（生态学专业论文）矿物油污染土壤的菌根生物修复研究.pdf

捅要 本文对外生菌根真菌( e c m ) 在纯培养及与植物共生情况下对矿物油的降解效果 进行了研究，比较了不同接种条件、不同接种方式对土壤矿物油降解率的影响，筛选 出了植物与外生菌根真菌的最佳降解组合，并探讨了外生菌根真菌与专性降解菌、固 氮菌、v a 菌的联合降解效应。对外生茵根真菌促进降解的原因及对土壤酶活性的影 响也进行了研究。 研究结果表明，筛选出的的4 种外生菌根真菌均可以矿物油作为唯一碳源和能源 而使矿物油得到降解。培养基种类对外生菌根真菌的生物量和降解矿物油的能力有显 著影响，以有机氮作为氮源，尤其是提供少量容易利用的碳源作为启动碳源将大大提 高其生物量和矿物油降解率。随着油浓度的增加，菌体生物量呈现波动性变化，低浓 度刺激生长，高浓度抑制。矿物油对小麦和苜蓿种子的萌发和生长有明显的抑制作用， 随着油浓度增加，抑制作用增强。在二者的各项指标中，根或根与下胚轴的干重均随 油浓度增加呈现规律性下降，故可作为衡量土壤矿物油污染程度的较稳定指标。 在高浓度( 1 0 0 0 0 p p m ) 矿物油污染土壤上，外生菌根真菌仍然可侵染植物形成菌 根。菌根化植物的矿物油降解率及抗干旱、抗低温能力明显增强，并可持续发挥有益 作用，第二年某些共生组合可使油浓度降至正常水平。在单接种中，刺槐与e 2 菌，白 蜡与e 4 ，垂柳与e 4 茵为最佳降解组合。盆栽和田间实验均表明，外生菌根真菌混合 接种的降解效果好于单接种和双接种。不施肥接种的降解效果好于施肥接种。灭菌接 种使矿物油降解率有所提高，但效果不十分显著。灭菌处理使土壤真菌、细菌数量增 加，土壤过氧化物酶、过氧化氢酶活性提高，这可能是其降解率提高的主要原因。 外生菌根真菌与专性降解菌联合接种对植物生长的促进作用及对矿物油的降解 效果因植物而异，与固氮菌联合接种则抑制植物生长，降解效果低于单独接种。 接种外生菌根真菌可明显提高植物生物量和矿物油降解率，降解率最高比对照增 加3 2 3 。无论对内生或内外生菌根植物，接种e c m 菌都使土壤中细菌数量明显上升， 说明接种e c m 菌使土壤微生物数量增加是其促进降解的主要原因。接种e c m 菌使土壤 的酸性磷酸酶、过氧化物酶活性增加，多酚氧化酶活性降低，说明接种e c m 菌可促进 土壤有机污染物的转化、提高土壤肥力水平。 研究结果为矿物油污染土壤的菌根生物修复提供了理论指导和科学依据，为菌根 技术在有机污染土壤生物修复中的应用提供了借鉴。 关键词：外生菌根真菌矿物油土壤降解生物修复 ? 稚经悟符、导师同纛 匈垒文公布 a b s t r a c t t h e d e g r a d a t i o ne f f e c to fe c t o m y c o r r h i z a l ( e c m ) f u n g it om i n e r a lo i li np u r ec u l t u r e o rg r o ww i t hap l a n t p a g t l l e rw a s s t u d i e di nt h i sp a p e r o i l d e g r a d a t i o nr a t eo fs y m b i o t i c a s s o c i a t i o nu n d e rd i f f e r e n tc o n d i t i o n so rw i t hd i f f e r e n tm e t h o d so fi n o c u l a t i o nw a s c o m p a r e d t h eo p t i m u m c o m b i n a t i o n so fe c m f u n g ia n ds o m ep l a n t sw a ss c r e e n e df o r o i ld e g r a d a t i o n , a n dd e g r a d a t i o ne f f e c to fe c m f u n g ia s s o c i a t e dw i t hs p e c f f i cb a c t e r i ao r f u n g i ，a z o t o b ；a c t e r o rv a 触g iw a sd i s c u s s e d t h el i k e l ym e c h a n i s b so fe c m f u n g i e n h a n c e do i ld e g r a d a t i o na n di t si n f l u e n c et os o i le n z y m e a c t i v i t yw a s a l s od i s c 璐s e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a t4s p e c i e so fe c t o m y c o r r h i z a lf u n g is c r e e n e dw e r ea b l et o d e g r a d em i n e r a lo i l t h e i rb i o m a s sa n da b i l i t yo fo i ld e g r a d a t i o nv a r i e s 、聃t ht h ek i n do f c u l t u r em e d i u m s e v i d e n t l y t h e i rb i o m a s sa n do i ld e g r a d a t i o nr a t ew o u l di n e r e a s eg r e a t l y w i t ho r g a n i cn i t r o g e ns o b r c ea n dal i t t l e g l u c o s ea ss t a r t i n gc a r b o ns o u r c ei nt h ec u l t u r e m e d i u m e c mf u n g a lb i o m a s sf l u c t u a t e sw i t ht h ei n c r e a s eo fo i lc o n c e n t r a t i o n , e c m f u n g a lb i o m a s si n c r e a s e di nl o w e rc o n c e n t r a t i o nw h i l ed e c r e a s e di nh i g h e rc o n c e n l r a t i o n t h eg e r m i n a t i o na n dg r o w t ho fa l f a l f aa n dw h e a ts e e d sw a si n h i b i t e de v i d e n t l yw i t h i n c r e a s eo fo i lc o n c e n t r a t i o n ，t h ed r yw e i g h to ft h e i rr o o to rr a d i c e ld e c r e a s e dr e g u l a r l y w i t ht h ei n e a s eo fo i lc o n c e n t r a t i o na n dc a nb eu s e dt o j u d g et h ed e g r e eo f o i lp o l l u t i o n o f s o i l e c m f - n g ic a n i n f e c t e ds o m e p l a n t s a th i g h l y o i l - p o l l u t e d ( 1 0 0 0 0 p p m ) s o i l s t h e o i l d e g r a d a t i o nr a t e ， e n d u r a n c ea n dr e s i s t a n c eo f m y c o r r h i z a - a c c r e t e dp l a n t s e n h a n c e d e v i d e n t l y a n dc a na c ts u s t a i n i n g l y , o i lc o n c e n t r a t i o no fs o i ld e c r e a s e dt on o r m a ll e v e lb y s o m e s y m b i o t i c a s s o c i a t i o n si nt h en e x t y e a r t h e r e s u l t ss h o w e dt h a t o p t i m u m c o m b i n a t i o n sw e r eb l a c kl o c u s tw i t he 2 ，b u n g ea s ho rb a b y l o n w e e p i n gw i l l o w 、i t he 4 p o ta n df i e l de x p e r i m e n ts h o w e dt h a td e g r a d a t i o ne f f e c tw e r eb e t t e rw h e n p l a n ti n o c u l a t e d w i t h4s p e c i e so fe c mf u n g it o g e t h e rt h a nw i t ho n eo rt w os p e c i e s ，a n db e t t e ri n n o n - f e r t i l i z i n gt r e a l m e n ld e g r a d a t i o nr a t ee n h a n c e db u tn o tm a r k e d l yw h e ni n o c u l a t e d e c m f u n g ii ns t e r i l es o i lc o m p a r e dw i t hi nu n s t e r i l e ds o i l ，a n dt h i sm a y b ed u et ot h e a m o u n to f m i c r o o r g a n i s ma n d c a l a t a s ea n d p e r o x i d e s ea c t i v i t i e si n c r e a s e di ns t e r i l es o i l t h ee f f e c to fg r o w t ha n do i l d e g r a d a t i o nr a t ev a r i e dw i t hs p e c i e so fp l a n tw h e n i n o c u l a t e de c mf u n g ic o m b i n e dw i t hs p e c f f i cb a c t e r i ao rf u n g i ，b u tb o t hd e c r e a s e d c o m p a r e w i t h s i n g l ei n o c u l a t i o nw h e n c o m b i n e dw i t ha z o t o b a c t e r b i o m a s s o f p l a n t a n do i ld e g r a d a t i o nr a t ec a nb ei m p r o v e d e v i d e n t l yw h e n i n o c u l a t e d w i t he c m f u n g i d e g r a d a t i o nr a t ei n c r e a s e db y3 2 3 t h a nc o n t r o la tm o s t w h e t h e r e n d o m y c o r r h i z a lp l a n t o r e c t e n d o m y c o r r h i z a lp l a n t , t h e a m o u n to fb a c t e r i ai ns o i l i n c r e a s e d e v i d e n t l y i ni n o c u l a t e ds o i l ，t h i sm a yb et h em a i nr e a s o no f e c m f u n g if a c i l i t a t e o i l d e g r a d a t i o n a c i dp h o s p h a m s ea n dp e r o x i d a s ea c t i v i t i e s i n c r e a s e da n dp y r o g a l l i c a c t i v i t yd e c r e a s e dm a r k e d l y , s u g g e s tt h a te c mf u n g ii n o c u l a t i o nc a ni m p r o v e df e r t i l i t y l e v e lo f s o i la n dt h ea b i l i t yo f p l a n tt ot r a n s f o r m o r g a n i cp o u u t a n t t h er e s u l t s p r o v i d e d b a s i sf o rt h e a p p l i c a t i o n o fm y c o r r h i z a l t e c h n o l o g y t o b i o r e m e d i a t i o no f m i n e r a lo i lc o n t a m i n a t e ds o i l k e y w o r d s e c t o m y c o r r h i z a lf u n g i , m i n e r a lo i l ；s o i l ；d e g r a d a t i o n ；b i o r e m e d i a f i o n 矿物油污染土壤的菌根生物修复研究 引言 1 矿物油污染土壤的途径及危害 我国是一个土地资源匮乏的国家，人均占有耕地仅o 1 2 公顷，且还有不断减 少的趋势。土壤污染使土地资源紧张的状况进一步加剧，同时，土壤污染使得污 染物通过食物链进入人体的威胁大大增加，对人群健康和社会发展造成严重影响。 土壤、大气、水体等环境要素之间存在互相影响、互相制约的复杂关系，土壤污 染对大气和水体来说起着源和汇的双重作用，没有清洁的土壤就不可能有清洁的 空气、水源以及食品安全。 同大气和水相比，土壤污染具有隐蔽性、长期性和难恢复的特点，它不象水和 大气污染那样直观，土壤污染往往要通过粮食、蔬菜进入食物链，最后危及人畜的 健康情况才反映出来。因此，在很长时间内，土壤污染未能象大气和水体那样引起 人们的重视。与大气和水污染不同，大气和水的自由度比较大，污染物可通过扩散 和流动得以稀释和降解，而土壤的自由度极小，一旦遭受污染，想彻底恢复是比较 困难的。今天，土壤污染问题己引起人们的普遍关注，污染土壤修复已经成为发达 国家甚至发展中国家环境污染整治的重点。如美国每年投资上百亿美元的超级基 金，主要用于污染土壤与地下水的修复。我国也开始重视污染土壤的修复。对污染 土壤进行修复，使其恢复正常的生态功能和生产功能，是社会和经济可持续发展的 需要。 土壤中的有机污染物，由于其在环境中的持久性和对人体健康的潜在威胁、越 来越得到人们的关注。残留在土壤中的有机污染物，不仅改变土壤正常的结构和功 能，影响植物生长，而且还通过食物链进入人体、对人体的健康造成不可估量的影 响。因此、如何消除土壤有机污染以修复被污染的土地，成为环境研究领域里一个 非常重要的课题。在土壤有机污染物中，石油污染是一大类。石油是目前人类最主 要的能源之一“1 。当今世界上石油的总产量，每年约有2 2 亿吨，其中1 7 5 亿吨是 由陆地油田生产的“3 。仅石油污染一项每年全世界就有8 0 0 万吨进入环境。中国作 为世界上最大的发展中国家和石油生产、消费大国，由于生产条件、环保技术等方 面相对落后，石油污染问题相当突出，尤其是土壤的石油污染问题日益严重。据统 计，我国有各类污染土壤0 6 亿公顷，占现有耕地面积1 3 6 亿公顷的4 0 以上，其中 有机污染土壤面积约为0 2 亿公顷。在有机污染土壤中，石油污染占相当比例。我 国自1 9 7 8 年原油年产量突破l 亿吨大关而成为世界十大产油国之一以来，目前勘探 开发的油气田和油气藏已有4 0 0 多个，年产石油污染土壤近1 0 万吨，累计堆放量近 东北林业大学博士学位论文 5 0 万吨0 1 。以油田为例，每口油并污染的土地面积为2 0 0 5 0 0 m 2 ，全国共有油井2 0 万口，由此造成的土壤污染可达8 0 0 0 万m 2 ，这一数值每年还在增长中。1 9 9 8 年，全 国石油、炼化企业产生含油固体废物量达4 2 9 万吨，利用率低于5 0 ，由此造成的土 地污染可达5 0 0 万亩，我国每年有6 0 万吨石油经跑、冒、滴、漏途径进入环境，对 土壤、地下水、地表水造成污染。具不完全统计，全国因使用污水灌溉而导致的土 壤污染面积约3 0 0 0 万亩，如沈抚灌区长期使用含油污水进行灌溉，严重污染面积达 1 4 万亩，全国类似农田有1 5 0 万亩。随着石油开采和使用量的增加，大量的石油及 其加工品进入环境，不可避免地对环境造成了污染，给生物和人类带来严重危害。 目前，石油污染问题已成为世界各国普遍关注的环境问题之一。 1 1 土壤中矿物油的来源、组成及其在土壤中的分布 1 1 1 土壤中矿物油的来源 矿物油污染泛指原油和石油初加工产品( 包括汽油，柴油，重油，润滑油等) 及各类油的分解产物引起的污染。随着工业的发展，人为地造成矿物油污染的状 况日益增多，如石油开采、石油炼制、石油化工、输油管道的破裂、运输事故、 清洗油船、汽车、工厂等，都给环境带来严重污染。土壤中的矿物油主要来自以 下几个方面m ： 污灌：含油污水的农灌是大面积土壤遭受矿物油污染的最主要原因。含油污 水的矿物油含量一般较高，长期灌溉必然导致土壤中的矿物油含量增高。含油 工业污水主要来自石油开采、加工和运输等部门。 大气污染：大气污染物沉降是土壤矿物油含量增加的另一重要因素。在工业发 达、大气污染严重的区域尤为如此。有研究表明：大气降尘污染区的土壤矿物油 含量比对照区高卜2 倍。 溢油事故：石油及其产品在开采、运输、使用、贮存过程中的泄漏、溢油等现 象时有发生。当事故发生在陆地上时，大量油类便直接进入土壤，给土壤带来 严重污染。 车辆污染：汽车尾气含有多种矿物油成分，这些成分大都以沉降的形式进入 土壤，使车辆繁多的的公路两侧的土壤受到相当于甚至超过污灌、大气污染所 造成的矿物油污染。 油类作为药剂施用：油类可直接喷于果树等作为杀虫剂使用，同时也可作为各 种杀虫剂、防腐剂及除草剂的乳化剂或溶剂。所有这些都可能增加土壤矿物油 2 矿物油污染土壤的菌根生物修复研究 的含量。 含油矿渣、含油垃圾、含油污泥的堆放或处理后作为有机肥施用。 有的土壤生物可合成矿物油的某些成分，但是极其微量、不足以污染土壤。 1 1 2 矿物油的组成及特点 矿物油的成分因油的品种、产地而异，如石油是一种含有烃类和少量其它有 机物的复杂混合物，典型样品的烃类组份包括2 0 0 3 0 0 种；分属烷烃、环烷烃和 芳香烃，其中非烃类组分包括环烷酸、酚、杂环氮和硫化物等。石油经分馏得到 各种产品，如汽油( c 。- c 。) 、煤油( c 。- c 。，) 、柴油( c 。2 _ c 。) 等。石油烃类在土壤 中主要以4 种状态存在：气态、溶解态、吸附态、自由态，其中被土壤吸附和存 留于毛管孔隙的那部分是不易迁移的，治理较困难；以气态、溶解态和单独的一 相存留于非毛管孔隙的石油烃类物质迁移性较强，容易造成污染范围的扩大，甚 至引起地下水污染。 石油烃类污染物进入土壤后，会破坏土壤结构，分散土粒，使土壤的透水性 降低。其反应基与无机氮、磷结合并限制硝化作用和脱磷酸作用，从而使土壤有 效磷、氮的含量减少。现已确认，具有致癌、致畸、致突变潜在性的化学物质中， 有许多是石油或石油制品中所含的物质，如苯并( a ) 芘、苯并蒽等多环芳烃类物 质；另外，石油烃类对强酸、强碱和氧化剂都有很强的稳定性，在环境中残留时 间较长。 1 1 3 矿物油在土壤剖面上的分布 土壤矿物油在土壤剖面上的分布与土壤中矿物油的浓度及其在土壤中的持留 时间及土壤水分条件有关。油浓度越高，在土壤剖面上的分布便越深；油的持留 时间越长，越易进入下层土壤；壤孔隙度越高，矿物油越易渗入下层土壤。土 壤矿物油在剖面上的分布越深，越易污染地下水。侧如在质地粗糙的砂土地带， 曾发现有因污灌渗漏引起浅层地下水遭受油的轻微污染现象，因此在砂土地带不 能进行污水灌溉0 1 。 一般情况下，由于土壤矿物油在旱地土壤中大多为土粒固定，在水田中大都 漂浮于水面，所以其污染地下水的机会相对较小。r a y m o n dr l 和r i n c a n n o n c b 等人对土壤渗析水的分析证明，油并没有由于水的流动而从试验小区中消失“1 。 国内研究也表明。“1 ，张士、沈抚污水灌区草甸棕壤中的矿物油污染物主要集中分 东北林业大学博士学位论文 布于耕作层( 0 - 2 0 c m ) 以内，并不因污水灌溉而沿剖面向下淋溶或移动。因此， 土壤矿物油污染主要对农田作物影响较大。 1 2 土壤矿物油的污染效应 矿物油进入土壤后给土壤生态系统带来一系列复杂的影响，其污染效应主要 表现在以下几方面。 1 2 1 矿物油对壤微生物的影响 矿物油进入土壤，对土壤微生物的影响是多方面的。矿物油改变了土壤有机 质的组成和结构，使土壤有机质的c n 和c p 发生改变，从而导致土壤微生物区 系的变化。少量矿物油进入土壤，不至于造成土壤孔隙的堵塞，土壤微生物受到 的不利影响较小，相反，增加的土壤有机质还有利于促进土壤微生物活性。但是， 当大量矿物油进入土壤后，不仅会堵塞土壤孔隙而影响土壤通透性，造成对微生 物的不利影响，而且会包裹大量土壤结构体的活性表面，这些活性表面正是微生 物活动的良好场所，它们的减少必然影响土壤微生物活性。研究表明m ，在草甸 棕壤中，矿物油对细菌的抑制作用较明显，对真菌、放线茵的抑制作用较弱。低 浓度矿物油对固氮菌有刺激作用，高浓度则抑制；矿物油对硝化细菌的代谢作用 有明显的抑制效应。h e r s l l m a n 等嗍的研究表明，当土壤矿物油浓度小于1 0 时， 土壤中的放线菌和总细菌数量不受影响，但真菌数量明显减少，固氮菌活性降低， 土壤糖类的矿化率降低。 1 2 2 矿物油对土壤酶活性的影响 矿物油对土壤酶的影响随矿物油成分和土壤类型的不同而不同。草甸褐土施 入矿物油后，对脲酶、蛋白酶、碱性磷酸酶活性均有抑制作用，其抑制程度为脲 酶 蛋白酶 碱性磷酸酶嘲。杨桂芬“帕用不同浓度的原油，添加到土壤中进行 水稻和小麦的盆栽模拟试验，结果发现，原油对脲酶有明显的抑制作用，对蔗糖 酶稍有抑制，对磷酸酶、过氧化氢酶和蛋白酶抑制不明显。当添加的油浓度为 5 0 0 p p m 时，小麦盆栽土中的脲酶抑制率为3 9 5 ；蔗糖酶的抑制率为1 4 3 ；水 稻盆栽土中脲酶的抑制率为6 4 7 ；蔗糖酶没有受到抑制。因此她认为用脲酶作 为检验土壤石油污染程度的指示酶是可行的。国外一项研究表明“”，原油及其产 品投入土壤后，土壤脱氢酶活性均比对照高，原油对脱氢酶活性的促进作用最强， 4 矿物油污染土壤的菌根生物修复研究 其次是加铅汽油、柴油和发动机油，各类油对土壤脱氢酶活性的刺激效应随投油 量和投入油后的时间而变。 土壤酶的种类和活性强弱与土壤理化性质及生活在土壤中的生物群落，尤其 是微生物区系有关。矿物油进入土壤，不仅可以引起土壤理化性质的变化，而且 可能引起土壤生物群落如微生物区系的变化，这些变化的结果必然导致土壤酶种 类和活性强弱的变化。因此，土壤矿物油对土壤酶之影响与土壤矿物油对土壤其 它因素的影响密切相关。 1 2 3 矿物油对作物生长的影响 关于矿物油对植物的影响问题，k n i g h t 和d e o n g 等人于1 9 2 9 年研究表明， 矿物油可直接经表皮渗入细胞，并在植物体内进行再分配由根部向叶或由叶向 根运转。同时指出，这种渗入的动力是物理的渗透压作用，而非生物呼吸作用。 但是，矿物油对植物生理作用则有影响，具体表现为能降低植物的蒸腾作用，加 强呼吸作用以及减少光合作用率等。在石油污染物对植物的危害上，低分予烃 比高分子烃危害大，主要是因为它能穿透进入植物组织内部，破坏植物正常的生 理机能。高分子烃可能因分子较大而穿透能力差，但高分子烃易在植物表面形成 一层薄膜，阻塞植物气孔，影响植物的蒸腾和呼吸作用“”。 矿物油对作物生长的不利影响主要表现为：发芽出苗率降低，各生育期推迟， 贪青晚熟，结实率下降，抗倒伏、抗病虫害的能力降低等。当然，不同作物受油 的影响是不同的。如矿物油对水稻生长发育的影响较小，而对各种不同土壤上生 长的小麦都有很大影响，随着油浓度的增加，小麦生物产量、经济产量、于粒重 等都逐渐减少，浓度达5 0 ，0 0 0 p p m 时，小麦幼苗全部死亡哪。有研究表明：石油 能阻止或抑制玉米属作物种子、辣椒种子发芽，其抑制率与种子接触石油的时间 长短有关，接触时间越长，发芽率越低，恢复发芽所需的时间越长。地衣、苔藓 类植物对石油污染物的影响极为敏感，因此，它们常用作石油污染的指示植物“”。 吴维中发现，沈抚灌区一般年度水稻有轻度贪青，而在周期性的低温年，水稻则 大面积减产，这是土壤遭受有机物污染的结果。另一方面，原油能促进某些植物 的生长，如f e s t u c ar u b r a ，p u c c i n e l l i am a r i t i m a “”和t r i f o l i u mr u b r a “”。这种现象的 机理并不清楚，但生长促进可能是原油或原油杀死的动物或细菌释放养分或生长 调节物质的直接结果o ”。 东北林业大学博士学位论文 1 3 土壤矿物油的残留效应 矿物油进入土壤，经过一系列作用后，在土壤、作物籽实中都有残留，其残留 量与土壤矿物油含量呈显著正相关“。研究表明，土壤中苯并芘( b a p ) 残留与 矿物油投加浓度密切相关“1 。盆栽土壤中加入3 0 0 p p m 矿物油后，稻米中矿物油的残 留量显著增加，且残留量随着加入的矿物油量的增加而递增“。虽然有些作物如水 稻的生长发育和产量受油的影响较小，但作物体内和果实的矿物油残留却很高，不 利于人畜食用。如沈抚污灌区长期使用含油污水灌溉。尽管水稻的生长发育和产量 基本不受影响，但其品质大半已变劣而发出不良气味，造成此况的根本原因是大米 的矿物油残留超标，并由此引起大米其它营养成分的变化。实验分析表明“”，在污 染严重地块，大米籽实中有多量的甲苯、乙醛类物质积累，产生异味，说明这是矿 物油污染的结果。矿物油在土壤、作物体的主要残留毒害成分是多环芳烃、苯、甲 苯等。这些物质已被证明具有致癌性，尤其土壤中的多环芳烃类物质属强致癌物， 可通过呼吸、皮肤接触、饮食摄入等方式进入人或动物体内，影响肝、肾等器官的 正常功能，甚至引起癌变。多环芳烃在食物中的残留还会影响到食物的品质，如氨 基酸降低，各营养成分发生不良转化等。多环芳烃在作物种子中的残留，会引起种 子的新陈代谢突变，这种突变产生的副产物不仅影响种子的萌发，而且会对食用者 人畜带来不利影响。 6 矿物油污染土壤的菌根生物修复研究 2 矿物油污染土壤的生物修复 土壤是大气、水体及固体废弃物中的污染物在环境中迁移、滞留和沉积的目标， 是长期环境污染的承受者。随着社会经济的飞速发展和人口的不断增加，土壤作为 人类赖以生息的资源，越来越暴露出不堪重负的迹象。随着我国工农业的迅速发展， 各种农药及化学品的数量、种类剧增，其不合理的使用、处置或突发性泄漏，往往 造成严重的土壤污染。土壤污染不仅导致粮食的污染和减产、威胁人体健康和生命 安全，而且通过对地下水的污染以及污染的转移构成对人类生存环境多个层面上的 不良胁迫“”。被污染的土壤可通过污染物迁移对地表水和地下水造成二次污染，或 经土壤一植物系统由食物链进入人体，危害人体健康。因此，对土壤生态环境的保 护和治理已引起人们的普遍关注，成为全球范围面临的迫切任务之一。 土壤污染的研究起步较晚，与大气、水体污染的研究相比，在研究的规模、深 度、广度上都存在很大差距。这除了主观上人们对土壤污染的严重性认识不足外， 土壤本身的复杂性、污染的潜在性、间接性和净化困难也是重要原因。鉴于土壤污 染的严重危害，近年来世界各国都开始重视污染土壤修复技术的研究，各发达国家 纷纷制定了土壤恢复计划。荷兰、德国、日本、美国等国家都先后投入了大量资 金用于污染土壤的恢复研究和应用，德国在1 9 9 5 年投资约6 0 亿美元净化士壤，美国 9 0 年代用于土壤修复的投资额超过百亿美元“”，尤其有关生物修复技术方面的研究 更是备受关注。对于土壤污染的修复技术与方法，国外自7 0 年代末8 0 年代初已开始 研究。初期一般采用物理和化学方法进行污染士壤的修复，如热处理法和化学浸出 法，但费用昂贵，不适于大面积应用。8 0 年代末和9 0 年代初期，国外开始研究基于物 理、化学、生物过程的利用微生物、植物分解代谢土壤污染物的方法即生物修复技 术，生物修复技术近几年发展非常迅速，不仅较物理、化学方法经济，同时也不易产 生二次污染，更适于大面积污染土壤的修复。 石油工业是国家综合国力的重要组成部分，但石油开采、石油化工行业的发展 及石油产品的广泛使用，使石油污染成为当今世界性公害之一。石油类污染物进入 环境，不仅对土壤造成污染，影响土壤质量与正常的生物学活性，影响农作物生长、 品质与安全性及地下水和地表水质量，也给人类健康、生态环境质量以及社会持续 发展带来极大的威胁。鉴于石油污染的危害性及石油污染的全球性，发达国家实施 了相应的石油污染治理计划，包括石油污染土壤的物理、化学和生物修复项目。其 中生物修复因具有安全性、非破坏性和经济性的优点而愈来愈受到各国的重视，被 列为重点发展技术并被普遍采用。目前，生物修复技术已成为环境保护领域最有价 7 东北林业大学博士学位论文 值和最具生命力的污染修复技术之一“2 “。生物修复技术已得到世界环保部门 的认可，并引起了工业界的关注，预计市场对生物修复技术服务及其生物产品的需 求平均每年增长1 5 1 。在英国和法国，有5 至1 0 的土壤使用了生物修复剂。可 以预见，土壤生物修复技术的市场前景十分广阔，在污染土壤和地下水修复中将扮 演越来越重要的角色。 2 1 生物修复的发展历程 1 9 7 2 年美国清除宾夕法尼亚州的a m b l e r 管线泄漏的汽油是史料所记载的生物 修复技术的首次应用。开始时生物修复的应用规模很小，处于试验阶段直到1 9 8 9 年，美国阿拉斯加海域受到大面积石油污染以后，才首次大规模应用生物修复技术 。”。生物修复受污染的阿拉斯加海滩的成功，最终得到了环保局的认可，所以说阿拉 斯加海滩溢油的生物修复是生物修复发展的里程碑嘶4 1 。生物修复因其良好的恢复 效果而显示出巨大的魅力，因此也引起了世界各国越来越多的关注和研究。美国从 1 9 9 1 年开始实施庞大的土壤、地下水、海滩等环境危险污染物的治理项目，并称之 为“超基金项目“”1 。欧洲各发达国家从2 0 世纪8 0 年代中期就对生物修复进行了初 步研究，并完成了一些实际的处理工程。其生物修复技术可与美国并驾齐驱，德国、 荷兰等国位于欧洲前列。我国的生物修复技术处于刚刚起步阶段，在过去的1 0 年中 主要是跟踪国际生物修复技术的发展，大面积应用的例子还较少。最初的生物修复 主要是利用细菌治理石油、农药之类的有机污染。随着研究的不断深入，生物修复 已由细菌修复拓展到真菌修复、植物修复、动物修复及植物一微生物联合修复，由有 机污染物的生物修复拓展到无机污染物的生物修复。 2 2 生物修复的概念和特点 2 2 1 生物修复的概念 所谓生物修复田1 ，广义上就是利用微生物、植物和动物将土壤、地下水或海洋 中的危险污染物降解、吸收或富集的生物工程技术系统。土壤生物修复是利用生物 的生命代谢活动减少土壤环境中有毒有害物质的浓度或使其完全无害化，从而使污 染了的土壤环境能够部分地或完全地恢复到原初状态的过程。相同的表达有生物恢 复( b i o r e s t o r a t i o n ) ，生物清除( b i o d i m i n a f i o n ) 或生物再生( b i o m c l a m a t i o n ) 。相近的 概念是生物净化( b i o p u r i f i c a t i o n ) 汹1 ，但生物净化是指自然生态系统中生物对外源 8 矿物油污染土壤的菌根生物修复研究 污染物进行的自发清除过程，而生物修复则强调人为控制条件下生物技术的应用 捌 2 2 2 生物修复的特点 生物修复的原理主要是利用天然的或接种的生物并通过工程措旌为生物生长 与繁殖提供必要的条件，从而加速污染物的降解或去除，使其浓度降至环境标准规 定的安全浓度之下“1 。 生物修复的主要优点有啪。3 ”：( 1 ) 费用低。生物修复技术的成本是所有处理技术 中最便宜的，其费用约为焚烧处理的1 3 i 4 。( 2 ) 处理效果好。经过生化处理， 污染物残留量可达到很低水平。( 3 ) 对环境影响小，生物修复只是一个自然过程的强 化，其最终产物是c 0 2 、水和脂肪酸，不会形成二次污染。( 4 ) 可就地处理。其他技 术难以使用的场地，可以采用就地生物修复技术，既避免了集输过程的二次污染， 又节约了处理费用，同时不破坏植物生长所需要的土壤环境。( 5 ) 应用范围广。可 同时处理受污染的地下水，具有独到的优势。因此，环境科学界认为，生物修复技 术比物理、化学处理技术更具发展前途，它在土壤恢复中的应用价值是无可估量的。 2 3 生物修复的类型 根据所选用的生物体的种类，目前生物修复主要分三种类型，即微生物修复、 植物修复和植物一微生物联合修复。此外还有动物修复、酶修复等，但这方面研究 较少。 、 2 3 1 微生物修复 一般是根据土壤污染状况，富集、驯化土著微生物，或人工接种培养代表性 的土壤微生物，以研究土壤微生物受土壤污染的影响变化，及土壤的污染物含量 变化。早期的生物修复主要指微生物修复，微生物修复是研究的最早、最深入、 应用也最为广泛的一种生物修复方法。由此产生一系列生物修复技术如现场处理、 就地处理、堆肥、生物反应器等。这些修复技术的主体均是微生物应用这些技 术处理污染土壤已有广泛的研究。许多研究表明，微生物降解是去除土壤有机污 染物的主要途径，其它生物修复技术也都离不开微生物的作用。 从微生物的来源看，应用于生物修复的降解菌可分为土著菌、外来菌和基因 工程茵。实际修复中常应用从污染土壤中分离出来的专性降解菌，经扩大培养后 9 东北林业大学博士学位论文 再回接到土壤中，效果较好。土壤中经常大量存在着各种各样的微生物，在受到 有毒有害有机物的污染后，实际上就是一个自然驯化选择过程，一些特异的微生 物在污染物的诱导下产生分解污染物的酶体系，可将污染物降解转化。目前在大 多数实际的生物修复中应用的都是土著微生物。土著微生物虽然在土壤中广泛地 存在，但其生长速度较慢，代谢活性不高，或者由于污染物的存在造成土著微生 物的数量下降，致使降解污染物的能力降低，因此，在污染物的实际处理过程中， 需要考虑在污染土壤中接种多种降解污染物的高效降解菌。外来菌的特点是代谢 能力强，降解效率高，缺点是会受到土著菌的竞争，只有大量接种才能形成优势。 基因工程菌是利用基因工程技术将多种降解基因转入同一种微生物中，使其具有 广谱降解能力的微生物，其研究工作已取得一些成果，但其环境安全问题仍存在 很大争议，实际应用仍受严格限制。微生物修复可分为微生物法和微生物生态法。 微生物法 该法利用一种或数种能力较强的主要微生物进行生物修复，通过人为提高有 关的微生物浓度可使生物降解能力明显增大。采用微生物法治理污染土壤时，所 用的菌种有两个来源。一是使用对特定污染物有较强降解能力的成品菌株，这些 菌株通常筛选自其他污染地点，采用传统筛选方法从自然界获取。此外，还可采 用诱导或离子辐射等方法加快微生物的变异速度，亦可通过基因工程获取性能优 良的工程菌( g e m s ) 。二是使用取自污染现场的有较强降解能力的菌株。分离到 所需性能的微生物后，从中挑选出有较强降解能力的菌株并进行大量培养，用高 浓度菌液治理污染土壤，适时添加营养物使所加微生物保持较高活性。 微生物生态法 微生物生态法侧重于识别影响当地微生物种群降解速率的某些物理和化学因 素。通过适时调整这些因素，污染物的生物降解速率可明显加快，采用微生物生 态法的前提是，污染现场原有的微生物群在适宜的条件下具有降解污染物的能力。 采用微生物生态法时不需确定被污染土壤中微生物的种类和数量，而是侧重于识 别制约微生物降解能力的主要因素。通过跟踪检测污染物浓度的变化情况，评估 出各种因素的影响程度，一旦确定主要因素后，即可采用相应的改善措施，提高 其降解力。 近二十年来，人们对应用微生物降解环境污染物越来越感兴趣。微生物修复具 有以下优点：成本低，其处理费用约为热处理的1 3 一i 4 、理化处理的i 2 一i 3 ：对 环境影响小，如使用得当不会带来二次污染啪：处理形式多样，可进行原位、异位 及原位一异位联合修复：其中原位修复操作简单，不破坏土壤环境。此外，某些微 l o 矿物油污染土壤的菌根生物修复研究 生物可在极端环境条件下生存，若通过基因技术使其具有高效降解能力，则对治理 特殊环境条件下的污染有利。 其缺点为某些微生物只能降解特定类型污染物；有些情况下不能将污染物全 部去除，修复剂或微生物，酶制剂可能带来次生污染问题，并对自然生态过程产生 一定影响；加入到修复现场环境中的微生物可能由于竞争或难以适应环境而导致作 用结果与实验结果有较大出入【3 3 3 4 l 。微生物修复受各种环境因素的影响较大，温 度、湿度、氧气状况、p h 等均可影响微生物活性从而影响修复效果。因此，为降 解菌提供适宜的环境条件以促进其生长增殖至关重要。与物理法、化学法相比，这 一技术治理污染土壤的时间相对较长。 2 3 2 植物修复 植物修复技术是以植物忍耐和超量积累某种或某些化学元素的理论为基础， 利用植物及其共存微生物体系清除环境中的污染物的一门环境污染治理技术。”。 它是利用植物及其微生物与环境之间的相互作用，对环境污染物质进行清除、分 解、吸收或吸附，使土壤环境重新得到恢复。植物修复技术兴起于2 0 世纪5 0 年代人们对非耐性植物和耐性植物的耐重金属机理的研究。广义的植物修复技术 包括利用植物修复重金属污染的土壤，利用植物净化空气、利用植物清除放射性 核素和利用植物及其根际微生物共存体系净化土壤中有机污染物四个方面1 。 植物修复可以利用土壤植物微生物组成的复合处理系统来共同降解污染 物，它有以太阳能为动力的“水泵”、“植物反应器”及与之相连的“微生物转化 器”和“土壤过滤器”，因而该系统是一个强大的“活净化器川。这里的有机体 密度最高，生命活动最旺盛，由于植物、土壤胶体、土壤微生物区系及酶的多样 性，该系统可通过一系列物理、化学和生物学过程，对环境中的污染物进行吸附、 离子交换、沉淀、降解等净化作用，如能配合适当的环境工程措施，就可在整体 上起到利用资源、节省能源、化害为利、保护环境的重要作用，因此，植物修复 是一种廉价、有效、颇有发展潜力的生物修复技术。与微生物修复相比，植物修 复更适用于现场修复且操作简单，容易大面积应用，因而近年来有关研究较多， 有的已达到野外实际应用水平啪1 。 植物修复有机污染土壤的机理包括侧：1 ) 植物对有机污染物的直接吸收和降 解2 ) 植物释放分泌物及促进化学反应的酶3 ) 植物强化根际的微生物降解4 1 植物对污染物的固定和挥发。 研究表明，由于植物的根际作用，根圈内有机碳、p h 值、生物活性和无机可 东北林业大学博士学位论文 溶性组分发生变化，根际微生物的数量和活性均明显高于非根际带，根圈作用能 明显促进石油及其它难降解有机污染物的生物降解口9 帅】。n i c h o l s 【4 1 】通过研究认为 植物根区土壤中的微生物比非根区土壤中的微生物种类和数量都要多，因而加速 了污染物的降解。r e i u y 4 2 1 研究多环芳烃( p a i l s ) 降解时发现在植物根区微生物密 度增加，p a h s 的降解也增加。植物的存在亦可增加土壤通气性，刺激好氧微生物 对有机污染物的分解。此外，根分泌物及其对根际环境的影响，也能促进土壤有 机污染物的转化降解，或成为微生物共代谢的原料。研究表明，植物对难降解p a i l s 的生物去除有明显的强化作用“。 在植物选择上，植物对污染物的同化能力是需要优先考虑的一个重要方面，研 究表明，不同植物之间同化有毒物质的能力存在显著差异，如同样条件下，枫树对 大气中苯的吸收量比榆树高数百倍，比白桑树高数千倍。黑麦草可从土壤中吸收大 量的苯并( a ) 芘，对水体中苯并( a ) 芘的积累量也比周围水体高数千倍m 1 。因此筛选 具有特异同化能力的植物是植物修复技术的关键。杨柳科的植物尤其是杨柳属，已 被证实通过吸收有机物至根部，可大量去除土壤及地下水中的有机污染物“町。研究 植物释放的酶也可作为筛选修复植物的依据之一。其次，理想的修复植物应具有易 存活、生长快、生物量大、适应性强、根系发达等特点。植物的根是植物与污染物 最密切