（分析化学专业论文）纳米条码检测技术研究.pdf

重庆大学硕士学位论文 中文摘要 摘要 在宏观世界里，条码识别方法由于其快速、简单和精确的特性，在日常生活中 随处可见。同时，条码技术也应用于微观世界。比如，分子反应研究里的微尺寸 条码，甚至纳米级尺寸条码，组合放映，以及反追踪技术等，这些成功的实例为 该研究领域打开了新方向。 本文以包含不同比例的两种寡核苷酸子序列对d n a 模板进行编码，采用分别 以红、绿色荧光染料标记、与子序列互补的寡核苷酸探针，对d n a 模板进行编码 研究。实验考察d n a 模板产生荧光的颜色和强度，与模板两种子序列的大小及其 比例、以及扩增产物链长的关系，优化、建立大容量、良好分辨的d n a 编码放大 检测技术。本项目提出通过在d n a 模板上杂交两种荧光标记寡核苷酸使其结合两 种染料，以d n a 模板所含两种子序列的数量调制两种染料比例，使由两种子序列 不同组合构成的d n a 模板具有不同颜色的荧光，实现对d n a 模板的编码；显然， d n a 彩色荧光编码的容量与可分辨性取决于d n a 所含两种子序列的大小及数量，本 文成功的对纳米条码进行了聚丙烯酰胺电泳分离，并对其组合色彩进行了定性表 征，并对结合了d n a 条码的纳米金粒子进行了聚丙烯酰胺电泳分离和表征，达到 了预期的理想效果，接着采用紫外一可见分光光度计对结合的纳米条码进行荧光 光度检测和表征，为纳米条码在实际应用中进一步进行定量分析提供了可靠的理 论基础。 金纳米粒子具有小尺寸效应、表面效应、光学效应以及特殊的生物亲和效应， 这些效应使得金纳米粒子广泛应用于l 临床医学、材料学等领域，目前，金标记技 术在医学检验领域已经成为四大标记技术之一。表面结合了核酸或蛋白质的金纳 米粒子在生物医学方面具有非常广泛的应用，为了更好地应用金纳米探针，需要 对这种金纳米探针进行分析表征，目前主要是应用电镜技术，但这种技术操作比 较烦琐、条件苛刻、仪器昂贵。这就需要发展一些相对简单的方法来对金纳米探 针进行分析表征。本文将荧光分光光度计、聚丙烯酰胺凝胶电泳等用于金纳米粒 子表面修饰的表征，以寻求一种灵敏、简便易行的表征方法。 表面修饰后的金纳米粒子在电学性质上将有更大的差异，这对于分离非常有 利，不失为一种金纳米粒子修饰的新分离手段。后续实验可以将这种分离的条件 进行进一步摸索。同时在凝胶电泳中间对不同粒径的金纳米粒子进行尝试性分离， 可以得到不同泳动距离的电泳区带。然后对表面修饰了寡核苷酸的金纳米粒子在 同样条件下分离可以得到明显分开的区带，这种方法是对具有不同粒径和不同表 面修饰量的金纳米粒子进行分离的有效手段。可以发展成为金纳米粒子质量控制 重庆大学硕士学位论文 中文摘要 和表面修饰量表征的标准方法。 关键词：纳米条码金纳米粒子凝胶电泳核酸探针 重庆大学硕士学位论文英文摘要 a b s t r a c t b a r c o d e sa r ea p a r to f o u re v e r y d a yl i f e f a s t , s i m p l e ，a n da c c u r a t e ，b a r c o d i n gh a s b e c o m et h em o s tp o p u l a rd a t a - e n t r ym e t h o dt ot r a c kt h ee v e r - e x p l o d i n ga m o u n to f i n f o r m a t i o ni nt h em a c r o s c o p i cw o r l di nt h ep a s t1 5y e a r s i nt h em e a n t i m e ，a l l i n c r e a s i n gd e m a n df o rt r a c k i n gs m a l l e ri t e m sa n df o rd i r e c tm o n i t o r i n go f i n d i v i d u a l c h e m i c a li n t e r a c t i o n sh a sd r i v e nt h ee x p l o r a t i o nf o rn o v e lm e t h o d so f b a r c o d i n ga t m u c hs m a l l e rs c a l e s s u c c e s s f u ld e m o n s t r a t i o n so f m i c r o o rn a u o s i z e db a r c o d e si n m o l e c u l a ri n t e r a c t i o ns t u d i e s ，c o m b i n a t o r i a ls c r e e n i n g , a n dc o n v e r tt r a c k i n gh a v e o p e n e du pn o wo p p o r t u n i t i e sf o rr e s e a r c h 如t h i st h e s i s 。an c h s o r to fd n an a n o s t r u c t u r e sh a v eb e e ns y n t h e s i z e d b yo u r g r o u p w ef i r s ts y n t h e s i z e dt h ef l u o r e s c e n c e - l a b e l e ds h o r to l i g o n u e l e o t i d e s ，w h i c hw e r e s p e c i f i c a l l yl a b e l e dw i t haf l u o r o p h o r ea n dw a sc o m p l e m e n t a r yt ot h eo t h e rl o n g o l i g o n u e l e o t i d e s a f t e rh y b r i d i z a t i o n , t h e s eo l i g o n u c l e o t i d e sf o r m e daf l u o r e s c e n c e - l a b e l e dd n an a n o s t r u c t u r e s s i n c eb o t hd y et y p ea n dd y en u m b e rc a nb ep r e c i s e l y c o n t r o l l e d ，m u l t i c o l o rf l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y - e n c o d e dn a n o b a r c o d e sc o u l db ef a b r i c a t e d t h ed e c o d i n gi sb a s e do nt h ed i f f e r e n tr a t i o so fd i f f e r e n tf l u o r e s c e n td y e s ，i n d e p e n d e n t o ft h ed y ep o s i t i o n s c o n s e q u e n t l y , t h er e s u l t a n td n an a n o b a r c o d e sn o to n l yh a d c o d i n gc a p a c i t y ，b u ta l s oc o n t a i n e dm o l e c u l a rr e c o g n i t i o ne l e m e n t st h a tc o u l db eu s e d f o rm o l e c u l a rd e t e c t i o n t h er e s u l t a n tn a n o b a r c o d e sw e r ee v a l u a t e d u s i n gg e l e l e c t r o p h o r e s i s m o r e o v e r , t h e m o d i f i e d g o l dn a n o p a r t i c l e sb y t h er e s u l t a n t n a n o b a r c o d e sw e r ea l s oe v a l u a t e db yg e le l e c t r o p h o r e s i sa n d b ys p e c t r o f l u o r i m e t e r t h e r e s u l t sw e r et h ed e p e n d a b l ee l e m e n t sf o rt h ea c t u a la p p l i c a t i o no f t h en a n o b a r c o d e s g o l dn a n o p a r t i l e e sh a v em a n ys p e c i a lp r o p e r t i e ss u c ha sq u a n t u ms i z ee f f e c t s ， s u f a c ee f f e c t s ，o p t i c a le f f e c t sa n dc o m p a t i b i l i t ye f f e c t s w i t ht h e s ep r o p e r t i e s ，g o l d n a n o p a r t i c l e sa n dt h e i rb i o c o n j u g a t e sw e r ew i d e l yu s e di nc l i n i c a ld i a g n o s t i c sa n d m a t e r i a lf i e l d a tp r e s e n t ，c h a r a c t e r i z a t i o no fg o l dn a n o p a r t i c l e sa n dt h e i rd n a c o n j u g a t e sa r eb e i n gr e l i e do nt e ma n do t h e rt e c h n i q u e s b u tt h ee q u i r m e n t sa n d o p e r a t i o n sa r es oe x p e n s i v ea n dc o m p l i c a t e dt h a te c o n o m i c a la n ds i m p l em e t h o d sn e e d t 0b ed e v e l o p e d i nt h i ss t u d y , s p e c t r o f l u o r i m e t e ra n dg e l e l e e t r o p h o r e s i sw e r e e s t a b l i s h e df o rt h es e p a r a t i o no f g o l dn a n o p a r t i c l e sa n dm o d i f i e dg o l dn a n o p a r t i c l e s i t i sa l r e a d yf o u n dt h a tg o l d n a n o p a r t i c l e sc o u l db es e p a r a t e du n d e rg e l e l e c t r o p h o r e s i s g e le l e c t r o p h o r e s i sh a se l e c t r o s t a t i c e f f e c t sa n dm o l e c u l es i e v i n g i i i 重庆大学硕士学位论文 英文摘要 e f f e c t ss oi t sc o u l ds p l i ta un a n o p a r t i c l e sw i t hd i f f e r e n ts i z e sp r e c i s e l y u n d e rt h e s e c o n d i t i o n s ，s m a l lp a r t i c l e sh a v el a r g ee l e c t r o p h o r e s i sm o b i l i t y m o r e o v e ri tw a sf o u n d t h a tt h em o d i f i e dg o l dn a n o p a r t i c l e s e l e c t r o p h o r e s i sm o b i l i t yi sd i f f e r i n gf i o mt h e u n m o d i f i e d s m a l lp a r t i c l e sa r ed e t e r m i n c d t ob e o p t i m a l s i z ef o rt h es u r f a c e m o d i f i c a t i o na n di tc o u l dm a x i m a l l yi n e r e a s e st h es e n s i t i v i t yo ft h ed n ad e t e c t i o n f u r t h e re x p e r i m e n t sn e e dt ob ed e v e l o p e dt og e tb e t t e rr e s u l t s k e y w o r d s ：n a n o b a r c o d e s ，g o l dn a n o p a r t i e l e s ，g e le l e c t r o p h o r e s i s ，o l i g o n u c l e o t i d e s p r o b e s i v 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中刁i 包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得重迭盔堂 或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本 研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：万场格签字目期：沙7 年珀。 口 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解重麽盍堂有关保留、使用学位论 文的规定，有权保留并向围家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘， 允许论文被查阅和借阅。本人授权重庞盍堂 可以将学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制 手段保存、汇编学位论文。 保密() ，在年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密( l ) 。 ( 请只在上述一个括号内打“”) 学位论文作者签名：百z 弓c 吟 签字日期：幽1 年r 月d 弓日 导师躲蔓玉皖 签字日期：刁年r 月；日 重庆大学硕士学位论文 1 绪论 1 绪论 1 1 引言 在宏观世界里，条码识别方法由于其快速、简单和精确的特性，在日常生活中 随处可见。同时，条码技术也应用于微观世界。【】比如，分子反应研究里的微尺 寸条码，甚至纳米级尺寸条码h , - s 】，组合放映 0 1 ，以及反追踪7 1 技术等，这些成功的 实例为该研究领域打开了新方向。 传统的宏观条码是由一系列的竖直线( “条”) 和不同宽度的“空”所组成的。 “条”和“空”的不同组合即代表组合码的不同特性。理论上来说，改变条码的 宽度、先后顺序以及“条”与“空”的总数，即可产生无数的代码。为了在纳米 尺寸上达到相似的编码能力，首先应该确定恰当的编码材料( 比如，分别确定“条” 与“空”的组成材料) 。在确定编码材料的时候，通常有两个标准：第一是可以忽 略信号交叉，它们必须在不同的比率下可以混合；第二是可以通过简单的读出方 法进行简易识别。很多分子和纳米材料都符合这两个要求，并且条码制作程序用 普通显微镜即可观察。【7 ，8 l 纳米科学是2 0 世纪8 0 年代刚刚诞生并且正在崛起和迅速发展的新领域，它 所研究的对象是尺寸在0 卜l o o n m 之间的物质所组成的体系的运动规律和相互作 用，以及实际应用中的可能的技术问题。 纳米科学的研究，开辟了人类认识世界的新层次，也使得人们改造自然的能 力直接延伸到了分子、原子水平，标志着人类的科学技术进入了一个新时代，以 纳米技术为中心的新技术革命必将成为本世纪的主导：作为物理、化学、生物、 材料、电子等多种学科形成的交叉学科，纳米科学必然具有强大的生命力：它涉 及的许多未知过程和新奇现象很难用传统的物理化学理论解释，纳米材料的研究 势必把物理化学领域的许多学科推向一个新层次，同时也会给本世纪科学的发展 带来新的挑战与机遇。 金纳米粒子因为其特殊的稳定性、小尺寸效应、量子效应、表面效应和特殊 的生物亲和效应等特性，使它在许多领域表现出潜在的理论和应用价值，已经成 为目前研究得最多的纳米材料。金纳米粒子是组成金纳米材料的要素之一，是制 备金纳米器件的基础，目前纳米粒子的制备已取得较大的进步，能够制备相应尺 寸大小的金纳米粒子，但是尺寸分布范围比较大；金纳米粒子与各种生化探针通 过共价键合或物理吸附结合形成的配合物的性质变化及其应用属于纳米结构材料 制备和应用的范畴，正是目前研究的热点。常见的生化探针有核酸探针、有机小 分子探针和金属离子探针等。其中发展最早、应用最多的是基于核酸分子杂交原 重庆大学硕士学位论文1 绪论 理的核酸探针。有机小分子探针既包括能与蛋白质、核酸等生物大分子直接作用 的一些染料分子，也包括能选择性检测钙离子的螯合剂探针等，金属离子探针中 最具代表性的是金纳米粒子荧光探针试剂。金纳米粒子本身可以作为生化检测中 的探针使用。同时由于其特殊的生物亲和性使得它可以和其他探针结合，这种修 饰了其他探针的金纳米粒子功能性分子在生化检测中，必将发挥不可估量的作用。 基因压型、药物放映、临床诊断和环境分析都非常需要快速、多元、灵敏和 特异性的分子检测方法。多元分析的主要挑战之一就是使用独特的信标或者“条 码”来识别每个特异的反应。目前条码的微小尺寸，多分散性，复杂的制作过程， 和非生物兼容性限制了它们的实用性。因此寻求制作一种快速简便的纳米检测条 码具有非常重大的现实意义。 1 2 纳米条码的性质和应用 1 2 1 纳米条码的产生和发展 要说纳米条码的产生和发展，首先不得不说宏观条码的产生和发展。条码自动 识别技术是一种快速、适时、准确收集、储存、处理信息的高新技术，是实现国 民经济现代化建设大市场，搞活大流通、发展大贸易，建立信息网络，实行电子 数据交换，开展安全检测，增强竞争能力不可缺少的技术工具和手段。 条码技术最早产生在风声鹤唳的二十年代，诞生于w e s t i n g h o u s e 的实验室 里。一位名叫j o h nk e r m o d e 性格古怪的发明家“异想天开”地想对邮政单据实现 自动分检，那时侯对电子技术应用方面的每一个设想都使人感到非常新奇。他的 想法是在信封上做条码标记，条码中的信息是收信人的地址，就象今天的邮政编 码。 为此k e r m o d e 发明了最早的条码标识，设计方案非常的简单( 注：这种方 法称为模块比较法) ，即一个“条”表示数字“1 ”，二个“条”表示数字“2 ”， 以次类推。然后，他又发明了由基本的元件组成的条码识读设备：一个扫描器( 能 够发射光并接收反射光) ；一个测定反射信号“条”和“空”的方法，即边缘定位 线圈：和使用测定结果的方法，即译码器。 不久，k e r m o d e 的合作者d o u g l a sy o u n g ，在k e r m o d e 码的基础上作了些改 进。k e r m o d e 码所包含的信息量相当的低，并且很难编出十个以上的不同代码。 而y o u n g 码使用更少的条，但是利用“条”之间“空”的尺寸变化，就象今天的 u p c 条码符号使用四个不同的条空尺寸。新的条码符号可在同样大小的空间对一百 个不同的地区进行编码，而k e r m o d e 码只能对十个不同的地区进行编码。 条码技术经过几十年的发展，直到1 9 7 0 年i t e r f a c em e c h a n i s m s 公司开发出 “二维码”之后，才有了价格适于销售的二维矩阵条码的打印和识读设备。 2 重庆大学硕士学位论文i 绪论 此后，随着l e d ( 发光二极管) 、微处理器和激光二极管的不断发展，迎来了 新的标识符号( 象征学) 和其应用的大爆炸，人们称之为“条码工业”。今天很少 能找到没有直接接触过即快又准的条码技术的公司或个人。 由于在这一领域的技术进步与发展非常迅速，并且每天都有越来越多的应用 领域被开发，现在主要包括四大条码识别技术：智能卡( s m a r tc a r d ) 技术；无 线射频识别技术( r f i d ) ；生物特征识别技术和声音识别技术。这四大技术不能 绝对区分开来，比如智能卡技术，也可能还是生物识别技术、声音识别技术，而 声音识别技术属于生物识别技术。 进入2 0 世纪以来，纳米技术发展迅猛，将“条”与“空”的概念引入微观研究 领域以后，自然而然就出现了纳米条码技术。如前所述，为了在纳米尺寸上达到 与宏观条码相似的编码能力，首先应该确定恰当的编码材料( 比如，分别确定“条” 与“空”的组成材料) 。在确定编码材料的时候，通常有两个标准：第一是可以忽 略信号交叉，它们必须在不同的比率下可以混合：第二是可以通过简单的读出方 法进行简易识别。很多分子和纳米材料都符合这两个要求，并且条码制作程序用 普通显微镜即可观察。【9 】 在药物放映和药物发现领域，为了适应不断发展的同时检测的需要，在过去 的几年里，出现了几种微载体为基础的多元检测技术。被放映的复合物与靶分析 物一起被放置在一个容器中进行混合，从而复合物被附载到微载体的表面。每种 微载体都必须被编码，从而来分辨是哪种复合物被附加到其表面上了。 药物发现，药物放映和诊断，一般包括实现大量分子的化验。这些化验特别 包括了感兴趣的化合物的放映化学库，以及特定靶分子的放映，比如说检测样品 中的抗原、抗体、核苷和肽。用于此目的的成百上千的单反应更需要次性快速 实现。而“复合技术”能满足此目的，允许在相同微体积样品里实现复合离散化 验。 或许发展复合化验的最重要挑战之一就是必须追踪每个反应。比如说，在一组 数以干计的分子组中，如果仅仅发生了一个感兴趣的反应，可以进行某个靶分析 物的放映，就有可能确定到底哪种分子引发了该反应。有两种主要的方法，在第 一种方法里，每种分子都在微型滴定盘的井里被物理分离，或者将它们应用到阵 列的特定地方一就像所谓的“高密度”d n a 阵列或微芯片。【m 】在第二种方法中， 该反应在单个微载体上被实现每种载体都有一种特定的分子结合到其表面。 在第一方法里，在微滴定盘或者微阵列里都有精确定位( x ，y 坐标) ，允许在其间 的被分析分子的识别。这些追踪反应的方法经常更多地作为地点( 或空间) 编码。 第二种方法要求每种微阵列都被标记，并允许进行结合到其表面上的分子识别( 图 1 1 ) 。这个方法允许混合独特编码微阵列，并可以进行同步化验。这些微阵列在 重庆大学硕士学位论文1 绪论 附加物质和靶分析物中表现出有利的反应它们能够被标记，比如说，荧光信 号从而它们的编码可以被读出，因此启发了分子识别功能。 b ，一厂a 、 p + 嘲、 i 翻 、矿， 、o 、， 图1 1 编码微载体的要求a 表面结合了特定配合基或者化合物的微载体b 在微载体为基础的 分析中，把微载体混合于装了靶标分析物的同一容器中，吸附在微载体表面的大量分子能够 被同时检测。结合在微载体表面的编码都可以被识别。 f i g u r e1 1lt h en e e dt oe n c o d em i e r o c a r r i e r s as c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no f am i e r o c a r r i e rt h a t h a sa p a r t i c u l a rl i g a n do rc o m p o u n db o u n dt oi t ss u r f a c e bli nm i c r o e a r r i e r - b a s e da s s a y s ，m a n y m o l e c u l e s a t t a c h e dt ot h em i e r o e a r r i e r s c 甜b et e s t e da tt h es a m et i m eb ym i x i n gt h e m i e r o e a r r i e r si nt h es a m ev i a lt h a tc o n t a i n st h et a r g e ta n a l y t e t h ec o d eo ne a c hm i c r o c a r r i e ra l l o w s t h el i g a n do rc o m p o u n da t t a c h e dt oi t ss u r f a c et ob ei d e n t i f i e d 在组合化学的领域也出现了编码微粒子的需要，特别是在“裂混”方法中， 在同一反应容器中，复合产物同时组合在合成微球上，而该反应仅仅需要几个步 骤。该方法会令大量的复合物附加到合成的微球上，每种球都有一种特定的复合 物结合到其表面。为了知道哪种复合物会结合到粒子球表面，任何复合物都必须 被分析工具识别，或者这些球被编码。 在合成以前，微粒子能够被编码，在这个步骤里，当追踪它们的反应路径轨迹 时，在每个循环里，粒子都需要被译码。另外，在每个循环里，通过加入一个可 检测的化学标签，微粒在合成时能够被编码。在这个方法中，从微阵列和化学标 签中分离出来需要识别的代码叫做“化学编码”。普通分子识别标签有芳基盐标签， 二级胺标签，肽标签，核酸标签和二烃胺标签等。识别编码的检测方法通常费力、 昂贵而且不可进行自动化操作。此外，编码化学会干预复合物的合成，导致假现 象。因此，人们迫切想要得到克服了这些限制的编码方法。 在过去的几年里，随着纳米技术的快速发展，在不同的领域使用微型条码和纳 4 重庆大学硕士学位论文1 绪论 米条码已经引起了人们的广泛注意。自从研究者开始研究该创新性的领域后，关 于条码粒子的报道频繁出现。人们的目光主要聚焦在生物多路技术上，并且由原 来的大规模多路技术转移到特定分析物的检测基团上。换句话说，目前使用的多 路技术的检测能力并不是象过去一样，是由于可用粒子的数量受到限制，而是由 于化验数量而受到限制，这些化验能够被同时进行，而且不显著降低灵敏度和特 异性。为了确保采用微粒子为基础的条码技术的经济稳定，产业先驱们正在突破 以下一系列限制：低成本、大尺寸粒子产品和便携式检测系统。在识别精确性和有 效性方面，自动检测已经变得日益重要。 1 2 2 纳米条码的种类 ( 1 ) 微粒子负载编码成分 编码成分为具有可识别特性的分子或者纳米粒子，在一种制作程序中，微粒子 被用作“载体”来携带编码成分。这种条码制作程序具体又分为两种，第一种方 法，微粒子在有机溶剂中膨胀打开，其内部的编码成分胶囊化。随后，将其置于 水溶液中，这些粒子快速收缩，并关闭先前打开的通道，锁住编码成分。【1 1 1 2 l 当 编码成分暴露在周围环境中，可能会引起意想不到的结构或者性能的退化，而这 个胶囊化过程，就提供了一个化学惰性护罩来保护编码成分。这个包被也隔离单 个成分，阻止它们的相互结合，从而防止输出信号的改变。 第二种方法，编码成分通过静电反应，直接吸附在微球的外表面。f 1 3 j 无论是用 在哪种方法中，一般作为载体的粒子经常由化学电阻系数大的聚乙烯材料构成。 有时候也采用硅材料。在化验应用中，这些微粒子偶尔也作为固体载体，来附载 上捕获反应物，并参与溶液中的分子间反应。因此，这些粒子的尺寸应该足够大， 可供应足够的编码成分用于检测，并为捕获反应物提供充足的结合位点；但是， 它们同时又仍旧应该足够小，以确保它们在溶液中处于悬浮状态。 在粒子内部胶囊化的编码成分，为拥有独特光学或者电学性质的典型的分子或 者纳米粒子。因为荧光有机染料具有特定形状的发射谱图，以及很好的灵敏度， 所以迄今为止，荧光有机染料仍然最为常用的编码物质。相当于应用于宏观条码 的条和空白间隔，不同发射谱图的染料分子以不同的比率混合。激发以后，这些 染料发射出独特的荧光信号，使用简单的分光计就可以检测。量化每种染料的绝 对荧光强度，从而可以识别粒子种类。该领域中，最突出的例子是用l u m i n e x 制 作的注满了荧光团的人造微球。在该平台上，两种有机染料分别以1 0 种不同的浓 度，在微尺寸聚苯乙烯球内胶囊化，结果制作出了一系列的1 0 0 种独特编码的微 球。理论上来说，如果向主体微球灌注不同浓度的附加染科，可以进一步增加编 码能力。 重庆大学硕士学位论文1 绪论 半导体纳米晶体所形成的量子点具有独特的光学特性。 1 4 , 1 5 , 1 6 】因此，作为一类 新的荧光媒介，半导体纳米晶体己经引起了广泛的兴趣。仅仅作为有机染料分子。 一个简单的扩散步骤已经足够负载这些纳米晶体到大粒子上。通过选择不同发射 带的纳米晶体的混合物，能够调整荧光谱图。采用相似的方法，由于具有光致发 光特性，稀土元素和有机一染料一组合的硅球也被用作编码成分。 图1 2 列举了三种半导体纳米晶体，它们的发射荧光分别为红，蓝，绿，并且 以不同的比率混合。图中的有色聚苯乙烯球的色彩与负载的每种纳米晶体的总数 密切相关，激发以后能够被清楚地识别。如果组合纳米晶体的尺寸调整到2 到7 n m ， 荧光发射的最大值可达到4 0 0 r e , 到2um 。在最大半波值( f w 嘲) 为l o - - 2 0 u m 的典型 荧光谱图中，采用6 个亮度水平的5 种或者6 种颜色的编码方案被认为是可行的。 这些方案对应于1 0 0 0 0 - - 4 0 0 0 0 可识别的编码，远远多于使用单独的有机染料所构 成的编码。【n 】由于纳米晶体的耐光性和高量子产率，它成为粒子编码的最佳候选 材料。单波长激发性能进一步简化了编码方法的设计。 除了光致发光特性，不同分子的i r 和r a m a n 光谱特性也被用于编码设计。 1 8 , 1 9 , 2 0 f e n n i r i 等人在载波树脂的聚合中，混合了六种苯乙烯派生物，它们在不同 的比率下，具有卓著的拉曼和红外信号。每种树脂的最终光谱表明，不同强度的 红外和拉曼带的混合，相似于宏观条码中的不同宽度。因为所有的6 种指示派生 物具有独特的振动指纹图谱，任意混合产生了2 4 种独特编码，比预想的还多。值 得注意的是，相同的分子存在复合吸收带，通过提供附加的特定结构信息，可以 确保编码的高度精确性。尽管如此，有时候光谱太密集，会使去卷积信号复杂化， 并且会限制没有光谱交迭发生的可用化合物的最大数量。 虽然光学编码粒子被广泛使用，并在商业上取得了成功，但是超出生物分析的 应用仍旧受到限制，主要是因为独特编码球的联合应用小。为了克服这个限制， 采用了两个方法来增大编码联合应用。第一个方法增加了成分的数量，通过减少 这些编码成分的发射带的最大半波值，使用同样的检测系统可以对其进行识别。 比如，传统染料分子的荧光发射带的f w 嘲值为5 0 - - 2 0 0 n m 。同时，在可见区域( 4 0 0 - - 8 0 0 n m ) 内，仅仅能够提供4 6 个不同的具有合适的光谱交迭的荧光染料来调节。 另一方面，半导体纳米晶体在它们的荧光发射区域内，有更小的f w h m 值为1 0 一 2 0 n m 。因此，1 0 1 2 种不同的纳米晶体可以应用于相同的检测窗口。拉曼散射带 进一步减少了f w t o , t 值，因此，从理论上来说，制作更多的编码是可行的。事实上， 由于复合拉曼带的存在和相对较弱的信号，已经限制编码数量 4 3 x1 0 。库实体。采用双回归去 卷积方法，可以进一步简化追踪过程，并且能够证明所需产物的最初和最后合成 位置。 ( 3 ) 非生物应用 随着微尺寸编码制作和编码过程的成熟，宏观世界里的编码应用，比如说装配 线跟踪，详细目录，和图书馆自动控制，都能够得益于微粒子为基础的编码。特 别是它们都要求小的，灵敏的，特异性高，并且成本低的标记，编码微粒已经表 现出了空前的潜力。这些粒子的化学和几何弹性也使它们应用于标记传统标记 重庆大学硕士学位论文 1 绪论 方法失败的非传统目标，比如说高温部分，光滑表面，和复杂形状、尺寸或者材 料的条目。微编码仍旧处于起步阶段，在生命科学以外的应用阻力主要是进一步 提高编码粒子库的制作、处理和检测。 1 3 金纳米粒子生化探针的制备及应用 1 3 1 金纳米粒子的制备 金纳米粒子的制备在纳米科技开始发展的8 0 年代末9 0 年代初就有不少科 技工作者在探索。如t u r k e v i c h 和f r e n s 等所做的早期工作，经典的f r e n s 法直到 今天仍旧是制备金纳米粒子的主要方法之一。到目前为止，已经发展了许多制备金 纳米粒子的方法，总体上可划分为“从上到下”法( 主要是物理法) 及“从下到上” 法( 主要是化学法) 。 1 物理法 1 ) 真空蒸镀法。 这是一种常见的制备方法，在真空中高温加热或等离子体等将金原子蒸发，金 原子在冷的固体基底( 如石英) 上冷凝，便可得到纳米尺寸的金粒子。这种方法适 合于对金粒子的粒径和形状要求不高的制备。 2 ) 软着陆法。 这种方法的基本原理还是蒸镀法。不同点在于本法是在氩气流中产生金纳米粒 子，金原子沉积在表面有一层氩气的冷的基底上。这样获得的金纳米粒子在外形上 更趋于球形，一致性更好。 3 ) 激光消融法。 m a f u n e 4 2 1 等用此方法制备了金纳米粒子。在s d s ( 十二烷基磺酸钠) 水溶液中的 金盘用激光烧蚀以获得金纳米粒子。在制备过程中要使用表面活性剂以阻止金纳 米粒子重新聚集。实验发现，随着表面活性剂的浓度增加，金纳米粒子的直径变小。 当表面活性剂的浓度超过1 0 m o l m 3 ，就能形成稳定的金纳米粒子。直径大于5n m 的金纳米粒子可用5 3 2 n m 的激光粉碎成粒径为l 5 n m 金粒子。 2 化学法 1 ) 溶胶法。 经典的f r e n s 法就属于这种方法。将1 5 0l l l l0 0 1 ( i i l p v ) 的h a u c l 。水溶液加 热至沸腾，在剧烈搅拌下迅速加入5 2 5m l1 ( m p v ) 的柠檬酸钠水溶液，保持沸腾 状态反应1 5 m i n 后关闭热源，继续搅拌至室温，透射电镜( t e m ) 结果显示，粒子的 平均粒径为1 5 74 - 2 0n m 。按完全反应估算，粒子浓度为1 2 x 1 0 1 8m 3 ，粒子强度 约为7 5m o l t 0 3 ，p h 6 1 1 4 3 。d y k m a n 4 4 1 等报道了用大分子量的还原剂，如聚环乙亚 胺、聚乙二醇及聚乙烯毗咯烷酮( p v p ：p o l y v i n y l - - p y r r o l i - - d o n e ) 等还原h a u c l 4 重庆大学硕士学位论文 1 绪论 制备金溶胶。g a r d e a l 4 5 等用紫花苜蓿生物质制备金纳米粒子。紫花苜蓿生物质与 u ( ) 弱键合，能把a u ( ) 还原出来，从而形成金纳米粒子。高倍显微镜显示， 当a u ( ) 被还原后与紫花苜蓿生物质形成5 种不同类型的金纳米粒子，包括正四 面体型、六角小盘型、二十面体复合孪生型、十面体复合孪生型及不规则形状的 金纳米粒子。 2 ) 晶种生长法。 这种方法是以小的纳米粒为晶种，合成大纳米粒的方法。n a t a n 首先探讨了这 种方法。先用柠檬酸钠还原h a u c i 。制得粒径为5 0 5m ，长短轴之比为i 1 的水相 金溶胶。以此金溶胶为晶种，加入适量的h a u c i 。及羟胺，利用金纳米粒子表面的自 催化反应使晶种逐渐长大。通过控制适当的条件，可以制造粒径在5 0 1 l on m 之 间的各种金纳米粒子。由于大粒径的金溶胶易聚沉，反应完毕后需加入适量的聚乙 烯吡咯烷酮( p v p ) 作为胶体稳定剂。朱梓华等m 】在n a t a n 反应的基础上，进一步 扩大了粒径范围，制得了粒径为6 0 1 6 0 n m 的一系列单分散金纳米粒子水溶胶。 3 ) 反胶束法。 本法亦称微乳液法。反胶团是指表面活性剂溶解在有机溶剂中，当浓度超过临 界胶束浓度( c m c ) 后形成亲水极性头向内、疏水有机链向外的液体颗粒结构，其内 核可增溶水分子或亲水物质。微乳液一般由4 种组分组成，即表面活性剂、助表面 活性剂( 一般为脂肪醇) 、有机溶剂( 一般为烷烃或环烷烃) 和水。它是一种热力学 稳定体系，可以合成大小均匀、粒径在1 0 2 0b m 左右的液滴。微乳液的组成确定 以后，液滴的粒径保持定值。c h i a n g 4 7 】报道了在异新烷中表面活性剂气溶胶和非 离子表面活性剂脱水山梨( 糖) 醇一油酸酯形成的微乳液中用肼还原h a u c i 。形成 的稳定的、各向异性的金纳米粒子。e s u m i 【4 8 l 报道了在2 一乙烯基吡啶调聚物的存 在下，在水中用n a b h 4 还原h a u c l 。制得金纳米粒子。l i n m 9 1 等报道了在 c t a b ( c e t y l t r i m e t h ya m m o n i u mb r o m i d e ) 辛烷+ 1 一丁醇h , o 反向胶束中用n a b h 4 还原h a u c i 。制得金纳米粒子。s e l v a n 等也报道了用微乳液法制备金一聚吡咯复合 材料，金粒在聚合物中分散性良好，粒径在7 9n m 之间。 4 ) 相转移法。 先将沉淀制成无机胶体，再用表面活性剂处理，然后用有机溶剂抽提，制得有机 溶胶。经脱水、脱有机溶剂，即制得纳米材料。用这种方法制得的纳米材料优点是 颗粒均匀、分散性好、原料回收率高。缺点是工艺多、有机溶剂消耗较多，需要注 意回收。实验证明，成胶的p h 值、表面活性剂的类型与浓度、有机溶剂的类型与配 比、金属盐的类型等对合成有影响。h a u c i 。水溶液与4 一辛基溴化铵甲苯溶溶液 在剧烈搅拌下混合，分离后的有机相依次加入壬烷基硫醇甲苯溶液( 刀( s ) ：刀( a u ) = i ：4 ) 和n a b h 水溶液持续搅拌2 4 h 。分离，蒸发，在得到的底物中加入适量的乙 1 4 重庆大学硕士学位论文 1 绪论 醇，一2 0 下静置，经过滤得棕黑色产物，用乙醇反复洗涤。将干燥后的金粒溶于 甲苯即得金溶胶。本法制得的金纳米粒子有良好的稳定性和可分离特性，粒径在 5 0 r i m 左右。e s u m i t s o 报道了用水相中的h a u c l ；转移到甲苯或氯仿中( 加疏水的聚 ( 酰胺基氨) 树状物) 。然后，用二甲氨基硼烷还原a u 3 + 离子。这样，在甲苯或氯 仿中便生成了2 4n n l 范围的金纳米粒子。 5 ) 模板法。 此法是在模板的微孔中制备金纳米粒子。s h i 等【”l 报道了在氢气的气氛中，在 浸有h a u c l 。的s i o z 的微孔中还原产生金粒，反应温度9 7 3k ，反应时间1 h 。这种新材 料用x 一射线衍射、t e m ( 透射电镜) 等方法进行表征。金纳米粒子相互隔离并均 匀地分散在s i 0 2 的细孔中，粒径小于4 r i m 。g o m e s 5 2 】等报道了用a u c l 与长链胺 ( c 。h 2 。+ i n h 2 ；月= 8 ，1 2 ，1 6 ) 形成复合物a u c i ( n h 2 r ) ，氓= c g h l 7 ，c t 2h 2 s ，c 1 6 h 3 3 ) 。他们用经典的方法在固体基底上自组装纤维状物质。在超分子的框架中， 复合物发生分解产生单层有序的金纳米粒子。制备金纳米粒子的方法除了上面介 绍的几种之外，还有如电解法、多相反应法、水热法、喷雾热解法、溶剂热法等1 5 ”。 这里就不再一一介绍。 1 3 2 金纳米粒子的基本性质 由于构成纳米材料的基本单元都是微小尺寸的，所以纳米材料表现出许多不 同于常规材料的特性，如：小尺寸效应【5 4 l 、表面效应5 5 1 、宏观量子隧道效应闻和 久保效应【5 7 1 等等。 1 ) 小尺寸效应 纳米微粒的尺寸与光波的波长、德布罗意波长、超导态的相干长度或穿透深度 等物理尺寸相当或更小时，晶体的周期性边界条件被破坏，非晶态纳米微粒表面 附近的原子密度减小，导致声、光、电、磁、热、力学等性质呈现新的小尺寸效 应。如：光吸收显著增加，并生产吸收峰的等离子共振频移，磁有序态向无序态 转变，超导态向正常态转变：声子谱发生改变；纳米颗粒的熔点降低等。 2 ) 表面效应 纳米微粒的表面原子数与总原子数之比随粒径的变小而急剧增大后所引起的 性质变化称之为表面效应。当粒径降到l n m 时，表面原子数比例达到约9 0 以上， 原子几乎全部集中到纳米粒子的表面。由于纳米粒子表面原子数的增多使表面原 子配位数不足，表面能升高，从而容易与其它原子相结合而稳定下来，故具有很 高的化学活性。例如：金属的纳米粒子在空气中燃烧，无机的纳米微粒暴露在空 气中会吸附空