（植物学专业论文）拟南芥cbf1基因的克隆及其对香蕉胚性悬浮细胞转化的研究.pdf

中山大学硕士学位论文2 0 0 5 年5 月 拟南芥c b f l 基因的克隆 及其对香蕉胚性悬浮细胞转化的研究 专业：植物学 申请人：肖宁 导师：黄学林教授 摘要 香蕉( m u s as l a p ) 是热带、亚热带地区最重要的农作物之一，具有很高的 经济价值。冷害已给香蕉的生产带来了极大的威胁，造成了巨大的经济损失。因 此，培育出抗寒、抗冻的优质品种是香蕉产业持续发展的保证之一。常规育种因 多数香蕉栽培种是三倍体而具有高度不育等特性而不易实现，而利用组织培养并 结合基因工程技术可望实现这一目的。 针对以上问题，本论文以本实验室已经建立的龙牙蕉( a a b ) 和贡蕉( a a ) 胚 性悬浮系为基础，从拟南芥中克隆抗寒相关基因国仃基因并通过根癌农杆 菌的介导导入龙牙蕉胚性悬浮细胞和贡蕉胚性悬浮细胞，以研究该基因的转化对 上述香蕉抗寒性的影响。 根据g e n b a n k 中野生型拟南芥( a r a b i d o p s i st h a l i a n a ) c b f l 基因的c d s 全序列，设计特异引物扩增出该基因的开放读码框序列。同时，以p b a 0 0 2 和 p c a m b i a 2 3 0 1 质粒载体为基础，构建了中间载体( 命名为p b a c b f l ) 和表达载体 ( 命名为p c a m b i a - c b f l ) 。p c a m b i a c b f i 质粒载体含在c a m v 3 5 s 启动子调控下的 c b f l 基因的开放读码框序列、g u s 基因和肋f 基因。以根癌农杆菌e h a l 0 5 为 媒介，转化龙牙蕉胚性悬浮细胞和贡蕉胚性悬浮细胞，经含5 0 m g l 卡那霉素 ( k a n ) 和适当浓度头孢拉定( c e f ) ( 在继代过程中浓度由5 0 0 m g l 降至2 0 0 m g l ) 的相应的培养基筛选培养，获得了拟转基因龙牙蕉植株和贡蕉体胚。占姆基因表 中山大学硕士学位论文2 0 0 6 年5 月 达的组织化学染色表明不同培养阶段的龙牙蕉培养物均可显蓝色，表明g u y 基因 已经成功导入并整合至龙牙蕉基因组中：g u s 基因的瞬时表达检测显示共培养6 天的贡蕉胚性悬浮细胞培养物呈蓝色。研究结果还表明，在共培养时加入诱导剂 乙酰丁香酮( a s ) 并不利于农杆菌e h a l 0 5 介导对贡蕉细胞的遗传转化。 关键词：龙牙蕉，贡蕉，胚性悬浮细胞，拟南芥c b f i 基因，p c a m b i a c b f l ， 根癌农杆菌e h a l 0 5 ，转化， g u s 中山大学硕士学位论文2 0 0 6 年5 月 c l o n i n go fc b f lg e n ef r o ma r a b i d o p s i s t h a l i a n aa n d t h er e s e a r c ho fi t st r a n s f o r m a t i o nt oe m b r y o g e n i cc e l l s u s p e n s i o n so fb a n a n a ( m u s a 。s p p ) m a j o r ：b o t a n y n a m e ：x i a o n i n g s u p e r v i s o r ：p r o f h u a n g x u e - l i n a b s t r a c t b a n a n a ( m u s as p p ) i so n eo ft h ei m p o r t a n tt r o p i c a la n ds u b t r o p i c a lc r o p s ，a n di t h a sg r e a te c o n o m i cv a l u e t h ec h i l l i n gi n j u r yh a ss e r i o u s l ya f f e c t e dt h eb a n a n a y i e l d t h e r e f o r e ，b r e e d i n gp r o g r a m sa r er e q u i r e di nw h i c hc o l do rc h i l l i n g r e s i s t a n t b a n a n ac u l t i v a r sn e e d st ob eb r e d ，t oe n s u r ei t sc o n t i n u a b l ed e v e l o p m e n t a t t e m p t sa t d e v e l o p i n gc u l t i v a r sr e s i s t a n tt ot h i ss t r e s su s i n gc o n v e n t i o n a lb r e e d i n gt e c h n i q u e s h a v eh a dv e r yl i m i t e ds u c c e s s ，b e c a u s eo ft h eh i g hs t e r i l i t ya n dt r i p l o i do fm o s t b a n a n ac u l t i v a r s h o w e v e r , u s i n gt h eg e n e t i ce n g i n e e r i n gt e c h n o l o g i e ss h o w sav e r y p o t e n t i a lt or e s o l v et h i sp r o b l e m i n t h i s s t u d yb a s e do nt h ee s t a b l i s h m e n to fe m b r y o g e n i cc e l ls u s p e n s i o n s ( e c s s ) o ft h em u s aa a bs i l k “g u o s h a n x i a n g ”a n dt h em u s aa c u m i n a t ee v m a s ( a a ) a to u rl a b o r a t o r y , w ec l o n e dt h ec b f lg e n eo fa r a b i d o p s i st h a l i a n aw h i c hi s c o r r e l a t i v et ot h ec o l d r e s s i s t a n ta n dc o l da c c l i m a t i o n t h e nt r a n s f o r m e di tt ot h e b a n a n ae c s ss oa st ou n d e r s t a n dt h ee f f e c t so fi tt ot h ec o l d - r e s s i t a n lo fb a n a n a o r fo fc b f lg e n ew a sc l o n e db yp c ra n dt h ep c r p r i m e r sw e r ed e s i g n e d a c c o r d i n g 的t h ec d ss e q u e n c e so ft h ea r a b i d o p s i st h a l i a n ai nt h eg e n b a n k t h e m i d d l ev e c t o r ( n a m e dp b a c b f l ) a n dt h ee x p r e s s i o nv e c t o r ( n a m e dp c a m b i a - c b f l ) 中山大学硕士学位论文2 0 0 6 年5 月 w e r ec o n s t r u c t e di nt h eb a s i co ft h ep l a s m i dv e c t o r sp b a 0 0 2a n dp c a m b i a 2 3 0 1 t h ep c a m b i a - c b f lp l a s m i dc o n t a i n e do r fs e q u e n c eo ft h ec b f lg e n eu n d e r c o n t r o lo ft h ec a m v 3 5 sp r o m o t e r , t h eg u sg e n ea n dt h en p mg e n e t h e n t r a n s f o r m e di tt ot h ee c s so ft h em u s aa a bs i l k “g u o s h a n x i a n g ”a n dt h em u s a a c u m i n a 据c v m a sm e d i a t e db yt h ea g r o b a c t e r i u me h a l 0 5 t h ep u t a t i v et r a n s g e n i c p l a n t l e t so fm u s aa a bs i l k “o u o s h a n x i a n g a n dt h es o m a t i ce m b r y o so fm u s a a c u m i n a t ec v m a sw e r es e l e c t e db yc u l t u r i n gt h e mi nt h er e l e v a n ts e l e c t e dm e d i u m s u p p l e m e n t e dw i t h5 0m g lk a n a m y c i n ( k a n ) a n dc e f r a d i n ( c e f ) ( t h ec o n c e n t r a t i o n w a sr e d u c e df r o m5 0 0 m g lt o2 0 0 m g ld u r i n gt h es u b c u l t u r i n g ) t h eh i s t o c h e m i s t r y d y eo ft h ee x p r e s s i o no ft h eg u sg e n ei na l lo f t h em u s aa a b s i l k “o u o s h a n x i a n g ” c u l t i v a r sh a db l u es t a i n e d ，s h o w e di th a sa l r c a d yb e e nt r a n s f o r m e dt ot h em u s aa a b s i l k “o u o s h a n x i a n g ”a n di n t e g r a t e dt ot h eg e n o m eo fi t t r a n s j e n te x p r e s s i o no fg u s g e n ei ns o m a t i ce m b r y o so ft h em u s aa c u m i n a t ec v m a s w h i c hw e r ed e v e l o pf r o m t h ee c s sc o - c u l t u r e dw i t ha g r o b a c t e r i u me h a l 0 5h a r b o r e dp c a m b i a - c b f l p l a s m i da f t e r6d a y s ，w a sa l s oc o u l db ed e t e c t e d t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a ta sw a s n o tg o o df o rt h ea g r o b a c t e r i u me h a l 0 5m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o nt ot h em u s a a c u m 伽a t ec v m a s k e yw o r d s ：m u s aa a bs i l k “g u o s h a n x i a n g ，m u s aa c u m i n a t ec v m a s ( a a ) ， e c s s ，a r a b i d o p s i s t h a 矗a n ac b f l g e n e ，p c a m b i a c b f l ，a g r o b a c t e r i u m t u m e f a c i e n se h a l 0 5 ，t r a n s f o r m a t i o n ，g u s 主生奎兰堡主堂垡兰茎 垫堕兰! 星 2 4 一d a p 2 e r e b p a s b p c b f c e f c o r c r t d r e c t a b d d m s o g u s i a a i c e i c e r k a n k b m e m l n m l n a a n o s n p t i i o r f p c r r p m 缩略词 2 ，4 - d i c h l o r o p h e n o x y a c e t i ca c i d e t h y l e n e r e s p o n s i v ee l e m e n tb i n d i n g a c e t o s y r i n g o n e b a s ep a i r c - r e p e a tb i n d i n gf a c t o r s c e f r a d in c o l dr e g u l a t e d 2 4 一二氯苯乙酸 p r o t e i n 乙酰丁香酮 碱基对 头孢拉定 c r e p e a t d e h y d r a t i o nr e s p o n s i v ee l e m e n t c e t y l t r i m e t h y l a m m o n i u m - b r o m i d e 六烷基一三甲基一溴化铵 d a v 天 d i m e t h y ls u l f o x i d e 二甲基亚砜 b g l u c u r o n o d a s e b 一葡萄糖苷酸酶 i n d o l e 一3 一a c e t i ca c i d吲哚乙酸 i n d u c e ro fc b fe x p r e s s i o n i n d u c t io do fc b fe x p r e s s io nr e g io n k a n a m y c i n 卡那霉素 k il o b a s e千碱基 l i t e r升 m a l te x t r a c t 麦芽浸出物 m i n u t e 分钟 m i l l i l i t e r毫升 a n a p h t h a l e n ea c e t i ca c i d n 一萘乙酸 n o p a lin es y n t b a s e 胭脂碱合成酶 n e o m y c i np h o s p h o t r a n s f e r a s ei i新霉素磷酸转移酶i i o p e nr e a d i n gf r a m e 开放读码框 p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e每分钟转数 中山大学硕士学位论文2 0 0 6 年5 月 s d s s u g a r c a n eb a c i l l i f o r mb a d n a v i t u s 十二烷基硫酸钠 x - g l u c5 - b r o m o 一4 一e h l o r o 一3 一i n d o l y g l u c r u o n i d e 5 一溴一氯一3 一吲哚葡萄糖醛酸苷 z t 6 一( 4 - h y d r o x y 一3 一m e t h y l 一2 一t r a n s b u t e n y l a m i n o ) p u r i n e 玉米素 中山大学硕士学位论文2 0 0 6 年5 月 第1 章文献综述 1 1 香蕉产业发展状况及面临的问题 香蕉属芭蕉科( m u s a c e a e ) 、芭蕉属( m u s a ) ，为多年生草本植物( s a m o n 著， 林伯达等译，1 9 8 4 ) ，起源于亚洲东南部，现在世界上几乎所有的栽培香蕉( 3 f u s a ) 都是野生香蕉种尖叶蕉( 或称阿加蕉) a a ( g u s ag l c u i l l l r l e q t a , c a l l a ) 和伦阿蕉b b ( m u s ab a l b i s i a n a , c a l l a ) 自然杂交或自然突变，再经人工选择所演变成的无 子栽培香蕉。在栽培蕉中，果实风味以a a ，a a b 组中的一些鲜食栽培品种为最好， 其次是a a a 组的栽培品种，a b b ，b b b 及a a b 组中的多数栽培品种品质风味较差，多 以煮食为主；而在抗逆性方面，般含b 基因的抗逆性较好，如抗寒性、抗旱性 及抗涝性等，b b b ，a b b 比a a b 好，比a a a 更好，最差是a a 型的品种 ( b t t p ：h a i n a n b a n a n a c o i l ，2 0 0 3 ) 。目前，香蕉已成为非洲、大洋州、中美洲 贫穷国家的主要粮食和热带国家的第一大水果，也是这些国家重要的经济来源。 同时，香蕉已成为最大宗的热带水果及主要经济作物，在国际上( f a o ) 也是仅 排在水稻、小麦和玉米之后的第四大粮食作物。中国栽培香蕉的历史非常悠久， 在公元前6 0 0 年就有文献记载。目前我国的香蕉业正蓬勃发展，香蕉种植面积仅 位于苹果、柑橘、梨、葡萄、荔枝和龙眼之后，种植面积排名第七，主要种植区 域在广东、广西、海南、福建、云南、台湾、四川和重庆等地。香蕉已经成为我 国最大宗的水果之一，2 0 0 2 年的总产量达5 5 5 7 9 吨，仅次于苹果、梨和柑橘， 位居第四，其中出口3 96 8 8 1 ：e ，货值1 8 8 1 7 美元( 万连步等主编，2 0 0 4 ) 。根据 有关统计，2 0 0 4 年世界香蕉面积达至1 4 5 5 万公顷，总产量7 1 3 4 万吨，而我国香蕉 的栽培面积达2 8 5 万公顷，总产量达6 2 9 万吨，居世界第三位( f a o ，2 0 0 4 ) 。我国适 合种植香蕉的地区并不多，但潜在的消费市场却是世界最大的，这给我国的香蕉 生产者以及香蕉产业的发展提供了很好的机遇。香蕉栽培的经济效益非常之大。 以珠三角为例，通常种植一亩香蕉，冬季和春季可收获2 0 0 0 2 6 7 0 千克，收购价 一般高于1 4 元千克，夏季和秋季可收获3 3 0 0 4 0 0 0 千克，收购价高于1 _ o 元千 克，而农民在自己的土地上种植香蕉的费用很低，一般3 0 0 5 0 0 元即可，所以利 润十分可观。中山市黄圃镇横档村，全 3 7 3 0 人，2 0 0 0 年种植香蕉7 2 0 0 亩，产值 中山大学硕士学位论文2 0 0 6 年5 月 3 5 9 0 万元，人均种蕉收入5 0 0 0 元( 万连步等主编，2 0 0 4 ) 。近年，香蕉价格稳中 有升，多数香蕉园只要能够种出高质高产的香蕉，就可获得好的收成。所以，香 蕉种得好，就是“招( 蕉) 财树”。 香蕉种植固然有巨大的经济效益和美好的发展前景，但是目前香蕉种植所 面临的各种灾害问题不容乐观，如冷害、风害和病虫害等等。香蕉对低温比较敏 感，气温在1 6 左右时生长基本停止，生长临界温度为i o c 左右，7 8 时叶 片变干，4 5 时植株各部位均出现冷害；气温在2 3 时心叶受寒害，如伴 有冷雨可造成假茎心部腐烂，1 2 时叶片全部枯萎，0 以下则出现冻害：如 平流霜冻时，清晨最低气温在o 至一2 时会使叶片冻死枯萎，严重时地上部 植株冻死。香蕉果实成熟期抗寒能力最低，气温在5 7 1 2 时蕉果受冷变黑，不 能正常成熟，催熟后品质差，商品价格低。总的来说，香蕉怕低温，更忌霜冻 ( h t t p ：p n f j o n ) 。突如其来的冷害给香蕉种植业带来了极大的威胁，造成 的经济损失极为巨大，如1 9 9 1 年下旬广东省共有8 万多h 群香蕉，受严重寒害 的近5 万h m 2 ，有3 0 以上受寒害死亡，其中阳江市0 2 2 万h m 2 香蕉苗、试管蕉 苗和抽蕾蕉树全部死亡；1 9 9 3 年1 月中、下旬的寒潮使广东省1 2 5 万h m 2 香蕉 全部受害，严重受害达8 6 7 万h m 2 ，4 万h m 2 冷死；1 9 9 6 年2 月中、下旬广东省 有1 4 6 7 万h m 2 香蕉几乎因寒潮失收( 互联网资料) 。因此，如何提高香蕉的抗 寒抗冻能力是迫在眉睫的事情。 1 2 香蕉的遗传转化研究 香蕉是世界上产量最大的水果作物，也是我国华南地区( 特别是海南) 主 要的经济作物之一。世界经济的一体化促使香蕉的生产朝着规模化、商品化的方 向发展，国际竞争将日趋激烈，而谁将在竞争中取得领先地位很大程度上取决于 对包括组织培养和基因转化等生物技术的研究和开发的利用。食用蕉品种大都属 于三倍体( 包括a a a 、a a b 和a b b 基因型) ，具有高度的雌雄不育特性，因此，传统 的育种方法难以对香蕉进行遗传改良。现代生物技术的发展将为培育香蕉产业所 需的新品种做出重要贡献。近1 0 年来已在香蕉的生物技术领域取得了可喜的成 果，发表了不少研究论文和评述( r o u te t 盘，2 0 0 0 ；s a g ie ta 1 ，1 9 9 8 ) 。 2 中山大学硕士学位论文2 0 0 6 年5 月 表1 一l香蕉基因转化的研究进展 转化是否抗性转化 方法基因型 受体 有功 选择 植株参考文献 能基 因 电 a b b ( b l u g g o e ) 原生质体( 胚性s a g ie ta 1 ，1 9 9 4 ； 激悬浮细胞) s a g i e ta 1 ，1 9 9 5 a 法 a b b ( b l a g g o e ) 胚性悬浮细胞 s a g i e ta l ，1 9 9 5 a 基 ( s c a l p s ) a a a ( w i l l i a m s 胚性悬浮细胞 + s a g ie ta 1 ，1 9 9 5 a ； g r a n dn a i n ) ( s c a l p s )r e m ye ta 1 ，1 9 9 6 因 a a b ( t h t e eh a n d 胚性悬浮细胞 + p l a n t y )( s c a l p s ) s w e n n e ne ta 1 ，1 9 9 8 ； d u g d a l ep ta 1 ，2 0 0 0 ； 枪 a a a ( g r a n dn a i n ) 胚性悬浮细胞 b b t v+b e c k e re ta 2 0 0 0 ( 未成熟雄花基因 序) 法 a a a ( 巴西品种)薄片王鸿鹤等，2 0 0 0 a b b ( b l u g g o e )胚性悬浮细胞 + + s c h e n kp f 日，1 9 9 9 ； ( s c a l p s ) s c h e n ke ta 2 0 0 1 ； h e r m a n ne ta 1 ，2 0 0 1 a a b ( r a s t h a l i )胚性悬浮细胞+g a n a p a t h ie ta 2 0 0 i ( 茎尖) a b b ( 粉蕉)薄片+ + 黄霞等2 0 0 2 农 a b b ( 大蕉) 杆 a a b ( r a s t h a li )胚性悬浮细胞 m s i+c h a k r a b a r t i 菌 ( 茎尖) - - 9 9e ta ，2 0 0 3 介 基因 导a a a ( c a v e n d i s h ) ： 胚性悬浮细胞 +k h a n n ae ta l ，2 0 0 4 法 a a b ( l a d y f i n g e r ) a a b ( a g b a g b a ) 茎尖+ t r i p a t h ie ta 1 ，2 0 0 5 基因a a a ( g r a n dn a i n )茎尖+ m a ye ta ，1 9 9 5 枪+a 从( w i l l l a r e s 茎尖+ + 李华平等，2 0 0 0 农杆g r a n dn a i n ) 菌介 a a a ( 泰蕉)薄片 h l +p e ie ta 1 ，2 0 0 5 导法 基因 随着香蕉各种再生体系的建立，尤其是胚性悬浮系的建立和原生质体培养 的成功，通过遗传转化的方法对香蕉进行育种改良成为可能，并取得了较大的进 展( 表1 1 ) 。 从表中可以看出，目前适合于香蕉遗传转化的方法主要有三种： 中山大学硕士学位论文2 0 0 6 年5 月 l2 1 电激法转化原生质体 1 9 9 4 年，s a g i 等以a b b 型栽培蕉的茎尖分生组织为外植体，建立胚性悬浮细 胞系并制备原生质体，通过电激法将带有罐因的质粒载体导入原生质体，检 测到渊瞬时表达。 1 2 2 基因枪法转化胚性悬浮细胞 这一方法是目前香蕉转化用得最多的方法，并在a 从、a a b 和a b b 基因型香 蕉上转化成功，其中被转化的基因包括抗真菌蛋白基因( r e m yp ta 7 ，1 9 9 8 ) ， 广谱抗菌活性的a c e 2 a j t t p l 基因( s w e n n e np fa ，1 9 9 8 ) ，香蕉束顶病毒( b b t v ) d n a 几个组分的启动子、甘蔗杆状病毒( s c b v ) 来源的启动子、a c t i n l 启动子调 控下的各种报告基因( d u g d a l ee ta ，2 0 0 0 ；s c h e n ko ta ，1 9 9 9 ；m a yp fa ， 2 0 0 1 ：h e r m a n no t 酋，2 0 0 0 ) 。 1 2 3 根癌农杆菌介导转化 根癌农杆菌介导的遗传转化系统是在所有的转基因方法中研究最多、理论 机理最清楚、技术方法最成熟的一种基因转化途径。第一批能表达外源基因的转 基因植物就是通过农杆菌介导转化获得的( 王关林和方宏筠，1 9 9 8 ) 。由于单子 叶植物不是根癌农杆菌的天然宿主，过去人们一直认为根癌农杆菌介导的基因转 化仅限于多数双子叶植物。但随着对农杆菌侵染机理的深入研究及揭示，通过改 进载体系统和转化方法，近年来在水稻、玉米、小麦和石刁柏等单子叶植物的遗 传转化上获得了成功( 陶余敏和唐锡华，1 9 9 2 ；m a h a l a k s h m ia n dk h u r a n a ，1 9 9 5 ： i s h i c l ao ta 1 ，1 9 9 6 ；c h e n ge ta ，1 9 9 7 ) 。香蕉属于单子叶植物，采用根 癌农杆菌介导遗传转化不易获得成功。直到1 9 9 5 年，m a y 等人才建立了一套以农 杆菌介导并结合基因枪技术的转基因方法：即先用不包裹d n a 的微粒轰击外植体 致伤，再用农杆菌感染，从而获得转基因植株( m a ye t 日，1 9 9 5 ) 。b e r n a r d o 4 中山大学硕士学位论文2 0 0 6 年5 月 等在理论上进一步证实了农杆菌对香蕉细胞是亲和的，采用农杆菌介导实现稳定 的基因转化是完全可能的。g a n a p a t h i 等通过农杆菌介导转化悬浮细胞，经体胚 发生途径获得r a s t h a l i ( a b b ) 的转基因植株，并在果实中检测到g 晒基因的稳定 表达( g a n a p a t h ie ta 1 ，2 0 0 1 ) 。但农杆菌介导的胚性悬浮细胞的转化率一直有 待提高。2 0 0 4 年，k h a n n ae ta j 发现在共培养过程中离心有利于农杆菌介导的 c a v e n d i s h ( a a a ) 和金手指蕉( a a b ) 胚性悬浮细胞的转化，并获得了转基因植 株，其中躔因和罐因在植株中得以稳定表达。p e ie ta 1 ( 2 0 0 5 ) 综合运用 基因枪和农杆菌介导两种方法成功的将人的h l ( h u m a nl y s o z y m e ) 基因导入泰蕉 薄片组织中，通过组织培养和筛选，获得了抗香蕉巴拿马病的转基因植株并转入 大田试验。遗憾的是，目前在香蕉的抗寒性研究中的进展相对比较缓慢。 1 2 3 1 根癌农杆菌的生物学特性 根癌农杆菌属( a g r o b a c t o r i u m ) 都是土壤习居菌，主要生活在被多种植物 生活过的土壤中，好氧，最适温度2 5 一3 0 ，p h 生长范围4 3 1 2 0 ，最适p h 值6 0 9 0 。农杆菌侵染时，细菌通过原有的病斑或伤口把t i 质粒的d n a 片段导 入植物细胞的基因组中，但其本身不进入。农杆菌细胞呈杆状，为革兰氏阴性细 菌。根癌农杆菌根据其诱导植物细胞产生的冠瘿碱种类的不同可分为章鱼碱型、 胭脂碱型和农杆菌型三种。 根癌农杆菌通过基因转化把t d n a 上的基因导入植物细胞并整合到核d n a 上。首先，受损伤的植物细胞产生酚类物质作为农杆菌的侵染信号，诱导物透过 农杆菌的细胞膜活化附叫和附埘基因，再诱导v i r 区的其他基因。活化的盱堪因 作用于t d n a 的加工及其转移并整合到宿主植物细胞的核d n a 上。t d n a 在植物 细胞中表达产生冠瘿碱和植物激素，冠瘿碱促进农杆菌的附着并激活麟因， 从而有利于t i 质粒的接合转移，扩大侵染范围。农杆菌t i 质粒上有专一性的冠瘿 碱分解酶基因( o c s ) 。该基因启动合成各种酶，分解植物细胞产生冠瘿碱作为 唯一的炭源和氮源。 中山大学硕士学位论文2 0 0 6 年5 月 1 。2 3 2 根癌农杆菌介导基因转化的机理 根癌农杆菌转化植物细胞是将其体内的t d n a 转移到被侵染的植物细胞中 而实现的。这过程是一系列复杂的反应过程，包括农杆菌对植物细胞的附着、 植物细胞释放信号分子的诱导、矿打基因的表达、t d n a 的转移及其在植物核基 因上的整合表达等。参与该过程的主要是t i 质粒上的t d n a 和谜因以及染色 体上的曲堪因。 t d n a 上基因与t d n a 的转移和整合过程无关，其两端2 5 b p 的正向重复序 列是唯一的转移信号识别序列。不同类型农杆菌中t i 质粒有一定的差异，胭脂碱 型农杆菌的t i 质粒上为单一的t - - d n a ，章鱼碱型农杆菌t d n a 的被分成两部分， 有左右两个边界序列，其中右边界与致瘤有关，在其1 7 b p 处有一个2 4 b p 的超驱动 序列，为有效转移左右边界及t d n a 所必需，起增强子的作用。 农杆菌菌株会对植物细胞释放的酚类物质产生趋化反应，这是农杆菌和植 物细胞相互作用的基础，这种趋化反应依赖于旺州和聒，g 基因。后来进一步证明， 一些植物中常见的酚类化合物的混合物，如儿茶酸、没食子酸、乙酰丁香酮、羧 基乙酰丁香酮等都可以激活v i r 区基因的表达，其中乙酰丁香酮( a s ) 诱导效果最 佳。农杆菌t i 质粒中v i r 区位于t d n a 的左侧，编码与t d n a 加工、转移及整合 等功能相关的蛋白，对t d n a 转移起介导作用，蹦堪因的活化是农杆菌转化的 开关。章鱼碱型t i 质粒的v i r 区含有y i r a 、b 、c 、d 、e 、f 、g 、 i8 个操纵子共2 4 个基因。胭脂碱型t i 质粒的v i r 区不含v i r f $ 口v i r h 操纵子，而含乃堪因( 王关林 和方宏筠，1 9 9 8 ) 。v i r a 蛋白是感应蛋白，可直接感应酚类诱导化合物。活化的 v i r a 蛋白激活v i r g 基因产生d n a 结合蛋白，进而作为转录激活因子诱导其他盱， 基因的表达。v i r a 和v i r g 组成了一种双因子调控系统。 农杆菌的染色体基因劬谢其附着侵染有一定的作用。这类染色体毒性基因 主要有1 0 个，分别为幼谢、国舾、c h v c , 加、c h v f , 劬佑、功玎、胎洲、a c v 、 a t t 和c e l ( 李子银和胡会庆，1 9 9 8 ) ，它们大多编码一些膜相关蛋白。 中山大学硕士学位论文2 0 0 6 年5 月 素 i 2 3 3 根癌农杆菌介导遗传转化的特点及影响其转化单子叶植物的因 根癌农杆菌介导的遗传转化是一种天然的纯生物学转化系统，与其他遗传 转化方法相比具有五大特点：( 1 ) 转化率高；( 2 ) 导入的目的片段明确，并能导 入大片段d n a ；( 3 ) 导入的基因拷贝数低，表达效果好；( 4 ) 使用的技术、仪 器简单，成本低；( 5 ) 在目前所有的转化体系中，其转化机理研究得最清楚， 方法最成熟，应用范围也最广。 根癌农杆菌介导植物遗传转化的成功与否取决于两个方面：一是农杆菌能 否将t d n a 导入植物细胞：二是植物感受态细胞是否存在。由于单子叶植物不是 根癌农杆菌的天然宿主，故其中大多数植物不易被农杆菌感染，主要原因是盱， 基因不能被充分活化表达以及植物感受态细胞不能富集。因此，提高p 血基因的 活化程度、选择合适的外植体、构建用于直接转化的高频转化物理载体等是解决 单子叶植物遗传转化的必然途径。 i 3 关于抗寒转录因子c b f 基因 植物因受到温度等因素的影响而呈现出的一定的地带性，一些热带亚热带 植物不能在北方的室外繁育。温度也影响着农作物的产量和质量，每年因冷害、 冻害造成全球的农作物生产上的经济损失不可估量，其中香蕉的生产就是一个很 好的例证。植物的最大耐冻性不是恒定的，许多温带植物经过非冻性低温预处理 后都能获得一定程度的抗冻能力，这一现象被称为冷驯化( g u y ，1 9 9 0 ；h u g h e sa n d d u n n ，1 9 9 6 ；t h o m a s h o w ，1 9 9 9 ；b r o w s ea n dk i n ，2 0 0 1 ) 。热带亚热带植物对寒性 低温( 0 一l o ) 是敏感的，它们也不具有冷驯化能力( v i s w a n a t h a ne t 日- ，2 0 0 3 ) ， 这也是番茄、香蕉等作物耐寒耐冻性较差的一个重要原因。许多研究表明，冷调 基因的表达在植物的抗寒和冷驯化过程中都起着关键作用( g o n ge ta ，2 0 0 2 ； h s i e he ta 1 ，2 0 0 2 ；k n i g h te ta ，1 9 9 9 ；t h o m a s h o w ，1 9 9 9 ：t a h t i h a r j ua n d p a l v a ，2 0 0 1 ) 。一些研究者通过对拟南芥基因组进行基因锌片微阵列分析，鉴 别出了3 0 6 个冷应答基因，2 1 8 个是受低温上调的，其中5 1 ( 1 5 6 个) 为瞬时 中山大学硕士学位论文2 0 0 6 年5 月 表达；其余8 8 个基因受低温下调，其中5 2 ( 4 6 个) 为瞬时表达( f o w l e ra n d t h o m a s h o w ，2 0 0 2 ) 。这些冷应答基因编码一系列的蛋白质，如：在呼吸作用及糖 类、脂类和抗氧化剂等物质代谢中的酶，分子伴侣，抗冻蛋白以及在由冻害引起 的脱水过程中起相关抵御作用的蛋白质( g u y ，1 9 9 0 ；t h o m a s h o w ，1 9 9 9 ；m o h a p a t r e ta 1 ，1 9 8 9 ) 。在植物的冷驯化和抗寒抗冻过程中，c b f ( c - r e p e a tb i n d i n g f a c t o r ) 冷诱导信号途径起着非常重要的作用。c b f s 是一类具有三个成员的小 转录因子家族，受低温诱导而迅速表达，然后其表达产物激活上述冷应答基因中 一类在启动子中具有c r t d r e ( c r e p e a t d e h y d r a t i o nr e s p o n s i v ee l e m e n t ) 顺式元件的特定基因，如：c o r l 5 a 、c o r 6 舀等，这些基因高效表达，从而提高 植物的抗寒冻能力。 1 3 1c b f 基因及其特点 遗传分析显示，植物的 冷驯化是由多基因控制的 ( t h o m a s h o w ，1 9 9 0 ) 。植物在 对低温的反应过程中有大量 的基因转录物累积，其中许 多都已被分离和鉴定出来， 但很多基因的功能仍有待 研究。在过去的一些年里， 研究基因冷诱导表达的一 c b f lc b f 2c b f 3 lr hnb0ghbhh 86k b p 0k b p + 一1 1 0 。一 o2 468 8 7 ( k b p ) 图1 一l 髓蹴因限制性图谱 ( 引自z a b t ae ta i 。1 9 9 8 ) 个主要目的就是寻找特定的顺式作用元件。y a m a g u c h i s h i n o z a k i 和s h i n o z a k i 率先从拟南芥的r d 2 9 a 基因的启动子中分离出两个9 b p 的d n a 元件，该元件都含 有d r e 核心序列c c g a c ，故被t h o m a s h o w 等称为c - r e p e a t 序列，即c r t 。在后来 的研究中进一步证明，这一序列也是其他冷诱导植物基因所必需的低温应答元 件，包括欧洲油菜( b r a s s i c an a p u s ) b n l l 5 基因( j i a n ge ta j ，1 9 9 6 ) 、小麦 w s c l 2 0 基因( o u e l l e te ta 7 ，1 9 9 8 ) 等。为进步弄清楚冷驯化和低温对植物 基因表达调节的分子机制，s t o c k i n g e r ( 1 9 9 7 ) 等从拟南芥中分离出一个编码 中山大学硕士学位论文2 0 0 6 年5 月 c r t d r e 结合蛋白的c d n a ，即c b f l ( r e p e a t d r e - b i n d i n g 旦a c t o r1 ) 。两年 后，m e d i n ae t a l ( 1 9 9 9 ) 从拟南芥中筛选出来两个与国刀高度同源的基因，即 露和c b f 3 。同时，他们通过低严格条件下的d n a 印迹杂交实验证实拟南芥基 因组中不存在其他c b f 基因。 组成c b f 基因家族的三个基因聚集于拟南芥第四条染色体的短臂7 2 8 c m 处，并成串排列。c b f 2 和c b f 3 分别位于c b f l 下游3 k b 和7 k b 处，其中c b f l 基 因的开放读码框中无内含子( m e d i n ae ta ，1 9 9 9 ) ( 图1 1 ) 。c b f s 家族基因 具有高度的同源性，在开放读码框序列中，c b f 2 、c b f 3 与c b f l 基因的相似性分 别为8 1 0 5 和8 4 0 5 ，而c b f 2 与c b f 3 则有8 4 的核苷酸序列是一致的( m e d i n ae t a 1 ，1 9 9 9 ) 。在c b f s 的启动子中存在有与c r t d r e 核心序列( c c g a c ) 相反的五 碱基序列c a g c c 。c b f s 家族基因是紧密连锁的，具有相同的表达模式，但它 们在结构上还是有一定的区别。c b f l 是一个单拷贝或低拷贝基因，在其5 区有 一个类似于c r t d r e 核心序列( c c g a c ) 的五碱基序列c c g t c ，当植物受低温 胁迫时，其表达水平的改变是不明显的。通过基因融合实验和突变分析表明，在 c b f 2 启动子中有一个1 2 5 b p 的区域内含有顺式激活调节元件，i c e r l 和i c e r 2 ( i n d u c t i o no fc b fe x p r e s s i o nr e g i o n1a n d2 ) ，单独的i c e r 对低温的应答是 很弱的，只有它们共同作用时才能很好的调节冷应答基因的表达，同时它们也能 受机械振荡和蛋白合成抑制剂一一环己酰亚胺的刺激而表达( z a r k ae t a ，2 0 0 3 ) 。在i c e r 2 序列中无已知的转录因子结合位点，但i c e r l 中有c a c a t g 序列，这与b h l h 蛋白的识另序列c a n n t g 是一致的( m a s s a r ia n dm u r r e ；2 0 0 0 ) 。 i c e r l 是i c e i 蛋白的潜在结合位点，但是由于在低温中i c e l 基因突变对c b f 2 转录物几乎无影