（海洋生物学专业论文）深海嗜热微生物噬菌体gve2裂解相关蛋白的性质研究.pdf

摘要 摘要 深海热液口微生物作为地球生物系统的重要组成部分，对于生态、资源、 环境等方面具有重要性，在新药物开发等工业方面也存在巨大的潜在应用价值。 过去普遍认为微生物是决定生物群落的关键，但是在极端与相对原始的深海环 境下发现了噬菌体的存在，证明噬菌体实际上起到更基础的作用。对热液口嗜 热菌噬菌体的研究，不仅有助于了解噬菌体在控制热液口生物群落中所起的作 用，而且对探索生命起源也具有重要的意义。噬菌体裂解导致细菌死亡，从而 影响细菌的繁殖，进而影响食物链，故研究其具有重大意义。 本文以本实验室分离获得的深海热液区嗜热菌噬菌体g v e 2 为材料，研究与 裂解相关的细胞壁水解酶和膜孔形成蛋白这两个蛋白的性质。 许多发现表明细胞壁水解酶的作用范围比噬菌体的宿主范围要广，但也局 限于同属细菌，且发现a m i d a s e s 具有较广的裂解范围。因为n _ 乙酰胞壁酸和 l 一丙氨酸键广泛存在细菌的细胞壁上。噬菌体裂解酶对细菌的高特异性，不影 响无害或有益的人体寄生菌，裂解酶作为新型抗菌药物具有一定的优势，噬菌 体作为有价值的酶的来源也就越来越引起人们的重视。大部分细胞壁水解酶来 自常温噬菌体，只有小部分来自嗜热细菌噬菌体。本试验从海洋嗜热细菌噬菌 体g v e 2 中鉴定的g v e 2 细胞壁水解酶是一种酰酶。本论文中，重组的细胞壁水 解酶最适温度是6 0 。c ，该酶从4 0 到8 0 。c 都具有活性。它的最适p h 是6 0 ， 并且从p h 4 0 到1 0 0 较广的耐受。重组酶在p h 5 0 1 0 0 耐受1 小时后仍保持 5 0 的活性，说明g v e 2 细胞壁水解酶有较好的弱酸耐受性。对于去污剂和抑制 剂( 用c h a p s ，e d t a ，p m s f ，t w e e n 一2 0 ，t r i t o n x 10 0 ，s d s ) ，结果表明t w e e n - 2 0 和t r i t o n x 1 0 0 对酶的影响不大，但是s d s 和e d t a 对酶的活性具有强抑制作用。 金属离子方面的研究结果显示，k 、l i + 、n a + 对酶的活性有促进作用，m n 2 + 、c a + 、 z n 2 + 、b a 2 + 、m 9 2 + 对酶的活力有负面影响。 在双链d n a 噬菌体中，细胞壁水解酶本身没有信号肽，需要通过膜孔形成 蛋白介导到达细胞壁，从而裂解宿主。通过f a r - w e s t e r n 研究，结果显示g v e 2 细胞壁水解酶和膜孔形成蛋白存在互作，进一步采用细菌双杂交进行试验，结 深海热液区嗜热菌噬菌体o r e 2 与宿主相互作用的分子机理研究 果表明膜孔形成蛋白全长与细胞壁水解酶8 1 - 2 3 3 a a 区域存在互作。 本文通过g s tp u l ld o w n 、免疫共沉淀研究，发现宿主的a b c 运输蛋白、 乙醇脱氢酶锌指结合蛋白和e f t u 蛋白与g v e 2 细胞壁水解酶存在蛋白互作，克 隆了a b c 运输蛋白和e f - t u 基因，细菌双杂交试验显示细胞壁水解酶可能与复 合体中的乙醇脱氢酶锌指结合蛋白或和a b c 运输蛋白存在互作。 关键词：深海噬菌体，裂解，细胞壁水解酶，膜孔形成蛋白 l i a b s t r a c t a st h ei m p o r t a n tc o m p o n e n t so fg e o b i o l o g i c a ls y s t e m ，d e e p - s e am i c r o b e sp l a y i m p o r t a n tr o l e si ne c o l o g y , r e s o u r c e sa n de n v i r o n m e n t s ，a n da l s om a yl i g h tt h ew a y t ot h ed e v e l o p m e n to fn e w d r u g s ，i n d u s t r i a lp r o c e s s e s ，a n do t h e rp r o d u c t su s e f u lt o u sa 1 1 i nt h ep a s t ，m i c r o b e sa r et h o u g h tt ob et h ek e yf a c t o r s a f f e c t i n gt h e h y d r o t h e r m a lv e n tb i o l o g i c a lc o m m u n i t y h o w e v e rt h ee x i s t e n c eo fb a c t e r i o p h a g e s i nt h e r e l a t i v e l yo r i g i n a l a n de x t r e m e d e e p - s e ae c o s y s t e m sp r o v e s t h a t b a c t e r i o p h a g e sm a y b e i t sc o n t r o l l e r s t u d i e so n d e e p s e at h e r m o p h i l i c b a c t e r i o p h a g e sw i l lb eh e l p f u lf o ru n d e r s t a n d i n gt h ec o n t r o lo fh y d r o t h e r m a lv e n t b i o l o g i c a lc o m m u n i t i e s ，b u ta l s oo fg r e a tp o t e n t i a lf o re x p l o r i n gt h eo r i g i no fl i f e t h el y s i so fb a c t e r i ab yb a c t e r i o p h a g e sl e a d st ot h ed e a t ho fb a c t e r i a ，a n df u r t h e r i n f l u e n c e st h em u l t i p l i c a t i o no fm i c r o b e sa n dt h ef o o dc h a i n t h e r e f o r e ，i ti s m e a n i n g f u lt og u d yo nb a c t e r i o p h a g el y s i s i n t h i si n v e s t i g a t i o n ，t h el y s i na n dh o l i no ft h e r m o p h i l i cb a c t e r i o p h a g eg v e 2 i s o l a t e df r o mad e e p s e at h e r m o p h i l i cb a c t e r i u mw e r ec h a r a c t e r i z e dt ou n d e r s t a n d t h el y s i sm e c h a n i s mo fb a c t e r i o p h a g ea th i g ht e m p e r a t u r e i ns o m ec a s e s ，t h el y t i cr a n g eo fal y s i nm a yc o n s i d e r a b l ye x c e e dt h a to ft h e p h a g ef r o mw h i c hi ti sd e r i v e d ，b u ta l s od i s p l a yan a r r o ws p e c t r u mo ft h es a m eg e n u s h o w e v e r a m i d a s e sh a v eb e e ns u g g e s t e dt od i s p l a yab r o a d e rs p e c t r u mo fa n t i b a c t e r i a l a c t i v i t yt h a no t h e rc l a s s e so fe n d o l y s i n sb e c a u s ei tc a nc l e a v et h ea m i d eb o n db e t w e e n n a c e t y l m u r a m i ca c i da n dl a l a n i n ei np e p t i d o g l y c a n t h es p e c i f i c i t yo fl y t i cr a n g e m a k e si th a v en oh a r m f u lt oh e a l t h y l y s i na san e wa n t i b a c t e r i a lh a sg r e a tp o t e n t i a l t h eu s eo ft h el y s i na t t r a c t s p e o p l e si n t e r e s t m o s tl y s i n s a r eo b t a i n e df r o m m e s o p h i l i cb a c t e r i o p h a g e s a n d o n l y v e r y f e w l y s i n i sf r o m t h e r m o p h i l i c b a c t e r i o p h a g e i nt h i ss t u d y , t h eg v e 2l y s i nb e l o n g i n gt on - a c e t y l m u r a m o y l l a l a n i n ea m i d a s e sg r o u p sw a sc h a r a c t e r i z e d t h er e c o m b i n a n tl y s i nw a sa c t i v eo v e ra r a n g eo ft e m p e r a t u r ef r o m4 0 。ct o8 0 。c ，w i t ha no p t i m u ma t6 0 。c i t so p t i m a lp h i i i 深海热液区嗜热菌噬菌体g v e 2 与宿主相互作用的分子机理研究 w a s6 0 ，a n di tw a ss t a b l eo v e raw i d er a n g eo fp hf r o m4 0t o10 0 w h e nt h el y s i n w a sp r e i n c u b a t e di nas e r i e so fp hb u f f e r sp h 5 o 一10 0f o r1h o u r ，i ts t i l ls h o w5 0 r e l a t i v ea c t i v i t y t h er e c o m b i n a n tl y s i n ee x h i b i t e dg o o dt o l e r a n c e sa ta c i dp h v a l u e s t h el y s i nw a sh i g h l ya c t i v ew h e ns o m ee n z y m ei n h i b i t o r so r d e t e r g e n t s ( p h e n y l m e t h y l s u l f o n y lf l u o r i d e ，t w e e n 2 0 ，t r i t o n x - 10 0 ，a n dc h a p s ) w e r eu s e d h o w e v e r ，i tw a ss t r o n g l yi n h i b i t e db ys o d i u md o d e c y ls u l f a t ea n de t h y l e n ed i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d i t se n z y m a t i ca c t i v i t yc o u l db es l i g h t l y s t i m u l a t e di nt h ep r e s e n c eo f k + ，l i + a n dn a + b u tt h em e t a li o n sm n 2 + ，c a 2 + ，z n 2 + ，a a + a n dm 9 2 + s h o w e d i n h i b i t i o n st ot h el y s i na c t i v i t y i nt h ed o u b l e - s t r a n dd n ab a c t e r i o p h a g e s ，t h el y s i nl a c k sas e c r e t o r ys i g n a l s e q u e n c et om e d i a t ei t sr e l e a s ea c r o s st h ec y t o p l a s m i cm e m b r a n e i nt h i sc a s e ，t h e h o l i nf o r m sp o r e si nt h ec y t o p l a s m i cm e m b r a n eo ft h eh o s tt oa l l o wt h el y s i nt oa c c e s s t h ep e p t i d o g l y c a nl a y e ro fh o s tc e l l o u rs t u d yi n d i c a t e dt h a tt h e r ew a si n t e r a c t i o n b e t w e e ng v e 2l y s i na n dh o l i nb yf a r - w e s t e r nb l o t a n a l y s i s t h ef o l l o w e d i n v e s t i g a t i o nu s i n gb a c t e r i a lt w o h y b r i ds y s t e mr e v e a l e dt h a t - t t h eh o l i nc o u l db i n dt h e 81 - 2 3 3 一a ad o m a i no fl y s i n b a s e do ng s tp u l ld o w na n dc o - i m m u n o p r e c i p i t a t i o n ，i tw a sf o u n dt h a tt h e h o s ta b ct r a n s p o r t e rp r o t e i n ，a l c o h o ld e h y d r o g e n a s ez i n c b i n d i n gd o m a i np r o t e i n a n de f t uw e r ei n t e r a c t e dw i t hg v e 2l y s i n t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eg v e 2l y s i n m i g h ti n t e r a c tw i t ht h eh o s ta l c o h o ld e h y d r o g e n a s ez i n c b i n d i n gd o m a i np r o t e i na n d a b c t r a n s p o r t e rp r o t e i ni nt h el y s i sp r o t e i nc o m p l e x k e yw o r d s ：d e e p s e ab a c t e r i o p h a g e ，l y s i s ，l y s i n ，h o l i n i v 国家海洋局第三海洋研究所 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论 文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文 的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 口卞鹰 日期：2 0 0 年p 7 月 国家海洋局第三海洋研究所 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解国家海洋局第三海洋研究所有关保 留、使用学位论文的规定，同意本所保留并向国家有关部门或机构送 交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权国家海 洋局第三海洋研究所可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编 本学位论文。 本学位论文属于： 保密口，在 年解密后适用本授权书。 不保密囤。 ( 请在以上方框内打“ ) 论文作者签名：望i 蛰 ：日期：2 卿年7 月7 e t 船老师签名：二弛雌吼刎年7 月7 日 前苦 11 高温噬菌体研究进展 1 前言 噬菌体( b a c t e r i o p h a g e ) 于1 9 1 7 年被发现是一类侵害细菌( 包括放线菌、 真菌和原核生物) 的病毒，又称细菌病毒( b a c t e r i a l v i r u s ) 删。噬菌体在自 然界中分布广泛，空气、水中、土壤或生物体内都可存在。自然界中，几乎所有 的细菌都有相应的噬菌体，一般其结构主要由核酸( d n a 或r n a ) 和蛋白质组成口j 。 根据噬菌体对其宿主菌的作用方式，可以将噬菌体分为两类即烈性噬菌体 ( v i r u l e n tp h a g e ) 和温和噬菌体( t e m p e r a t ep h a g e ) h 叫。烈性噬苗体( v i r u l e n t p h a g e ) 改变宿主的性质，产生大量的新噬菌体，最后导致菌体裂解死亡：温和 噬菌体( t e m p e r a t ep h a g e ) 可因生长条件的不同，既可以引起宿主细胞的裂解 死亡，又可将其核酸整合到细菌的染色体上，使细菌细胞继续生长繁殖，并被溶 原化。根据噬菌体核酸的组成可以将噬菌体分为单链r n a 噬菌体，双链r n a 噬菌体 单链d n a 噬菌体，双链d n a 噬菌体p l 。多数r n a 噬菌体的r n a 为线状单链，少数为线 l t 眦 mm ；2d ，* * l 枣嘏1 t 。： l ；舻2 。2 8 。囊嚣下黧 图1 噬菌体的核酸组分( 资料来源：m a d i g a n ，m a r t i n k o ，p a r k e rb r o c k b i o l o g yo f m i c r o o r g a n i s m s m p e a r s o ne d u c a t i o n ，2 0 0 8 ，t w e l r he d i t i o n ) f i 9 1t h e n u c l e i ca c i d o f p h a g e 深海热液区嗜热菌噬菌体g v e 2 与宿主相互作用的分子机理研究 状双链，且分成几个节段【3 】。如图l 所示有尾噬菌体的核酸均为线状双链d n at 7 ， t 4 ，入噬菌体，无尾噬菌体的核酸可为环状单链d n a 或线状单链r n a 女h m l 3 ，p h i x l 7 4 为线状状单链d n a 病毒。噬菌体的d n a 同样由核苷酸组成，某些噬菌体的基因组含 有异常碱基，如某些枯草芽胞杆菌噬菌体的d n a 无胸腺嘧啶，而代以尿嘧啶、5 一羟甲基尿嘧啶等，大肠埃希菌t 偶数噬菌体无胞嘧啶，而代以5 一羟甲基胞嘧啶 与糖基化的5 一羟甲基胞嘧啶。利用这些碱基可成为噬菌体的天然标记【8 - 9 。 目前分离的噬菌体大多是常温噬菌体，自k o s e r ，s a 从嗜热细菌b a c i l u s 中分离到第一个高温噬菌体后，人们陆续从b a c i l l u s ，t h e r m u s 中分离到多种 高温噬菌体【10 1 。到现在为止，分离的高温噬菌体较少主要有8 个古菌属和3 个细菌属【l 卜1 2 1 。高温噬菌体与常温噬菌体一样，是一类具有遗传、复制和进化 的生物实体，且具有化学大分子的属性；是一类既具有细胞外的感染性颗粒形 式，又具有细胞内的繁殖性基因形式的独特的生物类群，宿主高温的特性决定 高温噬菌体具有独特的生化化学和分子生物学特性。 研究高温噬菌体，通过与常温噬菌体对比，可以从本质上解释高温与常温 的生命现象与区别。它们可以作为一种模式系统来研究热液区生物的生物化学 及分子生物学特性，而且它们还影响生物地球化学和生态系统进化过程，包括 营养循环、生物分类、生物种群结构、生物进化、遗传转换等【1 3 - 17 1 。另外，高 温噬菌体在分子生物学领域和医药学等领域都具有广阔的应用前景。目前高温 噬菌体的应用前景得到大家的关注，如利用高温噬菌体构建表达载体，从噬菌 体中获得高温酶如核酸酶，r n a 连接酶等【1 8 9 1 。 1 2 噬茵体裂解机制 大多数噬菌体导致宿主细胞裂解，丝状噬菌体f l 和m 1 3 等并不裂解细菌。裂 解是烈性噬菌体生活周期中重要的一步，就是水解细菌细胞壁释放成熟颗粒。按 照是否需要细胞壁水解酶，噬菌体裂解系统大致有两种基本模式【2 0 埘1 ：一是单链 d n a 噬菌体p h i x l 7 4 矛n 单链r n a 噬菌体m s 2 等小噬菌体的不依赖噬菌体溶菌酶的裂 解系统：二是入、t 4 等双链d n a 大噬菌体的依赖噬菌体溶菌酶的裂解系统。 到目前为止，除了入，t 4 ，p h i x l 7 4 ，m s 2 署d t 7 等噬菌体和其亲缘噬菌体裂解系 统外，其他噬菌体的裂解系统的研究较少【2 2 班】。单链d n a 噬菌体p h i x l 7 4 只有一个 2 l 前言 裂解基因e ，其产物没有细胞壁水解酶或其他活性。r n a 噬菌体根据基因组的大小 和遗传结构，r n a 噬菌体裂解基因可分成四类，裂解基因已经明确的有i 类m s 2 f 2 和i 类q b ，i 类m s 2 f 2 是很少一部分细胞以出芽方式释放子代噬菌；i i i 类q b 噬 菌体，q b 噬菌体 2 4 1 有分别编码成熟蛋白( a 蛋白) 、外壳蛋白和复制酶的3 个o r f ， 缺失分析发现成熟基因( a z ) 裂解细菌。a z 蛋白的疏水性分析表明它没有跨膜区。 大部分双链d n a 噬菌体只有一种裂解途径即依靠细胞膜孔形成蛋白( h o li n ) s 基因和细胞壁水解酶( 1 y s i n ) r 基因【2 6 2 9 】。此裂解是细胞壁水解酶和小分子疏水性 穿孔膜协调作用引起的一种对细胞膜低聚反应的非特异性损伤。虽然h o l i n 和 l y s i n 等裂解蛋白大量表达，但是对数生长期和静止期宿主并不能被裂解，这说 明胞浆膜的组成和能量状态影响裂解过程【2 0 i 。 1 2 1 噬菌体裂解s r 基因簇 常温噬菌体入噬菌体研究最多，其s r r z 裂解基因簇 3 0 - 3 1 i 是大噬菌体裂解基因 的典型代表，由细胞膜孔形成蛋白基因s ( h o l i n ) ，细胞壁水解酶( 转糖苷酶) 基因 r ( 1 y s i n ) 和基因r z 三个基因组成，他们由同一个启动子p r 启动转录【3 羽，其中基因 r 和s 是噬菌体裂解宿主所必需的。蛋白r z 是一种较为保守的膜蛋白，其n 端序列 与分泌性信号肽很像，功能目前还不清楚，可能是一种肽内切酶，似乎只有当培 养基中含过多二价阳离子时才需要，并不是每个噬菌体都含有r z 基因【3 3 1 。 表1 常温与高温噬菌体的裂解基因 t a b l e1 t h el y s i sg e n eo ft h eb a c t e r i o p h a g e p h a g e h o s t t ( o c ) l y s i sg e n e p u t a t i v eh o l i n g ；p u t a t i v e s a l l s f i 2 1 a 1 l8 b l l 2 8 6 g a m m a b c j a l c l a c t o b a c i l l u ss a l i v a r i u s s t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i l u s l i s t e r i am o n o c y t o g e n e s l a c t o c o c c u sl a c t i s b a c i l l u s b a c i l l u sc l a r l d f 1o 一3 0 l y s i n ；l y s i n ； 3 7 1 9 5 2 2 5 4 0 l o 3 0 4 2 4 8 3 0 6 0 p e p t i d et o x i nf s t l y s i n h o l i n ；l y s i n h o l i n ；l y s i n h o l i n ；l y s i n h o l i n ；l y s i n h o l i n ；l y s i n 通过比较噬菌体的基因组【3 4 4 3 1 ，发现许多噬菌体都有类似的s r 基因簇，相应的功 能，大小和位置关系相似，且发现无论在常温还是高温噬菌体几乎都是这两个基 因在作用，导致宿主裂解。如表1 所示，高温噬菌体b a c i l l u sg a m m a d 9 1 ， 3 深海热液区嗜热菌噬菌体g v e 2 与宿主相互作用的分子机理研究 s t r e p t o c o c o u s t h e r m o p h i l u ss f i 2 1 4 1 - 4 4 ，b a c i l l u sc l a r k i ib c j a l 3 8 。4 0 】常温噬 菌体l i st e r i a m o n o c y t o g e n e sa118 3 4 1 ，l a ct o c o c c u s 1 a ct i sbil 2 8 6 p 3 - 4 5 】，都 是只有h o l i n 和l y s i n 两个裂解蛋白。 1 2 2 噬菌体细胞壁水解酶( i y s i n ) 噬菌体细胞壁水解酶是双链d n a 噬菌体所特有的在病毒复制晚期合成细胞壁 水解酶。在噬菌体内，由于细胞壁水解酶( 1 y s i n ) 自身没有依赖的蛋白转运系统 所需的分泌信号肽序列【4 6 弗】，除非发生胞浆膜的损伤，否则不能单独通过细胞膜， 因此以折叠的形式存在于胞浆内，细胞质中细胞壁水解酶的增加不会导致细菌的 裂解。没有膜孔蛋白( h o l i n ) 的功能时，细胞壁水解酶( 1 y s i n ) 产物仍具有完全 活性，以未加工的形式在细胞内累积5 0 规1 。有报道阐述噬菌体裂解酶在翻译修饰 的阶段不加上一个信号肽的原因：在噬菌体晚期蛋白表达阶段，如果细胞壁水解 酶立即释放，将会破坏其衣壳的完整性，导致噬菌体的生活周期缩短到不可承受 的程度【2 0 1 。 研究表明，所有噬菌体裂解酶在结构上具有相似性，即含有2 个结构域，一是 比较保守的n 端酶活性催化区和差异较大的c 端特异性结合区【5 3 - 5 8 1 。如图所示，按 照n 端催化区对底物的特异裂解位点，可将裂解酶分为五大类，胞壁质酶 卜删斟 g i c n a c m u r n a e - - 图2 噬菌体编码的细胞壁水解酶作用位点( 资料来源：y o u n gr b a c t e r i o p h a g e l y s i s ：m e c h a n i s ma n dr e g u l m i o n m i c r o b i o lr e v ，19 9 2 ( 5 6 ) ：4 3 0 - 4 81 ) f i g 2p o i n t so fa t t a c ko fp h a g e e n c o d e da n da u t o l y t i cm u r e i nd e g r a d i n ge n z y m e s ( n a c e t y l m u r a m i d a s e so rl y s o z y m e s ) ，糖基转移酶( 1 y t i c 4 霉岬叶 m。一一一 l 前言 t r a n s g l y c o s y l a s e s ) ，乙酰葡糖胺糖苷酶( e n d o b n a c e t y l g l u c o s a m i n i d a s e s ) ， 这三个都是断开糖苷键；肽链内断酶( e d o p e p t i d a s e s ) ，水解肽交联桥；酰胺酶 ( n - a c e t y l m u r a m o y l l a l a n i n ea m i d a s e s ) ，断开水解n 一乙酰胞壁酸和l 一丙氨酸 之间的酰胺键汹洲鞫3 。在五大类中，胞壁质酶和酰胺酶比较常见。 一般，噬菌体编码的每个酶都只能行驶一种水解酶性质。但是目前发现有4 种细胞壁水解酶是双功能的，并且两个功能是独立的。例如噬菌体n c t cl1 2 6 1 编码的水解酶和s t r e p t o c o c c u sa g a l a c t i a e 噬菌体b 3 0 编码的水解酶具有胞壁 质酶和内肽酶性质1 ，s t a p h y o c o c c u sw a r n e r im 噬菌体p h i 硼i y 编码的水解 酶和sa g a a c t i a e 噬菌体p h i1 1 编码的水解酶具有酰胺酶和内肽酶性质h 羽， 另外如t 7 溶菌酶，它不是一个胞壁质酶而是酰胺酶，除了有胞壁质酶活性外，还 能结合t 7r n a 聚合酶，并且抑制基因的转录。 大多数噬菌体编码的细胞壁水解酶应用于异于宿主种属的细菌，显示为狭窄 的溶菌范围，主要是归功于三个明显特征，一是独特的细胞壁断开键，二为专一 的细胞壁复合物激活酶活，三是水解酶上特殊的细胞壁结合域识别底物泓嘶1 。许 多发现表明细胞壁水解酶( 1 y s i n ) 的作用范围比噬菌体的宿主范围要广，但也局 限于同属细菌，且发现a m i d a s e s 具有较广的裂解范围。因为n 一乙酰胞壁酸和l 一 丙氨酸键广泛存在细菌的细胞壁上。事实上， e n t e r o c o c c u sf a e c a i s 噬菌体 p h i1 编码的细胞壁水解酶p l y v l 2 不仅可以裂解ef a e c a l i s ，ef a e c i u m 并 且可以裂解s t r e p t o c o c c u sp y o g e n e s ，b 组和c 组的s t r e p t o c o c c i ，还有s a u r e u s 。l a c t o b a c i l l u sh e l v e t i c u s 噬菌体p h i 0 3 0 3 编码的细胞壁水解酶m u r - l h 可以溶解1 0 种不同种类的细菌呻啪1 。 细胞壁水解酶的高亲性与种属特异的细胞壁糖基有关，而后者常常是细菌存 活的必要成分，因此细菌难以产生对细胞壁水解酶( 1 y s i n ) 的抗性。噬菌体裂解 酶对细菌的高特异性，不影响无害或有益的人体寄生菌，裂解酶作为新型抗菌药 物具有一定的优势。s c h u c h 等用y 噬菌体的基因工程细胞壁水解酶( p i y g ) 对碳 疽杆菌( 曰a c j j 姗a n t h r a c i s ) 杀灭作用的研究，让人们看到了噬菌体细胞壁水 解酶用于细菌性疾病治疗的美好前景嘟3 。肺炎链球菌( s t r e p t o c o c c u sp n e u m o n i a e ) 是一种人类的重要病原体之一。l o e f f l e r 实验组在重组表达肺炎链球菌噬 菌体 捌坶热液嗜热菌噬菌件g v e 2 与宿主相互作用的分子机理研巍 d p 2 1 的细胞壁水解酶p a l ，发现1 0 0 u 的溶壁酶p a l 可在3 0s 内使1 5 株肺炎链球苗的 图3 溶壁酶处理1 5s 后的a 族链球菌电镜照片( 资料来源：n e l s o n d l o o m i s l 札 a lp r e v e n t i o na n de l i m i n a t i o no f u p p e r r e s p i r a t o r yc o l o n i z a t i o no f m i c eb y g r o u p a s t r e p t o c o c c i b yu s i n ga b a c t e r i o p h a g e l y r i ce n z y m ep n a s ，2 0 0 1 ( 9 8 ) ： 4 1 0 7 - 4 1 1 2 ) f i g3m i e r o g r a p ho f g r o u p a s t r e p t o c o c c i t r e a t e d w i t h l y s i n c f u 降低i i 0 1 ，其中包括3 株对青霉素有强烈抗性的菌株咿】。这说明利用噬苗 体细胞壁水解酶，可帮助我们克服细菌越来越强的抗药性问题。如图所示，通过 体外添加细胞壁水解酶处理后的肺炎链球菌，用电镜观察，发现细胞质从单个细 胞壁破孔中流出，也就是说，溶壁酶在细胞壁上造成一个破孔就可以使细菌死亡 【7 0 1 。越来越多的试验表明噬菌体在自然界中含量丰富，通过表达细胞壁水解酶， 可以使之成为与细菌斗争中的胜利者。肉毒梭状芽孢杆菌( c l o s t r i d i u m b o t 以j 舢mj 、鼠疫耶氏菌ry e r s n s a p e s t j 砂、炭疽杆菌rba c i l i u s a n t h r a c j s j 、结核杆菌y c o b a c t e r y u mt u b e r c u o s i 、伤寒沙门氏苗( s a l m o n e l a t y p h ij 、引起莱姆病的伯氏疏螺旋体rbo r r e l i a b u r g d o r f e r l ) 等重要 的病原体都有相应的噬菌体，可用于开发相应的噬菌体水解酶抗菌药物。 日前，有些常温噬菌体的裂解酶的结构得到深入研究，如t 7l y s o z y m e ，肺炎 球菌自溶酶l y t a ，肺炎球菌c p i 噬菌体裂解酶c p l l l 7 ”。其中肺炎球菌c pi 噬 菌体裂解酶c p l i 作为典型的溶菌酶，l y t a 是酰胺酶的代表。l y t a 通常以二聚 前茸 体的活性形式存在 7 9 4 1 0 1 ，其二聚体化与催化活性的调节是密切相关的；当其缺乏 c 端尾巴时，解聚为单体，催化活性也降低9 0 9 6 之多。l y t a 的单体由于b 螺旋 梯的拓扑化，其n 端是完整的，c 端也保持其完全的折叠，其催化活性降低的最 可能原因是催化亚单元的相对位置的排列不合适。 1 2 3 细胞膜孔形咸蛋白( h o l jn ) h o l i n 是个膜蛋白，基因一般较小，可以想象检测一个小的、致死的、低浓 度的、并且相对来说无免疫的蛋白比较难，在 噬茵体必要基因中，h o l i n 是最后 一个被鉴定出来的口o i 。当致死的洞形成时，通过纯化膜蛋白的方法从内膜获得 h o l i n 蛋白，发现只有1 0 2 到1 0 3 十分子存在l 啦i 。细胞膜孔形成蛋白( h o l i n ) 是噬菌 体感染的晚期阶段合成的小分子极性跨膜蛋白，可以导致细菌胞浆膜非特异的损 伤，形成稳定的跨膜孔，使细胞膜对折叠的噬菌体l y s i n 的通透性提高，细胞壁 水解酶正是通过这个孔到达细胞壁肽聚糖层发挥作用。h o l i n 基因缺陷将导致裂 解完全丧失或效率下降。h o l i n 损伤细菌细胞膜的过程也是噬苗体溶菌周期自我 调节过程，h o l i n 可以控制裂性噬菌体的感染周期的长短，使宿主菌在最佳时间 获得裂解，被称作噬菌体的“时钟”8 ”。 h o l i n 蛋白不存在种属特异性，是个致死基因，h o l i n 必须至少含有一个最小 长度为1 6 氨基酸的疏水性结构域才能实现完全的跨膜脂双层的功能，直到第一次 用s b 一牛乳糖标签表达h o l i n 融合蛋白井获得其抗体，发现h o l i n 可以多样的口“。 l a m b d as 一 + - + + - ，+ f ”紫“嗍“”势哿”o 紫“黜“鼍1 “嗡1 ”嘴” 2 1s 匠茹i 黜： w 嚣 蟠“删：函恻驯“i g 眦“菡盎；矗盎 1 1 02 0椰 0 5 0 6 07 0 m - 一一t t e t t 一t t ” 图4h o l i n 序列的特征( 资料米源：g r i i n d l i n a ，b l i i s i u ，e la l b i o c h e m i c a la n d g e n e t i c e v i d e n c e f o r t h r e e t r a n s m e m b r a n e d o m a i n s i n t h e c l a s s ih o l i n , s j b i o l c h e m 。2 0 0 0 ( 2 7 5 ) ：7 6 9 7 7 6 ) 7 挥海热液区嗜热菌噬苗体g v e 2 墒主相作用的分丁机理研究 f i g4 f e 缸u r e so f t h ep r i m a r ys e q u e n c eo f h o l i nf r o mb a c t e r i o p h a g exa n d2 1 大多数h o l i n 能被划分成两个或三个被转折区隔开的跨膜区。按照一般结构，将 革兰阴性菌噬菌体的细胞膜孔形成蛋白分成2 个型，即i 型、1 1 型。i 型h o l i n 一般有9 0 1 2 5 个氨基酸，推测有3 个跨膜区，近c 端的跨膜区疏水性不是很 强。i i 型h o l i n 一般6 5 8 5 个氨基酸，其n 末端和带电很强的c 术端都有在胞 浆中存在的趋势，两个成膜结构域可能以反向平行折叠的形式镶嵌在膜脂双层 中。如图4 所示，大肠杆菌噬菌体 ，噬菌体2 1 分别是i 型、型h o l l n 的 典型代表。i i 型h o l i n 两结构域之间的连接结构为带负电或中性的氨基酸 8 6 - $ 7 i 。 在许多噬苗体中h o l i n 存在两个起始位点，根多h o l i n 蛋白具有被一或两 个密码子( 至少有一个是精氨酸或赖氨酸) 隔开的双甲硫氨酸启动子区，编码的 两个蛋白仅差两或三个氨基酸残基，如图5 所示 噬菌体和大肠杆菌噬菌体 2 1 都有双起始位点。存 噬菌体最初、最简单的预测双起始位点模型是消除 m e t l 起 图5h o l i n 烈起始位点的基序( 资料来源：g g i n d l i n a ，b l i i s iu ，e ta lb i o c h e m i c a l a n dg e n e t i ce v i d e n c ef o rt h r e et r a n s m e m b r a n ed o m a i n si nt h ec l a s sih o l i n ， s jb i o c h e m 2 0 0 0 ( 2 7 5 ) ：7 6 9 7 7 6 ) f i g5 d u a l - - s t a r t m o t i f s i nh o l i n g e n e s 始密码了发现并没有抑制裂解，反而增加了h o i n 的致死性。根掘预测，把m e t 一1 变成l e u - - l ，发现裂解更明显，而且没有增加s 吣5 的表达水平。证明翻译 起始位点在m e t 一1 ，在氨基酸残基上预测长度记作s m ，不是有作用的h o l i n 基因产物，而是h o l i n 作用的非致死性抑制剂。真正的致死性h o l i n 基因的起 l 前言 始密码子是m e t 一3 ，产物记作s 1 0 5 ，是h o li n 或l y s i n 的效应因子。m e t l y s m e t 履行的是抑制裂解功能，即s 1 0 7 只是比s 1 0 5 多一个正电荷。同样在大肠杆菌噬 菌体2 1 中发现这种机制也存在，但是多余的氨基酸是a r g ，t y r ，这表明只要 是末端存在正电荷就可以履行抑制裂解的功能。因此，对于入和2 1 噬菌体的 进化双起始位点模型既存在不一致性，也存在同一收敛的形式。这表明在进化 中，双起始位点模型的出现面临很大的选择压力。据研究因为较大的蛋白n 端 额外的带正电的氨基酸所影响导致起功能是抑制裂解【8 3 ，8 5