（植物学专业论文）拟南芥cdf家族基因atmtp6的功能研究.pdf

摘要 c d f 蛋白家族是最近发现的一个阳离子转运蛋白家族，在维持金 属动态平衡和耐受方面起很重要的作用。拟南芥基因组测序完成后， 序列分析表明拟南芥c d f 家族至少由1 2 个成员构成，命名为 爿埘即卜蜴本研究克隆彳删7 阳并初步鉴定其功能。彳删7 阳位于第 二条染色体上，编码一个含有4 7 l a a 的蛋白质，结构分析表明其具有 c d f 家族的一些共同特征，如c 端有一个c e 功能域、n 端有一段信号 序列，但与已鉴定的成员不同的是它只含有五个跨膜区。本研究包括 克隆、鉴定生化及生理功能、描述亚细胞定位，并取得了以下结果： 1 通过r t p c r 克隆爿删7 m 测序结果显示其序列与a g i 预测 的序列完全一致。将彳埘7 阳基因的c d n a 构建至原核表达载体 p t r c 9 9 a ，重组载体转化大肠杆菌突变株k a m 3 ，平板上的结果表明， 此基因的表达使细菌对z n ”、e t b r 更加敏感。 2 通过与绿色荧光蛋白( g f p ) 融合，在共聚焦显微镜下显示此 蛋白定位于细胞器上，此结果与在线软件p s o r t 的预测结果比较一 致，且预测a t m t p 6 很有可能定位于线粒体膜上。 3 为了研究爿洲7 阳的生理功能，过表达彳彤7 阳的转基因拟南 芥、互补转基因拟南芥、纯合t d n a 敲除突变体和野生型四种材料同 时在正常或胁迫的平板上进行表型观察，结果显示：过表达植株对 e t b r 更加敏感，可见a t m t p 6 可能从细胞质转运e t b r 进入线粒体中， 引起线粒体内e t b r 的积累从而对细胞造成损害；四种材料生长于含 不同浓度z n 2 + 的平板上时没发现什么表型；过表达植物的种子种皮颜 色较浅且尺寸较小，可见a t m t p 6 可能与色素转运有关；在含有甘露 醇的高渗平板上，过表达植物种子的萌发很明显被抑制，可见a t m t p 6 与渗透胁迫有关；在正常生长条件下，过表达植物开花要明显早于其 它三个材料，表明a t m t p 6 可能参与调控或确定植物的开花时间。 关键词：a t m t p 6 ，c d f 家族，拟南芥，突变体 a b s t r a c t c a t i o nd i f f u s i o nf a c i l i t a t o r ( c d f ) p r o t e i n sa r ear e c e n t l y d i s c o v e r e df a m i l yo fc a t i o ne f f ll l xt r a n s p o r t e r st h a tm i g h tp l a y a ne s s e n t i a lr 0 1 ei nm e t a lh o m e o st a s i sa n dt o l e r a n c e a f t e r a r a b i d o p s i sg e n o m i cs e q u e n c i n g ， n ol e s s t h a n1 2g e n e so fc d f f a m i l ya r ei d e n t i f i e da n dn a m e d 彳7 ) 吖一2t h i ss t u d yc l o n e d 爿南7 ) d 疗a n dp r i m a r i l yc h a r a c t e r i z e dt h ef u n c t i o n 爿硝7 阳 l o c a t e so nt h e s e c o n dc h r o m o s o n i ee n c o d i n ga4 7 1 a ap r o t e i n + s t r u c t u r a la n a l y s i sr e v e a l st h i sp r o t e i nh a st h eg e n e r a lc d f c h a r a c t e r i s t i c s s u c ha sac t e r m i n a lc a t i o ne f f l u xd o m a i na n d a nn t e r n l i n a ls i g n a t u r es e g m e n t ， b l i ti th a so n l yf i v e t r a n s m e m b r a n e ( t m )d o m a i n s t h i ss t u d yd e s c r i b e sc h ec l o n i n g ， c h a r a c t e r i z a t i o no ft h eb i o c h e m i c a la n dp h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n ， l o c a l i z a t i o no ft h i sg e n e w eh a v eg o tt h ef o l l o wr e s u l t s 1 t h ec d n ac l o n i n gw a so b t a i n e db yr t p c r ， a n dt h e n s e a u e n c e d i ts h o w e dt h ei d e n t i c a ls e q u e n c ew i t ht h a to ft h e d r e d i c t i o nb va g i t h e n c d n aw a ss u b c l o n e dt op t r c 9 9 aa n d t r a n s f o r i e dt ot h eec d jm u t a n tk a m 3 t h er e s u lt so nt h es o l i d m e d i as h o w e dt h a tt h ee x p r e s s i o no f 月f 彤7 f 日m a d et h ec e l l sm o r e s e n s i t i v et ot h ee x c e s s i v ez n - ， e t b r 2 m e a n w h il e ，t h et r a n s g e n i cp l a n t st r a n s f o r m e dw jt ht h e a t m t p 6 ：g f pf u s i o nc o n s t r u c t i o n w e r ed e t e c t e dw i t ht h e c o n f o c a lf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p e t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a t a t m t p 6l o c a t e di nt h em e m b r a n eo fi n t r a c e l l u l a ro r g a n e l l e ， i d e n t i c a lw i t ht h ed r e d i c t i o no fa t m t p 61 0 c a t i n g i nt h e m e m b r a n eo fm i t o c h o n d r i ab yt h ep s o r ti n t e r n e tp r o g r a m m e 3 t oi n v e s t i g a t et h ep h y s i 0 1 0 9 i c a lf u n c t i o no ft h i sg e n e ， o v e r e x d r e s s i o na n dc o m p l e m e n t a t i o nt r a n s g e n i cp l a n t sw e r ea l s o i i c 。n s t r c t e d p h e n o t y p e so f t h e s et r a n s g e n i cp l a n t s ， t o g e t h e r w i t ht d n ak n o c k o u tm u t a n t a n dw i l dt y p ea r a b j d o p s 城 w e r e o b s e r v e ds i m u lt a n e o u s l yu n d e rn o r l i l a l o rs t r e s sc o n d l t 1o n s jh e a r a b i d o p s i so v e r e x p r e s s i o nli n ew a s m o r es e n s i t i v et oe t b r l t s e e m st h a ta t m t p 6 c o l i l dt r a n s p o r te t b rf r o mc y t o s o l t ot h e m i t o c h o n d r i a r e s u l ti n t h ea c c u m u l a t i i o n o fe t b ri n t h e m i t o c h o n d r i a ，a n df i n a 王1yc a u s e dd a m a g eo ft h e c e l l s b u tt h e f o u rl i n e sg r o w i n gi nt h ev a r i o l i sc o n c e n t r a “o n so fz n 2 + d i d n o t s h o w e da n yp h e n o t y p e t h es e e d so fo v e r e x p r e s s l o n ll n ea r e s l i l a l l e ri ns i z e ， a n dt h ec o l o ro ft h es e e dc o a t sa r eb n g h t e r s u g g e s t i n ga t m ，1 1 p 6i sr e l a t e dt ot h et r a n s p o r t i n g o i p l g m e n t s w 1 1 e nt h ef o u r1 i n e sa r eg r o w na tt h ev a r i o u sc o n c e n t r a u o n s o t m a n n i t o l ， t h es e e dg e r m i n a t i o no et h eo v e r e x p r e s s l o nl l n e w d s o b v i o u si n h i b i t e di n d i c a c i n ga t m t p 6i sr e l a t e d t ot h eo s m o t 1 c s t r e s s a tn o r m a lg r o w t hc o n d i t i o n s ， t h eo v e r e x p r e s s l o ni l n e s f l o w e r s u c he a r l i e r ， s u g g e s t i n gt h i sg e n et a k e s p a r t1 n c h e r e g u l a t i o no r i d e n t i t yo ff l o w e r i n gt i m e k e yw o r d s ：a t m t p 6 ， c d l 7f a m i l y ， a r a b i d o p s i s ， m u t a n t i 丌 c d f g e n b a n k d e p c d m s o g f p e d t a e t b r ( e b ) p c r n c b i t m c 0 1 0 i p t g 6 一b a p r t p c r a a a n l d k a n g e n t a 英文缩写词简表 c a t i o nd i f f u s i o nf a c il i t a t o r 基因数据库 二乙基焦碳酸盐( d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e ) 二甲基亚砜( d i m e t h y ls u l f o x i d e ) 绿色荧光蛋白( g r e e nf h i o r e s c e n tp r o t e i n ) 乙二胺四乙酸二钠 溴化乙锭( e t h i d i u mb r o m i d e ) 聚合酶链式反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ) 美国生物技术信息中心( n a t i o n a lc e n t e rf o r b i o t e c h n o l o g yi n f o r m a t i o n ) 跨膜( t r a n s m e m b r a n e ) c o l u m b i a 生态型( c o l u m b i ae c o t y p e ) i s o p r o p y l b d t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e 6 一苄氨基嘌呤 r e v e r s et r a n s c r i p t i o n p c i 氨基酸( a m i n oa c i d ) 氨苄青霉素( a m p i c i l i n ) 卡那霉素( k a n a m y c i n ) 庆大霉素( g e n t a m y c i n ) 拟南芥c d f 家族基因月胛阳的功能研究 第一章引言和文献综述 转运蛋白除了作为重要的药物抗性决定因子以外，还可在生物修 复过程中起作用，一种普遍的植物金属修复途径就是通过分离或者改 造植株，使之具有积累目标金属的能力。植株在完成上述过程不仅需 要吸收金属，还必须将其储存起来，植物中很重要且普遍存在的两类 转运家族为z r t 类i r t 类蛋白( 合称为z i p 蛋白) 家族及c d f 家族” “。这些家族成员参与金属的超量积累及植株对必需或有毒两类金属 的处理，z i p 家族在对金属如z n “的吸收中起作用，而c d f 蛋白则可 参与液泡螯合及从胞质转出金属离子等。 无论是自然的还是工程植株，在超量积累中常见的问题就是导致 低的生物产量，为了获得有意义且大规模的植物修复，必须发展高生 物产量的系统，理沦上一个达到这个目的的方法是：在能生产高生物 产量的植物中提高目的金属转运蛋白的数目。“。 用此预测的方法就需要彻底了解物质与蛋白相互作用的碱基， c d f 蛋白是做这类分析比较理想的蛋白，因为它们在生物所有界中比 较普遍，所以通过不同界的序列相互比对，在筛选保守或可能与金属 结合的残基方面更有意义。更长远地看，这些蛋白的相似性使很少鉴 定过的生物体中的c d f 蛋白非常信赖地在模式系统中进行鉴定“1 。甚 至，虽然砒是来自酵酒酵母，但可以在大肠杆菌中鉴定，即可以 在不同领域的模型中进行功能鉴定”1 。物质结合和转位的原理很有可 能在c d f 家族中是相似的，在相对比较容易研究的细菌系统中得到的 知识可以直接应用在植物或动物c d f 蛋白研究上，但是因为c d f 物质 结合位点的相似性和特征到最近才开始不断地鉴定，这些推测的可靠 性仍然不是很确定。 因为c d f 蛋白在序列和大小方面都会不同，所以关于此家族蛋白 的一些大致的规则经常会有个别例外”“。迄今为止，大部分已经鉴 定的c d f 蛋白能转运z n “，但部分同时能转运其它二价阳离子，包括 c o 、m n 、f e 、c d 、n 产“8 1 。在大多数细菌成员中，c d f 蛋白与金属 硕士学位论文 耐受或动态平衡有关，主要通过从胞质排出离子进入外周胞质或细胞 外“”“。一个典型的例子就是第二个被鉴定的c d f 蛋白f i e f ( 来 自大肠杆菌，曾命名为y i i p ) ，还有c h 3 4 中它的同源蛋白与减少细 胞内离子聚集有关，可能是第一个鉴定的离子排出系统“”1 。然而， 细菌c d f 蛋白可能不仅仅作为金属转运蛋白，疗驴类似基因o 彳编 码一个能抑制双氯苯双胍己烷的蛋白”。 在酵母sc 盯e 叮s 妇e 中，z r c l 和c o t l 有相同的耐受功能，它 们从细胞质中转运金属进入液泡中”“3 ，第三个酵母中的蛋白m s c 2 ， 能特异地调节从核内排出z n 2 + 进入细胞质中”3 。研究最透彻的植物例 子是a t z a t ( 曾命名为z a t l p ) “，与z r c l 一样，它从细胞质转运 z n ”进入液泡中。 哺乳动物中所有鉴定的c d f 成员都特异性地转运z n ”，所以这些 蛋白命名为z n ”转运蛋白x ( z n t x ) ，x 为蛋白被发现的先后顺序。这 些蛋白可能与生存依赖的金属动态平衡之间关系不是太大，可能与 z n ”穿梭进入细胞内和分泌腺泡更相关，它们应该有一个自我平衡组 件“”1 。比较典型的例子是z n t 5 ，它定位在胰腺口细胞的分泌腺泡 上，可能为合成胰岛素晶体提供所必需的z n ”1 。在老鼠中，z n t 4 可 能从腺组织中传输微量z n ”进入乳中，如果它缺失，当供应的z n 2 + 不 足时，会产生致命的乳症状即乳枯竭“。z n t l 定位在质膜上，从宿 主组织细胞中排出z n ”“，更有趣的是，与z n t l 比较靠近的来自 白即d 砌a 6 以f 如e 号船力s d 的蛋白c d f l ，在r a s 致癌基因信号途径中 起调节作用“圳。 1 1c d f 蛋白的结构特征 c d f 蛋白作为一类与膜结合的蛋自在很多生物体中都发现有它的 存在。“”1 ，随着研究的不断深入，研究者发现此家族蛋白都表现出 一些共同的特征：包括6 个预测的跨膜区( t m ) ；n 一端有一段特 征信号序列；含有一个c 端的离子排出功能域( c ed o m a i n ， p f a m 0 5 1 4 5 ) ；真核生物成员的第四、第五个跨膜区之间通常有一 段比较大的、富含组氨酸的胞质序列。 拟南芥c d f 家旅基因f 4 ，7 珊的功能研究 疏水图和实验数据表明c d f 蛋白一般含有6 个t m ”1 。把如嘭恸鲥 翻译后融合在来自脚托i j - 曲m 力s c h ：3 4 的c z c d 蛋白序列的不同位 置，氨基端的四个跨膜序列得到了确定”。一个类似的实验，用半胱 氨酸特异的生物素标记f i e r 的内一t m 螺旋，从实验数据司见有六个 t m 。此外，圆形二向色性分光镜分析f i e f 和c z c d 表明它们含l l n o l q 一螺旋内容物，超过5 0 ，支持c d f 蛋白是螺旋的假说。 然而三级结构还处于观察当中，已经有些个例揭示其四级结构。 ec o _ f 中的f i e f 蛋白设想为一个同型二聚体结构”。这些分析是基 于一项由h p l c 大小分离和光吸收相结合的技术，这些技术有助于排 除大小和蛋白溶解所必需的胶态结构的影响。已有一系列的去垢剂用 来制造这些胶态，但是，据统计均衍生分子量为6 8 k d a 的相同蛋白， 是疗驴基因产物的两倍”1 1 。此外，杨树杂交后代中克隆的c d f 锌转 运基因尸 舰能在体外形成同型寡聚体，并且能被d t t 所干扰， 表明二硫键在它们的形成中有重要的作用阻“。实际上，通过h g 离子 调节的c ”位半胱氨酸交联，f i e f 二聚体能持续稳定地存在，然而， 目前还没有任何数据表明这些化学键在体内出现，二聚体形成的可能 性同样表现在拟南芥爿f 村妒，基因中。 图1 1z i p 和c d p 蛋白结构特征 zip 和c d f 蛋白作为比较普遍的转运系统，在结构上存在一些区 别，如图卜1 ，z i p 和c d f ( z n t ) 成员其预测结构为：a z i p 推测有8 硕二l 学位论文 个跨膜结构域( 除了l i v 一1 亚家族为7 个t m ) ，在i 工i 和i v 跨膜区之间 的胞质区有一段富含组氨酸的可变区，z i p 蛋白将z n ”从细胞外或者胞 内各区室转运至细胞质；b c d f ( z n t ) 成员被推测有6 个t m d ，与z i p 蛋白类似，富含组氨酸的环存在于胞质，c d f ( z n t ) 蛋白将z n ”等从 胞质转运至胞外空间或胞内各区室，在两类家族中，富含组氨酸的结 构域结合锌离子等，而跨膜结构域则形成离子通道。 1 2c d f 蛋白的生理功能和底物特异性 1 2 1 细菌中的c d f 蛋白 目前所有细菌中的c d f 蛋白均被认为与z n ”或其它重金属阳离子 疏s t j 氧关。a e u t r o p h u sc h 3 4 ( 斥； 暴r a i s t o n i a 砸e t a i2 i d u r a n s ，1 黟k 名胎“f e 坩扬埘e a j 反删月sc h 3 4 。司) 菌株中的c z c d 蛋白是c d f 家族 最早发现的成员0 6 2 7 蚓，最先被认为是c z c c b a 高抗性系统的表达调控 因子。但是在无该高抗性系统作用的条件下，c z c d 也能对低水平 z n ”c o ”c d 2 f 耐受进行调节”1 ，c z c d 能降低胞质中作为c z c 表达诱导 物的一些金属的浓度。当c z c d 在大肠杆菌中异源表达时，受质子驱动 力作用能排出c d 2 + 、z n ”，但不能转运n i ”和c o ”。 虽然c d f 基因序列在许多细菌的染色体中被发现，但是其功能蛋 白仅在一些细菌中检测到。在屁c j 占s 曲 j 如中，如c 硅因与乃矧 脱氢酶基因在同一操纵子中“，突变体研究表明其与c o ”抗性有关”， c z c d 受质子动力和钾离子梯度的驱动，并且这些交换似乎是电中性 的，它的作用底物为z n “，c o “和c 矿1 。两类从sa 盯p u s 中得到的克 隆都包含一个决定性的c d f 编码基因和一个调节子，该c d f 蛋白命名为 z n t a ( 现叫r z c b ) 。“或c z r b 。2 i ，两类蛋白除九个位置外基本一致( 3 2 5 或3 2 6 a a ) ，sa e u s 中c z c d 蛋白与z n ”和c o ”耐受有关。拍e 埘u s 拍e 删a 印刖u s 中c d f 蛋白能调节z n ”和c a ”的抗性，但对c o ”的耐受没有 影响口。最近，大肠杆菌两个新的c d f 蛋白得到了鉴定：1 作为z n ” 抗性体系的z i t b ( 舒基因编码) 被鉴定。州，该蛋白受k 2 + 梯度和质子 动力驱动在胞内降低z n 2 + 积累“；2 另一推测的c d f 编码基因为较高深 的口；该基因表达受z n 2 + 的诱导，但该基因缺失并不导致z n ”抗性增 拟南芥c d f 家族基因蹦7 阳的功能研究 强，过量表达也无任何影响。，因此该蛋白功能目前并不明确。 目前为止，细菌中所提到的c d f 蛋白主要为z n ”c o ”c d 2 + 质膜输出 蛋白。趋磁性细菌在胞内特殊细胞器的作用下能对地磁场敏感，如磁 小体中含有f e 。o 。作为磁场感应物，m a i l l b 认为是定位于磁小体质膜上的 c d f 蛋白”，其功能可能是将铁转运至细胞器。磁小体类磁物质有可 能为远古来自火星的遗留物【。：”1 ”，这些物质有利于c d f 蛋白在另一个 星球的传播，尽管如此，磁场的存在还是趋磁性生物出现的首要条件， 因为火星磁场仅仅只有地球的三十分之一，当假定的火星生命的化石 被巨大的撞击作用释放出来时。，它们远远不够提供任何趋磁作用， 我们可能需要寻求其它更好的证据来证明生命体和c d f 蛋白来自另一 星球。 1 2 2 酵母中的c d f 蛋白 通常，每种细菌中只有一个或者几个c d f 编码基因，而在真核生 物中，c d f 编码基因的数目随酵母到动植物的进化而平行的增加，酵 酒酵母( 国c 拍a 阳埘阳p sc 盯p y j s 妇p ) 有五个c d f 编码基因。z r c l 能调节z n ”和c a “的抗性“，在同年最初被描述是细菌中的c z c d ；另一 酵母c d f 蛋白为c o t l ，调节c o ”抗性”“。但是z r c l 和c o t l 能够互补“， 两者在尼用e 招- - j 出瑚刀s 中的转运均能替代c z c d 。3 ，z r c l 和c 0 t 1 定位 于液泡膜并转运z n ”、c d ”、c 0 2 + 进入细胞区室起脱毒作用或者是以待 重新利用o “，这些解释了为什么在z n 2 + 缺乏的时候同时需要这两类 蛋白“”“。此外；。因为在z r c l 敲除的突变株胞质中并不能进行脱毒 作用，细胞反应在一个高的谷胱甘肽水平“，由于与c z c d 功能相似， 因此推测z r c l 的调节功能也间接与其转运功能相关。第三个 sc 跚叮s 也p 蛋白一m s c 2 ( y d r 2 0 5 w ) ，也与z n ”转运有关盯3 ，在不同 的突变株中，细胞核中z n ”的过量积累使膜片段增多，因此，也表明 m s c 2 在细胞核中z n ”动态平衡中的生物学功能“。sc p 坩叮s 拍e 中另 外两类c d f 蛋白与z n c d c o 离子转运无关，但是这两类蛋白m f t l 和m m t 2 ，可能与定位于线粒体膜的铁离子转运系统有关“，这些都 为c d f 蛋白可能转运铁离子提供了证据。 硕士学位论文 裂殖酵母( 力j 邪s a c 幽a 田阳e 占p o 砌吕) 中z r c l 类似的c d f 蛋白 z h f ，如同m s c 2 定位于内质网膜和核被膜中“，z h f 的缺失导致z n ”和 c o “敏感性增强，但是也导致c a “和n r 的耐受性增加，在胞质中，z n “、 c a ”、c o ”含量减少，通过植物生化合成的c a ”脱毒作用并未增加”“。 因此，这些蛋白可能与内质网和核中z n ”和c 0 2 + 的供应有关，由z h f 偶 然地转运c d 2 + 和n i 2 + 进入相同区室调节这些离子毒性的增加。 1 2 3 动物中的c d f 蛋白 迄今为止知道的高等动物内的c d f 蛋白都是z n ”转运系统的。z n t l 定位在细胞膜上，可能是一个z n ”排出系统“；相反地，z n t 2 转运z n ” 进入囊泡中，因此功能上可以与z r c l 和c o t l 相比较；z n t 3 同样转运 z n ”进入囊泡中，但专门进入s y n a p t i c 小泡中“；第四个动物c d f 蛋白 z n t 4 ，类似于z n t 3 与z n 转运有关，并且在大脑中表达量比较丰富，但 它同样在哺乳动物的上皮细胞中表达，与往母乳中排z n ”有关。；z n t 5 在胰腺l 细胞中转运z n ”进入分泌腺小粒中1 ，在造骨细胞的成熟方面 起重要作用，并且在维持与心脏传导系统有关细胞方面起作用瞄“，来 自老鼠和人的z n t 5 蛋白比其它c d f 蛋白的大小要翻倍。自从c z c d 和 z n t 4 发现二聚体以来“，另外个大的哺乳动物c d f 蛋白叫z t l l ( z n t l i k ep r o t e i n ) ，它定位在肾等的膜上”3 1 ；哺乳动物还有至少两 个c d f 蛋白z n t 6 和z n t 7 ”，z n t 6 可能从细胞质转运z n “进入高尔基体， 它由肾细胞内的z n ”的含量调节其表达水平“；最近在哺乳动物胰岛 腺分泌小泡中分离鉴定得到z n t 8 ，其定位于分泌小泡的细胞膜上，促 进z n ”从细胞质转运进入细胞内含胰岛素的小泡中，从而积累z n ”，它 与人的z n t 8 很高的同源性，达9 8 5 ”1 。这些结果表明哺乳动物中细 胞内z n ”的动态平衡由很多的z n t 一类蛋白调节，转运z n ”从细胞质进入 其它区室：( z n t l ，z n t 4 ) 如同细菌转运系统转出；( z n t 2 ，z n t 3 ，z n t 5 ， z n t 8 ) 象z r c l 、c o t l 转入小泡中；z n t 6 与z h f 转入高尔基体；然而， 卵母细胞中表达的z t l l 的实验结果表明c d f 蛋白可能与细胞内的z n ” 更新有关“。 1 2 4 植物中的c d f 蛋白 拟南芥c d f 家族基因埘7 阳的功能研究 植物中第一个鉴定的c d f 蛋白为z a t ，来自拟南芥“在高z n 2 + 环境 下，拟南芥中过表达z a t ( 爿埘聊) 增强z n 2 + 的耐受并且在根中显著地增 加了z n ”的含量。z a t 蛋白纯化后可以在几个微生物模式系统中作为 z n ”转运系统“。最新的研究表明，a t m t p l 定位于液泡膜上“，调节 拟南芥中z n ”的解毒，并促进叶片中z n ”的积累，z a t 除了微量转运c d 而不转运其它重金属，正如哺乳动物中，很多不同的c d f 蛋白可能与 植物中的z n 动态平衡有关”。 从重金属超富集植物zc a 盯u e s c 鲫s 中克隆了一个类z a t 基因 旧，同时，从相关的植物z 卯e s j 增鲫s p 中克隆了编码一个特征很有 意义的c d f 基因冶加m 基因，它转录成一个剪接的和一个不剪接的 m r n a ，分别命名为栅t j 和聊踢表达的两种蛋白在底物特异性 和预测起金属结合作用的富含组氨酸序列之间有差别“。由未剪接 m r n a 翻译过来的蛋白质对c d 、c o 、z n 有很高的耐受水平，而另外一个 t g m t p t 2 则耐受n i 畸“。不同的剪接方式可能与动物中z n t 5 z t l l 的情况 相似，而耐受n i 与z h f 相似。 在酵酒酵母突变体中表达s 西a 脚 a 的c d n a 文库能增强对m n ”的耐 受性，从而克隆得到了舶棚殆，它可能在细胞内细胞器上与质子形成 反转运系统，对m n “的耐受性可能归功于细胞内螯合，通过绿色荧光 蛋白( g f p ) 定位，发现此蛋白在拟南芥定位于液泡膜上，而在酵母 中确定位于内质网上。1 。 从p ，j 曲d c a 印a x p 幽 d j 幽s 的杂交杨树中克隆得到一个c d f 家族蛋白p t d m t p l ，在酵母突变体中异源表达p t d m t p l 能互补突变体对 z n 的超敏感，但对其它金属如c d 、c o 、m n 、n i 等没有互补功能，在植 物细胞和酵母中其均定位于液泡膜上，在拟南芥中过表达此基因能增 强拟南芥对z n ”的耐受能力阻。 1 3c d f 蛋白的生化特征 从z 印e s j 口删s e 中发现转运n i 的蛋白，以及在s 力a 抛f a 中发现 转运m n ”的蛋白后，c d f 蛋白的底物半径包括f e 、c o 、n i 、z n 、m n 、c d ， 这些阳离子的离子半径分别为7 6 p m 、7 4 p m 、7 2 p m 、7 4 p m 、8 0 p m 和9 7 p m 。 硕士学位沦文 相反，m g ( 6 5 p m ) 和c u ( 6 9 p m ) 可能太小，而c a ( 9 9 p m ) 和( 1 l o p m ) 可能 作为其底物又太大。另外，底物结合位点对不同的底物阳离子可能有 不同的亲和性，大多数的c d f 底物是第一。转换期的二价金属阳离子， 大概直径大小为7 4 2 p m 。 大多数c d f 蛋白大小一般为3 0 0 4 0 0 a a ，兄用日托j 矾肛智力s 的c z c d 有六个t m ，这也将作为其它c d f 蛋白的标准。最s 曲f j j 薪口尼 历吕妇j 咖 a 力s 中的c z c d ，叵c d j 中的z i t b 作为外排载体由质子或钾 离子梯度提供动力“29 。3 叫，c p ，酱叮s 妇e 中的z r c l 起作用同样需要 质子动力“1 。真核细胞中，不是所有的膜都有质子、纳、钾梯度，因 此，在这些生物体中，有些c d f 蛋白就只是作为简单的扩散促进体起 作用，z a t 蛋白在p r o t e o l i p o s o m e s 中的阳离子转运不是由质子梯度激 发的，但是，z a t 在几种微生物细胞中作为更新系统“。因此，c d f 蛋白的阳离子转运可能是相对于化学渗透假说梯度的反转运反应，或 是由相应的阳离子浓度梯度驱使的扩散促进。 1 4 拟南芥中c d f 家族构成 植物中第一个被描述的c d f 蛋白因为其为z n 转运体而命名为z a t ， 正如其它已经描述的c d f 蛋白，它有六个预测的跨膜区，并且在第4 个t m 和第5 个t m 之间有一段富含组氨酸的序列”。虽然z a t 有优先权， p a s c a lm a s e r 等”3 1 为了延伸植物和拟南芥中的c d f 家族的概念，根据 金属耐受蛋白( m e t a lt o l e r a n c ep r o t e i n ) 而认为命名与z a t 相关的 蛋白为m t p 会更好，在这一个命名系统下，z a t 被重命名为a t m t p l ，两 个前缀字母表示物种，紧密相关的蛋白被命名为a t m t p n ( n 1 ) ，关系较 远的相关蛋白命名为a t m t p x ( x 为a z ) 。这个系统可能会更有利于植 物中c d f 家族蛋白的延伸，这种命名法更有利于命名其它可能有不同 金属转运能力的c d f 蛋白。倒，0 7 帮船，爿f 朋1 尸1 ) 定位于第二条染 色体。a t m 弹a i 唿t 3 9 6 1 9 4 西昶a t 磁仔a 2 u t 3 9 5 8 8 1 圆定证于镩三条染色 体，爿t 们m ( 彳 删功在篇二条染色体，彳 加j ( 爿4 珊功在第 二条染色体，彳舰2 f 冶，刀口功和爿脚心了f 冶钌回在第三条染 色体，舰4 ( 彳f - 占翻印功在第一条染色体。爿加m 、彳t 册1 尸a 、 拟南芥c d f 家族基因4 朋m 的功能研究 彳舰2 、爿 胛珊都没有内含子。然而，关系较远的爿f 册您l 、爿埘耽& 爿由搿7 ) 屯了、爿打够乃? 叠多百6 至0 1 1 个内含子。 大部分成员均有一个完全保守的n 端信号序列和一个c 一端的c e 域，并且有6 个t m ，相比较而言，c o t l 和z r c l 也表现出这个特征。然 而在有些成员只有部分的特征出现，证明它们跟本家族其它成员相对 比较远的亲源关系，爿 胛乳、彳加您幺彳舭? 、爿f 胛您钧没有表 现出有六个跨膜区的特征，只有彳t 胛有一个完整的n 端信号序列和 一个可以识别的c e 域。彳舰2 、爿白胛文月觑4 的n 端信号序列只 有很低的保守性，只有彳友胛1 尸c 骄口爿舰蒴一个可以识别的c e 域。 d e l h a i z e ( 2 0 0 3 ) 分析拟南芥基因组发现还有另外四个基因也应该是 属于此家族，并且他们根据新的命名方法重新命名此家族基因为 a t m t p l 一1 2 ：a t m t p l 、a t m t p 2 l 、a t m p a l 、a t m p 3 i 、a t m t p a 裔、 a t m i p 4 i 、a t m t p 砩、a t 挑t p 5 i 、a t 融t p c 窃、a t 轴1 p 6 u t 懈p cn 、 a t 强t p 7 i a t 融t p c 自、a t m p 8 l 、a t m t p c 叠、a t m t p 9 l a t l9 7 9 5 2 国、 a t 6 r p l o u t l g l 6 3 l o ) 、a t 挑t p ll u t 2 9 3 9 4 5 国、a t 凇p 1 2 l a t 2 9 0 4 6 2 窃， 它们的系统进化关系如( 图卜2 ) 。 图卜2 拟南芥c d f 家族系统树 1 5c d f 家族系统演化 d a m i e nb l a u d e z 等。们做了一个c d f 家族蛋白的系统树，如图卜3 ， 此树是m a s e r 等( 2 0 0 1 ) 的系统树的修改和延伸版本，经过详细研究后 拟南芥中加入了四个新的成员。p t d m t p l 、a t m t p 卜4 等归类于第1 i i 组；第1 i 组是一个比较远的组，包括a t m t p 5 、a t m t p l 2 、一个伢y z a s a j 阳c d f 、哺乳动物的z n t 5 和z n t 7 、来自se 已卵订s 如p 的m s c 2 、 ! i i l i；i i t t t r t t t t t t t t m m m m m m m m m m m m!la 硕士学位论文 腩 d 印啪c r a s s a ( u 0 7 2 6 2 ) 、姚卯a p 叮拍p j s e a ( 1 0 4 9 3 ) ；其它重 要的植物c d f 包括：拟南芥中的a t m t p 8 一a t m t p l l ) 、5 沙l d 舶刀拍吕s 五a 册据( s h m t p 卜s h m t p 4 ) 是个比较远且分离的组，形成了由g a i t h e r 和e i d e ( 2 0 0 1 ) 定义的第1 组，这个亚家族还包括一些关系更远的植物 成员a t m t p 6 和a t m t p 7 ，也含有一些细菌、动物、酵母的c d f 成员；第 1 v 组包括已经得到很好描述的酵母c d f 成员s c z r c l 和s c c 0 t l 、s p d 廊6 e ( z h f ) 、c ，a s 5 日( u 0 3 1 4 5 ) 、似占r j 占e a ( 0 3 6 3 4 ) 、币口动物c d f 蛋白。 回 i 訇卜3c d f 家族的系统进化树 1 6 本研究的目的和意义 本研究的目的是克隆拟南芥c d f 家族中的一个成员爿f 埘7 尸玩并 且在原核细胞k a m 3 中鉴定其生化功能；同时，筛选此基因的突变体， 并构建过表达及互补转基因植物，以野生型拟南芥作为对照，表型观 察鉴定a t m t p 6 的生理功能；将a t m t p 6 与g f p 蛋白融合，观察其l e 细 拟南芥c d f 家旗基因月f 7 m 的功能研究 胞定位。 本研究是关于c d f 蛋白的研究，c d f 家族蛋白特异性地对过渡金 属元素f e 、c o 、c u 、n i 、z n 等具有转运能力，而这些过渡元素作为 很多酶的共作用因子在生物中有很广泛的作用，并且必须由植物从土 壤中吸收，然而，因为自然或人类活动的影响，这些金属离子可能会 达到其毒性浓度1 ，还有很多其它的金属离子c d 、p b 、h g 等，虽然 对它们的生物功能是未知的，但它们对植物也有很高的毒性，所以， c d f 家族蛋白的研究将对维持足量的过渡元素并且解毒过量积累有重 要的意义。 生物修复是一个最近发展的新的技术，在治理环境比如土壤等方 面发挥重要的作用，此方法对很多污染物且在不同的地域都能有效的 应用”“6 。由于转运蛋白对可能有毒的金属有积累促进作用，所以对 生物修复技术来说是比较令人感兴趣的，可以改造工程植株中的转运 蛋白的数量以达到生物修复的功能。c d f 蛋白的研究势必会促进生物 修复技术的发展，在环境污染治理上起重要的作用。 拟南芥c d f 家族至少含有1 2 个成员，已经鉴定了爿刎7 h ，并且 彳膨垆卜掣四个成员有很高的同源性，在结构上表现出很多共同的特 征，选取与这四个成员关系较远的爿作为研究对象，能够更好 地诠释拟南芥中的c d f 成员的功能。 就已有的研究结果来看，高等植物中c d f 蛋白主要对z n 、m n 等 有转运功能，并且对转运机制等的研究还比较有限，需要更多的研究 结果来解释高等植物中此类转运蛋白的特性，a t m t p 6 作为一个只有 五个跨膜区的蛋白，与以往研究过的成员有比较大的结构上的异同， 它的研究将对本家族蛋白的结构与功能之间的对应关系提出新的观 点。 真核生物中的c d f 成员在不同的膜结构起作用，包括液泡膜、高 尔基体膜、核膜、细胞膜、内质网膜等，根据a t m t p 6 的蛋白序列， 通过分析发现其与s c 删t 2 有很高的同源性，并且在做亚细胞定位预 测时发现它们可能在线粒体膜上起作用，如果结果确定，则将揭示一 个在线粒体膜上起作用的c d f 蛋白。 硕士学位论文 第二章材料与方法 2 1 材料 2 1 1 拟南芥实验材料 野生型拟南芥( c 0 1 u m b i ae c o t y p e ) 突骞乏体( m u t a n t ) ：g a r l i c 一2 3 9 一e 1 2 b 1 a l b 3 f a 2 1 2 主要基因工程酶类和试剂盒 r t a qd n a 聚合酶( a m b i o g e n 公司) 、r n a 提取试剂盒( a m b i o g e n ) 、 质粒提取试剂盒( a m b i o g e n ) 、胶回收试剂盒( a m b i o g e n ) 、p y r o b e s t d n a 聚合酶( t a k a r a 公司) 、限制性内