活性3 8 。研究发现，m i 倦因缺失小鼠体内的巨噬细胞 对l p s t 阳革兰氏阴性细菌如伤寒沙门菌反应低下，细胞因子分泌减少，体内的伤 寒沙门菌浓度高，而对缺氧等刺激的反应却不受影响，这可能与m i f 上调t l r 4 的表达有关邛卵。因此，m i f 通过上调t l r 4 的表达，促进了淋巴细胞对含内毒素 细菌的侦察，使位于宿主抗微生物防卫系统第一线的细胞，如巨噬细胞，能迅 速对入侵的微生物起反应。炎症前细胞因子的快速生成对于宿主防卫反应的产 生是绝对重要的。 1 5 2 2 上调i i ，l ，t n f r i 的表达 与野生型细胞相比，m i f 缺失细胞在i l 1 和t n fa l p h a * l j 激下，表现出m a p k 、 4 p 1 活性降低，同时细胞增殖也降低。m i f 缺失细胞中的这种低敏感性与细胞因 子受体的下调相关，表现出i l 1 受体和t n f r i 受体减少。而补充重组的m i f 或 m a p k 上游的激酶之后，可以恢复其正常表达水平4 0 。这些结果说明，内源性的 m i f 是m a p k a p 1 活化细胞因子所必需的，同时也是细胞因子受体表达所必需 的。这样就从另一个角度证明了m i f 在细胞因子调节的免疫反应当中发挥着重要 的调节作用。 1 5 2 3 上调基质金属蛋白酶( m a t r i xm e t a l l op r o t e i n a s e s ，m m p s ) 的功能 巨噬细胞不但生成细胞因子和生长因子，还产生大量的水解酶，尤其是金 属蛋白( m m p ) 。m m p 1 也叫间质胶原酶，主要降解i 、i i 、i i i 、x 型胶原蛋白。 m m p 一3 又叫基质分解素，可促使各种细胞外基质，如软骨、i i 、型 胶原的降解，此外还能激活胶原酶原、明胶酶原。因此m m p l 、m m p 3 被认 为是导致类l x l 湿性关节炎患者组织降解的主要蛋白酶类。此外，在人的动脉粥 样硬化斑块中，发现m i f 明显上调m m p 9 的表达，而且在体外平滑肌细胞与巨噬 细胞培养实验中，m i f 能显着上调m t - m m p l 、m m p 2 、m m p 。9 的表达。m i f 在 巨噬细胞中通过激活e r k i 2 ，部分激活j n k 来调节m m p 9 的表达引。m i f 可能通 过上调m m p s 的表达而介导类风湿关节炎患者细胞外基质( 如软骨组织) 的降 解，从而引发一些特异性的组织病理改变。 7 第1 章绪论 1 5 3m i f 具有的酶的活性 m i f 是非常保守的蛋白质，因此m i f 在一定程度上还保留有一些互变异构酶 和硫蛋白氧化还原的活性。所以m i f 又被称为“氧化还原因子”。利用x 线晶体分 析发现，m i f 结构不仅与d 多巴色素互变异构酶在主要氨基酸序列上基本一致j 6 1 8 ，而且还与细菌互变异构酶4 一草酰巴豆酯互变异构酶( 4 o x a l o c r o t o n a t e t a u t o m e r a s e ) 和5 羧甲基2 羟基异构酶( 5 - c a r b o x y m e t h y l 一2 - h y d r o x y m u c o n a t e i s o m e r a s e ) 具有较高的同源性。已知d 多巴色素互变异构酶可以将d 多巴色素 转化为5 ，仁二羟吲哚。经证明，m i f 也具有同分异构酶活性4 2 ，能够将d 多巴 色素转化为5 ，6 二羟吲哚羧基酸。有研究发现m i f 可以催化一些非生理性底物， 如d 多巴色素，l 多巴色素甲酯钉。还发现尿苯丙酮酸( p h e n y l p y r u v i c a c i d ) ， p 一羟基尿苯丙酮酸( p h y d r o x y p h e n y l p y r u v i ca c i d ) ，3 , 4 - 二羟基苤里壁色素( 3 ，4 2 h y d r o x y p h e n y l a m i n e c h r o m e ) 和n o r e p i n e p h r i n e c h r o m e 等是m i f 的生理底物。 m i f 具有的氧化还原酶的活性依赖于c a l c ( c y s 5 7 一a l a - l e u - c y s 6 0 ) 基序，并 以其为催化中心。m i f 能够以依赖谷胱甘肽的方式还原胰岛素的二硫键和2 羟基 乙基二硫键。从而抑制氧胁迫诱导的凋亡。此外研究发现，在m i fp r o - 1m e t - 2 ( p a m ) 之间插入一个丙氨酸残基，或将p