![(微生物学专业论文)干扰素调节因子3的调控研究.pdf_第1页](http://file.renrendoc.com/FileRoot1/2019-12/5/7e438f08-7ca0-4769-a2ef-bea475ca0fc3/7e438f08-7ca0-4769-a2ef-bea475ca0fc31.gif)
![(微生物学专业论文)干扰素调节因子3的调控研究.pdf_第2页](http://file.renrendoc.com/FileRoot1/2019-12/5/7e438f08-7ca0-4769-a2ef-bea475ca0fc3/7e438f08-7ca0-4769-a2ef-bea475ca0fc32.gif)
![(微生物学专业论文)干扰素调节因子3的调控研究.pdf_第3页](http://file.renrendoc.com/FileRoot1/2019-12/5/7e438f08-7ca0-4769-a2ef-bea475ca0fc3/7e438f08-7ca0-4769-a2ef-bea475ca0fc33.gif)
![(微生物学专业论文)干扰素调节因子3的调控研究.pdf_第4页](http://file.renrendoc.com/FileRoot1/2019-12/5/7e438f08-7ca0-4769-a2ef-bea475ca0fc3/7e438f08-7ca0-4769-a2ef-bea475ca0fc34.gif)
![(微生物学专业论文)干扰素调节因子3的调控研究.pdf_第5页](http://file.renrendoc.com/FileRoot1/2019-12/5/7e438f08-7ca0-4769-a2ef-bea475ca0fc3/7e438f08-7ca0-4769-a2ef-bea475ca0fc35.gif)
已阅读5页,还剩50页未读, 继续免费阅读
版权说明:本文档由用户提供并上传,收益归属内容提供方,若内容存在侵权,请进行举报或认领
文档简介
,:0 o fi nt e r f e r o n 3 at h e s i ss u b m i t t e df o rt h ed e g r e eo fm a s t e r c a n d i d a t e :l u oz h e n s u p e r v i s o r :a s s o c i a t ep r o f l ic h u n h u a h u b e iu n i v e r s i t y w u h a n ,c h i n a 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定, 即: 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本;学校有权保存 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,并提供目录检 索与阅览服务;学校可以允许采用影印、缩印、数字化或其它复制手 段保存学位论文;在不以赢利为目的的前提下,学校可以公开学位论 文的部分或全部内容。( 保密论文在解密后遵守此规定) 作者签名:写寺肜 指导教师签名;爹厉娣 日期: 。b 、叨 日期:沙l p 侈、易7 摘要 干扰素调节因子3 在调节病毒入侵的先天免疫应答中发挥重要的作用。i r f 3 激活的细微调节对于i r f 3 功能的发挥至关重要,我们通过酵母双杂交的方法找 到了一个可以与i r f 3 相互作用的蛋白s g t a ,免疫荧光分析表明i r f 3 与s g t a 共定位于细胞质中,使用g s t - p u l l d o w n 、免疫共沉淀进一步的证实了它们之间 的相互作用。为了进一步的探索它们之间的相互作用的生理意义,我们构建了一 个能够抑制细胞内s g t a 蛋白表达的s i r n a 表达载体,通过r n a i 的方式降低 s g t a 含量,导致仙台病毒介导的i f nb 启动子的转录活性下降。因此,我们推 测s g t a 与瓜f 3 相互作用可能促进了i r f 3 的激活。 关键词:i r f 3 ;s g t a ;g s tp u l l d o w n ;荧光共定位;免疫共沉淀;r n a i ; i f n l 3 启动子 a b s t r a c t i n t e r f e r o nr e g u l a t o r yf a c t o r3 ( i r f 3 ) p l a y sac r u c i a lr o l ei nm e d i a t i n gc e l l u l a r r e s p o n s e st ov i r a li n f e c t i o n t h ef i n e t u n i n go ft h ea c t i v i t yo fi r f 3i sn e c e s s a r yf o ri t s f u n c t i o n i nay e a s tt w o h y b r i ds c r e e n i n gf o rp o t e n t i a li r f 3 i n t e r a c t i n gp r o t e i n s ,w e i d e n t i f i e dt h es m a l lg l u t a m i n e r i c h t e t r a t r i c o p e p t i d e ( t p r ) 一c o n t a i n i n g ,a l p h a ( s g t a ) a sa l li r f 3 - i n t e r a c t i n gp r o t e i n i m m u n o f l u o r e s c e n ta n a l y s i ss h o w e dt h a t i r f 3w a sc o l o c a l i z e dw i t hs g t aw i t h i nt h ec y t o p l a s m t h ei n t e r a c t i o nw a sf u r t h e r v e r i f i e db yg s tp u l l - d o w na n dc o - i m m u n o p r e c i p i t a t i o ne x p e r i m e n t s t of u r t h e r e x p l o r et h ep h y s i o l o g i c a ls i g n i f i c a n c eo f t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e ni r f 3a n ds g 玩w e c o n s t r u c t e das m a l li n t e r f e r i n gr n a ( s i r n a ) e x p r e s s i o nv e c t o rt a r g e t e ds g t a k n o c k d o w no fe x p r e s s i o no fs g t ab yr n ai n t e r f e r e n c ea t t e n u a t e dt h ea c t i v a t i o no f t h ei f n b p r o m o t e rt r i g g e r e db ys e v t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a ts g t am a yb e i n v o l v e di nt h ev i r u s i n d u c e da c t i v a t i o no fi r f 3 k e yw o r d s :i r f 3 ; s g t a ;g s tp u l l d o w n ;f l u o r e s c e n c et e s t ;c o - i p ;r n a i ; i f n bp r o m o t e r i l k d d h m i n s e c d m s 0 d n t p e d l a i p t g s d s k i l o d a l t o n d a y h o u r m i n u t e s e c o n d d i m e t h y ls u l f o x i d e 氨苄青霉素 卡那霉素 克 微克 毫升 微升 碱基对 千碱基 千道尔顿 天 小时 分钟 秒 二甲基亚砜 d e o x y 血e d i a m i n et r i p h o s h a t e脱氧核糖核苷三磷酸 e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d乙二胺四乙酸 i s o p r o p y l t h i o 1 3dg a l a c t o s i d e 异丙基一b d 一半乳苷 s o d i u md o d e c y l s u l p h a t e十二烷基硫酸钠 x - g a l5 一b r o m o 一4 一c h l o r o 一3 一i n d o l y 1 3dg a l a c t o s i d e5 溴一4 一氯3 - 口引哚1 3d 半 乳糖苷 l bl u r i a _ b e r t a n im e d i u m i i i l b 培养基 1 2 干扰素调节因子3 1 1 2 1i r f 3 的分子结构及生理功能2 1 2 2i r f 3 的磷酸化与激活2 1 2 3m f 3 的调控研究3 1 2 3 1i r f 3 的正向调控研究3 1 2 3 2 瓜f 3 的负调控研究5 1 3t p r 蛋白6 1 3 1t p r 模体7 1 3 2s g l a 7 1 3 3s g t a 的结构和功能”8 1 4r n a 干扰9 1 3 1 r n a 干扰的作用机制1 0 1 5 研究目的1 0 2 材料与方法”1 2 2 1 材料“1 2 2 1 1 菌株,细胞系和质粒1 2 2 1 1 1 菌株1 2 2 1 1 2 细胞系1 2 2 1 1 3 质粒1 2 i v 2 11 4 引物:一1 3 2 1 2 培养基1 4 2 1 3 试剂和酶1 4 2 1 4 主要缓冲液:1 4 2 2 方法“1 6 2 2 1p c r 一1 6 2 2 2 质粒d n a 的抽提”1 7 2 2 3 大肠杆菌感受态细胞的制备1 7 2 2 4 大肠杆菌的常规转化1 8 2 2 5 大肠杆菌的快速转化1 8 2 2 6s d s p a g e 1 8 2 2 7 免疫印记1 9 2 2 8h e k 2 9 3 细胞的复苏”2 0 2 2 9h e k 2 9 3 细胞的冻存”2 0 2 2 1 0 哺乳动物细胞系h e k 2 9 3 的组织培养”2 0 2 2 1 1 哺乳动物细胞的转染2 0 2 2 1 2 目的基因在大肠杆菌中的表达”2 1 2 2 1 3g s t 融合蛋白的纯化2 1 2 2 1 4g s t - p u l ld o w n 2 2 2 2 1 5 间接免疫荧光2 2 2 2 1 6 免疫共沉淀”2 3 2 2 1 7 双荧光素酶报告基因检测2 4 v - 2 5 - 2 5 2 6 2 7 2 8 2 8 下降2 9 3 2 3 2 4 2i l r f 3 与s g t a 的相互作用的生理意义3 2 4 3 展望”3 3 参考文献3 4 致i 勇十”4 0 v i 1 前言 1 1 干扰素调节因子 1 前言 干扰素调节因子家族( i n t e r f e r o nr e g u l a t o r yf a c t o rf a m i l y ,i r f s ) 是一类在分子结 构特征上保守的转录因子家族,一共有9 个分别为i r f i 9 ,为螺旋一转角一螺旋蛋白,其 分子结构主要分为两个部分即d n a 结合结构域和转录激活结构域,其所有的成员的前 1 1 5 个氨基酸同源性较高,5 个保守的酪氨酸( t y r ) 重复模体被1 0 - - - - 1 8 个氨基酸残基分开。 一些成员还含有脯氨酸( p r o ) 富集结构域、i r f s 相关结构域( 1 a d ) 和丝氨酸或苏氨酸磷酸 化调控位点。m f s 广泛表达在各类细胞中,许多成员被病毒、脂多糖( l p s ) 和肿瘤坏死 因子( t u m o rn e c r o s i sf a c t o r ,t n f ) 等信号刺激之后,i r f s 可以结合在相似的d n a 序列 上,如干扰素刺激反应元件( i n f s t i m u l a t e dr e s p o n s ee l e m e n t ,i s r e ) l ,干扰素调节因子 家族调控着整个i 型干扰素系统,包括干扰素的产生,到不同的干扰素应答,因此,它 们为机体提供了一个主要的抵抗病原体入侵的方式。由于家族成员众多,每一种成员有 各自的特点,因此,各种成员在调控免疫的过程中都发挥着自己独特的生理功能。i r f s 除了能够诱导先天免疫和适应性免疫的产生外,它们在某些细胞的生长和分化方面也发 挥着调节作用i 引。 在9 个i r f s 中,瓜f 3 和i r f 7 在t o l l 1 i k e 受体信号通路中最早被激活的,在早期i 型i f n 的产生中起到关键性作用。i r f 3 和i r f 7r 一范够被i k b 家族激酶磷酸化激活,激活后形成二 聚体,然后定位到细胞核中调节i 型i f n 的转录。i r f l 与i r f 2 在分子结构上类似,它们 的d n a 结合结构域上高度同源,但蛋白质c 端的转录激活域部分不同,它们竞争性的结 合干扰素或干扰素刺激基因上游的调控序列【引,i r f i 能够刺激i f n 和i s g 的转录,而i r f 2 结合相应的靶序列后,抑制i f n 和i s g 基因的转录。i r f 4 是淋巴细胞特异性的转录因子, 与i r f s 中的其他成员或转录因子p u 1 结合形成转录复合物【4 1 ,调节i f n 及淋巴因子的表 达,并参与b 细胞的成熟、t 细胞转化及抗病毒的免疫应答。i r f 8 主要表达于造血系统 细胞中,它能够促进髓系分化,调节白血病细胞的免疫反应【引,因此被认为是潜在的抑 癌基因。i r f 9 主要是通过和其他因子协同作用,参与i f n 的抗癌效应1 6 j 。 湖北人! 学硕十! 学位论文 1 2 干扰素调节因子3 干扰素调节因子3 ( i n t e r f e r o nr e g u l a t o r yf a c t o r3 ,i r f 3 ) 属于 家族中的一种,在病毒感染早期,细胞对抗病毒的感染主要依赖于i 型 i r f 3 对i 型i f n 的产生起关键性作用。 1 2 1i r f 3 的分子结构及生理功能 i r f 3 是由4 2 7 个氨基酸组成的转录因子,分子量大约为5 5 k d ,属于螺旋转角 螺旋蛋白,组成型的表达于多种细胞的胞质中。i r f 3 分子的结构( 如图1 - 1 ) :从 n 端到c 端依次为d n a 结合结构域( d b d ,第1 1 3 4 位) 、转录激活结构域( t a d , 第1 3 4 3 9 4 位) ,t a d 包含核定位序列( n l s ) 、核输出序列( n e s ) 、脯氨酸富含 区( p r o ) 、i r f 相关结构域( 1 a d ) 和和反应结构域( r d ,第3 8 2 4 2 7 位) 。t a d 的两侧由两个相互作用的自身抑制结构域( a i d ) 组成,r d 的第3 8 5 4 0 5 位氨基 酸内有两套丝氨酸苏氨酸( s e 仉1 l r ) 磷酸化位点。其中第3 8 6 位s e r 是i r f 3 激酶 的靶位点,它的磷酸化对于i r f 3 的活化起决定作用n n 图1 - 1i r f 3 分子结构不葸图 研究表明,当机体受到病毒感染等因素刺激时,可导致i r f 3 分子c 端的丝氨酸残 基磷酸化,从而解除了t a d 两端的a i d 的相互作用,暴露出i a d 和d b d ,促使i r f 3 形成同源二聚体,接着i r f 3 二聚体与c b p ( c r e bb i n d i n gp r o t e i n ) p 3 0 0 1 8 1 形成三聚体, 当i r f 3 二聚体与c b p p 3 0 0 形成三聚体后可使i r f 3 以三聚体的形式由细胞质进入细 胞核内,并结合在i f n 启动子调控区的i r f 3 的d n a 结合位点上,启动i 型i f n 的转 录。i r f 3 不能单独诱导i f n a 和b 的表达【8 1 ,它必须与n f 1 ( b 和a t f 2 c j u n 形成转 录增强复合体才能共同诱导i f n 的表达【9 1 ,从而激活细胞内的先天免疫应答。 1 2 2i r f 3 的磷酸化与激活 1 前言 i r f 3 参与众多的生理生化反应发挥其生理功能主要依赖于i r f 3 的磷酸化激活, 多种因素可以导致i r f 3 的磷酸化激活,如d s r n a 、病毒感染等。在i r f 3 的分子绐构 内有许多与i r f 3 激活相关的磷酸化位点,图卜1 中以明确标出。最早被确认与磷酸化 相关的是3 8 5 、3 8 6 位的两个丝氨酸残基| l 川,研究人员用丙氨酸替代这两个丝氨酸后, 当用病毒感染细胞后,发现i r f 3 不能被激活,进一步的研究表明,这两个丝氨酸的磷 酸化可能跟i r f 3 与c b p p 3 0 0 的相互结合有关【1 1 l 。到目前为止,i r f 3 分子内的磷酸化 位点以基本明确,不同的磷酸化位点的发挥着不同的功能,如i r f 3 分子内的3 9 6 、3 9 8 、 4 0 2 、4 0 5 位的丝氨酸残基与4 0 4 位的苏氨酸残基它们都是病毒诱导的磷酸化位点1 1 2 j , 当这些氨基酸被突变后,病毒感染细胞不能激活i r f 3 。而i r f 3 分子中的1 3 5 位丝氨酸 残基是d n a 蛋白激酶( ( d n a d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s e ,d n a - p k ) 磷酸化的作用位点【1 3 l , 当细胞内的d n a 受到损伤时,d n a 蛋白激酶使该位点的丝氨酸磷酸化,激活的i r f 3 在细胞核内的停留时间延长,也抑制了i r f 3 的降解。研究还发现,在正常的细胞内就 有磷酸化的i r f 3 ,只是这种磷酸化的瓜f 3 分子的磷酸化可能仅仅发生在其n 端,进一毒 步的研究表明,生长因子、t n f a 等都能够通过m a p k k k 相关途径促使取f 3 的n 端 磷酸化。有人推测n 端的磷酸化可能影响某些蛋白质对m f 3 的调控。目前的研究表明 多种蛋白质参与了1 r f 3 的磷酸化调控,大量的实验证明,i r f 3 的活化必须依赖相关的 激酶,如i k k e 、t b k l 掣1 4 , 1 5 , 1 6 】,而多数参与调解i r f 3 调控的蛋白主要是通过调解这 些激酶的活性来增强或是减弱i r f 3 的活性。 。 1 2 3i r f 3 的调控研究 1 2 3 1 瓜f 3 的正调控研究 研究表明,在由病毒或双链r n a 引起的i r f 3 的激活和干扰素的产生先天免疫应答中 t b k l 发挥了重要的作用。相关文献报道,h s p 9 0 能够调节因病毒感染而导致的i r f 3 的 激活,通过h s p 9 0 特异性的抑制剂g a ( g e l d a n a m y c i n ) 抑隹j i j h s p 9 0 的活性或是通过r n a i 的方法下调细胞h s p 9 0 的水平,从而导致因病毒感染引起的i r f 3 的激活受到抑制【1 7 1 , 般认为h s p 9 0 作为分子伴侣的功能主要是维持蛋白质分子结构的稳定,但是通过g a 抑锋j l j h s p 9 0 的功能,并未发现内源性的i r f 3 发生降解,说明h s p 9 0 调节的i r f 3 的活性并 不是通过直接稳定i r f 3 的分子结构来发挥作用的。已有文献证实t b k l 作为一种激酶 ( t a n kb i n d i n gk i n a s e l ) 能够使i r f 3 发生磷酸化1 1 4 1 5 1 ,通过g a 抑斜i i j h s p 9 0 的活性发现细 胞内t b k l 易发生降解,说明t b k l 分子稳定性需要h s p 9 0 的作用,随后的免疫共沉淀实 3 湖北人学硕十学位论文 验证实,h s p 9 0 、i r f 3 和t b k l 在病毒的刺激下能够形成三元复合物【1 8 j ,最终实验结果 表明h s p 9 0 促进i r f 3 激活主要是通过与t b k l 相互作用,使t b k i 的分子结构处于稳定状 态来调节i r f 3 磷酸化激活,它们三者之间是通过形成三元复合物来调控i r f 3 的。 研究发现,当病毒感染细胞后,t r i m 2 1 ( t r i p a r t i t em o t i f - c o n t a i n i n g2 1 ) 可以1 r f 3 干h 互 作用【1 9 】,在机体的抗病毒反应中,t r i m 2 1 是维持i r f 3 激活所必须的。在细胞内过表达 或是敲除t r i m 2 1 会分别导致i r f 3 调节的基因的表达的增强或减弱,其可能的分子机制 是t r i m 2 1 - t - 扰t p i n l ( p e p t i d y l p r o l y lc i s t r a n si s o m e r a s e ,n i m a - i n t e r a c t i n g1 ) 与i r f 3 的相 互作用【2 0 】,从而阻止了i r f 3 的泛素化降解。t r i m 2 1 的b 3 0 2 结构域的一个保守模块是对 于瓜f 3 的调节时起关键性作用,t r i m 2 1 存在或是缺乏时导致机体的抗病毒效应的明显 增强或是减弱。 r h og t p a s er a c l 和p 2 1 激活激酶( p a k l ) 是病毒引起的i r f 3 激活路径中i k k e 和t b k l 的上游蛋白【2 l 】。当病毒感染细胞后,r a c l 被激活,并且调控i r f 3 的磷酸化及 活性,抑制r a c l 会导致i f n b 启动子的活性减弱,并增强病毒的复制。p a k l 作为r a c l 的下游效应物1 2 2 】,能够调节i k k e 和t b k l 的活性,从而建立一个最早的病毒引起的 i r f 3 激活信号路径。相关实验结果表明,r a c l 不是激酶,因此,它可能不能够导致i r f 3 的磷酸化,而激酶p a k l 作为r a c l 的下游效应物已经被证实它能够参与信号转导从而 改变基因的表达【矧,但是i r f 3 报告基因启动子活性检测表明,尽管过表达p a k l 不能 影响i r f 3 启动子的活性,但是p a k l 活性受到抑制,会导致i r f 3 的启动子活性下降。 说明p a k l 的活性不是病毒介导的i r f 3 激活所必须的。因此,p a k l 可能参与了维持 1 前言 到i r f 3 的降解受到抑制,同时细胞骸内的i r f 3 的停留t 卜t f n j 延长,所有结果表明,在具 有d n a p k 活性的细胞中,i r f 3 的降解进程被延缓,进一步的研究显示,i r f 3 的1 3 5 为t h r 磷酸化能够减弱i r f 3 的核输出,通过显微注射在体外d n a p k 磷酸化的i r f 3 和没有处理的i r f 3 ,通过荧光可以观察到,被d n a p k 磷酸化的i r f 3 的核输出被明显 的抑制,这些数据表明d n a p k 通过磷酸化i r f 3 的1 3 5 位t h r 来阻止i r f 3 的核输出, 从而抑制其降解,由此延长了i r f 3 的生命周期。 1 2 3 2i r f 3 的负调控研究 在i r f 3 的调控的研究过程中发现,i r f 3 具有多种剪切变体,已有文献报道,i r f 3 的一种剪切变体i r f 3 a 能够抑制i r f 3 的活性【2 5 1 ,i r f 3 a 缺乏部分d n a 结合区,不能够 结合在i r f s 结合元件及i f n 刺激应对元件上,i r f 3 a 通过与i r f 3 形成异源二聚体而阻 止m f 3 形成同源二聚体而抑制了i r f 3 由细胞质进入细胞核,进而抑制瓜f 3 发挥生理 功能。i f n b 启动子有两个p r d s ( p o s i t i v er e g u l a t o r yd o m a i n s ) ,p r di 、p r d i i i ,它们 都能够与特异性的转录因子结合,与i s r e 的功能类似。,i r f 3 a 在各种细胞中都有表 达,研究人员将i r f 3 a 和瓜f 3 分别与i s g l 5 基因的i s r e 或i f n b 启动子的两个p r di i i i 在体外进行结合,通过e m s a ( e l e c t r o p h o r e t i cm o b i l i t ys h i f ta s s a y ) 检测发现,i r f 3 a 不能够像i r f 3 一样结合i s g l 5 基因的i s r e 以及p r di i i i 。鉴于此原因,i r f 3 a 可能 不是一个转录激活子,而是一个病毒介导的信号路径中的抑制子。共转染瓜f 3 和i r f 3 a 于h e c i b 细胞,发现i r f 3 调控的一系列报告基因如i f n b 、i s r e 等都发生明显的下降, 该结果说明i r f 3 a 可能抑制了i r f 3 活性。免疫共沉淀的结果显示,i r f 3 和i r f 3 a 在病 毒感染后可以形成异源二聚体,种种证据表明i r f 3 a 是i r f 3 激活的一个负调节子。另 有研究报道,m f 3 的另一种剪切变体瓜f 3 n i r s 3 对i r f 3 的活性也有抑制作用,在肝癌 细胞内过表达m f 3 n i r s 3 和i r f 3 ,发现受i r f 3 调控的i f n b 的转录活性减弱,并能够 促进病毒的生长【2 6 1 。尽管在肝癌细胞中,i f n 的产生途径是有缺陷的【2 7 1 ,主要是由于此 类细胞内的i r f 3 的功能失调,而此类细胞内i r f 3 n i r s 3 的水平异常之高,通过过表达 i r f 3 能够使d s r n a 介导信号路径得到恢复。在i f n 信号系统健全的细胞内表达 i r f 3 n i r s 3 导致i f n b 对于病毒的应答减弱,同时能够观察到病毒的复制增强。 i r f 3 在先天免疫应答中发挥重要的作用,因此,很多的病毒将它作为识别的靶蛋 白从而抑制它的激活。相关文献报道,i 型单纯疱疹病毒( h e r p e ss i m p l e xv i r u st y p e1 , h s v 1 ) 的i c p o 蛋白的细胞定位能够阻断i r f 3 调节的先天免疫应答。研究表明i c p 0 5 湖北人学硕: :学位论文 在细胞内的定位不同而具有不刷的功能【:8 1 ,当i c p 0 定位在细胞核中时,它通过一种经 典的方式在早期的感染中执行着人多数的功能1 2 9 , 3 0 , 3 1 1 ,当i c p o 定位于细胞质中而不是 细胞核中时,i c p 0 介导了i r f 3 的抑制作用以及在病毒感染后期抑制i s g 的表达。细 胞核内的i c p o 能够隔绝i r f 3 和c b p p 3 0 0 使它们远离宿主细胞的染色质,从而阻止i f n 和i s g 的产生。许多研究证实了h s v 1 进入宿主细胞后可以引发i r f 3 依赖的抗病毒的 激i 舌m , 3 a , 3 4 l ,用i c p 0 敲除的突变体去感染宿主,不能导致i r f 3 的激活,在没有免疫的 成纤维细胞中过表达全长的i c p 0 蛋白或在核内表达i c p 0 的突变体会导致细胞的毒性反 应。实验发现i c p 0 蛋白并不能导致i r f 3 路径中的成分的降解,虽然研究发现蛋白酶体 的活性可以改变i c p 0 在细胞中的定位,但是它却不是i c p o 介导的i r f 3 所必须的,因 此,i c p 0 的细胞定位阻止了i r f 3 的活性的分子机制目前仍然不清楚,有待进一步的研 究。 研究报道,e b v ( e p s t e i n b a r rv i r u s 的b g l f 4 蛋白激酶可以抑制干扰素调节因子3 的信 号通路【3 5 1 ,研究人员通过酵母双杂交鉴定出b g l f 4 与i r f 3 的一种剪切变体l r f 3 ( 5 d ) 相互作用,并用g s t p u l l d o w n _ :和c o i p 验证了二者的相互作用,随后的实验证实b g l f 4 也可以与i r f 3 相互作用,在h e l a 细胞或是2 9 3 t 细胞中,过表达b g l f 4 发现, p o l y ( i :c ) 诱导 的i r f 3 的激活减弱。进一步的研究发现,b g l f 4 并没有影响p o l y 0 :c ) 引起的l r f 3 的二聚 化、核定位以及c b p 蛋白的招募,非变性p a g e 显示,在过表达了b g l f 4 的细胞中由 p o l y ( i :c ) 弓l 起的i r f 3 的二聚化并没有发生改变,随后的免疫荧光检测发现,b g l f 4 存在 与否并不影响i r f 3 的核定位,同时免疫共沉淀试验表明,b g l f 4 没有影响由p o l y ( i :c ) 引 起的i r f 3 与c b p 蛋白复合物的形成。研究发现b g l f 4 在体外可以是i r f 3 磷酸化,但是它 并不是通过调节i r f 3 与p i n l 的相互作用来促进i r f 3 的泛素化与降解,而是通过阻止i r f 3 与i r f 3 应答元件的启动子的结合来抑* i l m f 3 的功能的。通过染色质免疫沉淀检测表明, 在b g l f 4 ;存在的状况下,p o l y ( i :c ) 束l j 激细胞导致的i r f 3 与i f n1 3 启动子的结合失效。 研究报道细胞内的p i n l ( p e p t i d y l , - p r o l y li s o m e r a s e ) 蛋白可负调节d s r n a 引起的1 r f 3 的抗病毒反应【3 6 】,d s r n a 的刺激会诱导i r f 3 的s e r 3 3 9 - p r 0 3 4 0 磷酸化,从而导致i r f 3 与p i n l 的相互作用,最终导致i r f 3 的多聚泛素化和蛋白酶体依赖的i r f 3 的降解。通 过r n a 干扰或是基因敲除抑制p i n l 的表达,导致i r f 3 依赖的i f n b 的转录增强与病毒 复制的减少。 1 3 t p r ( t e t r a t r i c o p e p t i d e sr e p e a t s ) 蛋白 6 1 前言 目前研究表明,热休克蛋白9 0 ( h e a ts h o c kp r o t e i n9 0 ,h s p 9 0 ) 有多种靶蛋白,包 括多种激酶、类固醇激素受体、转录因予以及病毒逆转录酶和内皮细胞一氧化氮合酶等 3 7 , 3 8 1 。h s p 9 0 在体内表现出的多种活性常需要多种共分子伴侣( c o c h a p e r o n e ) 的参与 3 9 , 4 0 1 ,研究发现这些共分子伴侣中有许多都是含t p r ( t e t r a t r i c o p e p t i d e sr e p e a t s ) 模体的 蛋白质。在h s p 9 0 蛋白的c 端有一个t p r 接受位点,许多含t p r 结构域的共分子伴侣如 c h i p ( c a r b o x y lt e r m i n u so fh s c 7 0i n t e r a c t i n gp r o t e i n ) 、h o p ( h e a ts h o c kp r o t e i n9 0 o r g n i z i n gp r o t e i n ) 、p p 5 ( p r o t e i np h o s p h a t a s e5 ) 和大亲免素分子( 1 a r g ei m m u n o p h i l i n s ) 等都可与这一位点结合。 1 3 1t p r 模体 t p r 模体是由3 4 个氨基酸组成的序列单元经串联重复排列而成。它最初是在酿酒 酵母( sa c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 的细胞分裂周期基因编码的周期蛋白中发现的。与酿 酒酵母细胞分裂周期蛋i 刍c d c 2 3 有着较高同源性的其它几个周期蛋白c d c l 6 、s s n 6 和s k l 3 以及裂殖酵母f ,s c h i z o s a c c h a r o m y c e sp o m b e ) q 的n u c 2 + 也有数量不等的t p r 模 体。经序列分析表明,组成t p r 模体的氨基酸残基的大小、疏水性和间隔的距离上均存 在较高的保守性【4 1 1 。其中有8 个氨基酸残基的保守频率较高,形成一个共有序列,即第4 位( w l f ) 、第7 位( ui m ) 、第8 位( g s ) 、第1 1 位( y uf ) 、第2 0 位( s e ) 、 第2 4 位( f y l ) 、第2 7 位( s l ) 和第3 2 位( p l ( e ) 。功能不同的t p r 模体的序列 保守性仅限于这8 个共有氨基酸残基,特别是第8 、2 0 、2 4 、2 7 位残基的保守频率更高。 功能相似的t p r 模体除了存在这8 个保守的共有氨基酸残基外,还有一定的序列保守 性。例如,与h s p 9 0 直接相互作用的t p r 蛋白( h o p ,p p 5 ,c y p 4 0 ) 的t p r 模体中,在 8 个共有氨基酸残基旁侧仍有一些小的、疏水性的和带电荷的氨基酸残基也是保守的,它 们在介导与h s p 9 0 的相互作用中很重要【4 2 1 。t p r 模体的研究表明,t p r 模体含有约5 0 的a 螺旋,但很少有或没有b 折叠。t p r 模体二级结构是由两个反平行的a 螺旋结构域a 和b 组成。结构域a 含有共有保守残基为4 、7 、8 、1 0 和1 1 位,而结构域b 中包含第2 0 、2 4 、2 7 位残基。t p r 模体的a 螺旋规律性重复排列形成了一个右手超螺旋构象并产生一个两亲 性的沟( a m p h i p h i l i cg r o o v e ) ,许多靶蛋白可以与之互补结合。 1 3 2s g t a ( s m a l l g l u t a m i n e r i c ht e t r a t r i c o p e p t i d e ( t p r ) 一c o n t a i n i n g , a l p h a ) 7 湖北人学硕j 卜学位论文 s g t a 属于t p r 蛋白家族,最早发现是作为一种与独立的细小病毒属h 1 或h i v - 1 的非结构蛋白相互作用的蛋白。为螺旋转角螺旋蛋白,由3 1 4 个氨基酸组成,分子量 为3 5 k d ,在大多数组织细胞中都有表达。通过免疫荧光定位,发现在细胞核与细胞质中 都有s g t a 的存在。其分子中含有三个串联重复的t p r 结构,每一个t p r 形成一个反 向平行的a 螺旋,在其c 端富含谷氨酰胺残基。在s g t a 参与的众多的生命活动中,t p r 模块发挥着主要的作用,尤其是前两个t p r 模块。目前研究表明,它作为一种共分子伴 侣在细胞周期调控、转录抑制、应激反应、蛋白质转运、r n a 剪接、蛋白质折叠中发挥 重要作用【4 3 , 4 4 , 4 5 , 4 6 】。 1 3 3s g t a 的分子结构及相关功能 s g t a 的分子结构主要有三部分组成:n 端部( 1 - 8 9 a a ) ,中心三个重复的t p r ( 9 0 1 9 2 a a ) 和c 端部( 1 9 3 3 1 4 a a ) ( 如图1 2 所示) 。相关报道表明,s g t a 具有e 3 泛素连接 酶的活性,例如,它能够与热休克同源蛋白7 0 ( h e a t s h o c kc o g n a t e p r o t e i n7 0 ,h s c 7 0 ) 的c 端相互作用【4 7 1 ,s g t a 作为一种共分子伴侣调节h s p 7 0 的活性。在己知的共分子伴侣 中,它们都可以调节伴侣复合物的活性,s g t a 在体外的活性和t p r 的空间排列上类似 于c h i p 。两个蛋白都可以微弱的抑$ 1 j a t p a s e 和h s p 7 0 的再折叠活1 生 4 8 1 。并且两个蛋白 的t p r 与h s p 7 0 的相互作用是必须的,研究表明,s g t a 严重的影n l f i j h s c 7 0 的a t p a s e 活性, 这准确的反应了h s c 7 0 的再折叠受s g t a 影响。s g t a 与h s p 7 0 的c 端调节区的t p r 受体位 点相互作用。c h i p 可能也具有同样的相互作用位点。s g t a 与c h i p 的相互关系目前不是 很清楚,c h i p 在蛋白质折叠和蛋白质降解方面发挥着关键性作用。s g t a 缺乏一个明显 的u b o x ,而c h i p 和e 4 泛素连接酶家族都具有这个结构【4 9 1 。因此s t g a 可能是c h i p 的一 个竞争性对手,通过结合h s p 7 0 相同的位点,竞争性的抑制c h i p 介导的蛋白水解作用。 另外,s g t a 可以与b 一淀粉样肽相互作用【5 0 】,通过双链r n a 抑制s g t a 的表达,发现毒性 相关的b - 淀粉样肽的表达也受到抑制。 s g t a 能够与多种蛋白相互作用,目前报道的主要有,h s p 9 0 、g r o w t hh o r m o n e r e c e p t o r ( g h r ) 、h i v 的g a g 和v p u 蛋白等【5 1 5 2 5 3 1 。在与h s p 9 0 的相互作用中,发现了 s g t a 作为t p r 家族的成员,既可以与h s p 9 0 a 互作,又可与h s p 9 0 b 互作,目前对于 s g t a 与h s p 9 0 a 的互作的生理意义并不清楚,但是在与h s p 9 0 b 的互作的研究中发现, 用g a 处理h e l a 细胞,发现二者之间的互作受到抑制,同时发现s g t a 在细胞核内的 积累明显的增多,一般情况下s g t a 是作为共分子伴侣在胞质内与h s p 9 0 结合,当细 r 1 前言 胞发生凋亡时,可以发现s g t a 与h s p 9 0 的分离,并且s g t a 在细胞核内的含量增加, 所以研究人员推测s g t a 在细胞核内的定位可能与细胞的捌亡关。在7 7 2 1 细胞内表达 s g t a 会促进该细胞的凋亡【5 4 l ,实验表明,在凋亡丌始的细胞内异常的表达s g t a ,细 胞内的d n a 碎片与细胞核破坏增强。当细胞内的s g t a 被敲除,细胞的凋亡进程明显 的减弱。所有的结果表明,s g t a 可能是一个促凋亡因子。s g t a 能够与g h r 互作参 与了泛素化系统,而泛素化系统又参与了g h r 的内化作用1 5 5 1 ,但是这并没有影响到 s g t a 与g h r 的的相互作用,说明g h r 与s g t a 的互作发生在g h r 的内化作用之前, 因此,s g t a 可能是作为一个泛素化系统的调节器,通过竞争u b e 模块来下调g h r 的 水平。s g t a 与h i v 的v p u 和g a g 蛋白也发生联系,其具体的分子机制目前还不清楚, 一般认为,v p u 可以影响g a g 的不同折叠,并且v p u 是通过改变s g t a 与h s p 7 0 的伴 侣复合物的活性来影响g a g 的折叠,总之,s g t a 参与众多的生理活动,随着研究的深 入,它的具体功能将被一一揭开。 1 4r n a 干扰 t p r 图1 - 2s g t a 的分子结构示意图 早在1 9 9 0 年进行转基因植物有关研究时偶然发现,将全长或部分基因导入植物细 胞后某些内源性基因不能表达,但这些基因的转录并无任何影响,并将这种现象称为基 因转录后沉默( p o s t t r a
温馨提示
- 1. 本站所有资源如无特殊说明,都需要本地电脑安装OFFICE2007和PDF阅读器。图纸软件为CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
- 2. 本站的文档不包含任何第三方提供的附件图纸等,如果需要附件,请联系上传者。文件的所有权益归上传用户所有。
- 3. 本站RAR压缩包中若带图纸,网页内容里面会有图纸预览,若没有图纸预览就没有图纸。
- 4. 未经权益所有人同意不得将文件中的内容挪作商业或盈利用途。
- 5. 人人文库网仅提供信息存储空间,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对用户上传分享的文档内容本身不做任何修改或编辑,并不能对任何下载内容负责。
- 6. 下载文件中如有侵权或不适当内容,请与我们联系,我们立即纠正。
- 7. 本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。
最新文档
- 保健第二章 学前儿童生长发育及健康评价练习试题附答案
- 保健病房N1-N4理论测试题【附答案】
- 中班健康洗手歌教案反思
- 综合布线线缆和线槽规格型号及桥架选用步骤
- -浅析黄自艺术歌曲风格特点-以《思乡》为例
- 十里四香·休闲田园-宁波东钱湖美丽乡村规划方案设计
- 2025届新高考语文冲刺热点复习:高考选修文言文9篇
- 人教版农业的区位选择
- 中学生评语大全(非常全面)
- 秋季六上语文教研组备课组工作计划
- 电气工程及其自动化专业介绍课件
- 设立再生资源回收利用公司商业计划书
- 拼多多供应链管理计划书
- 研发项目的风险识别与应对策略分析方法
- 《血液检查化验单》课件
- 急性脑梗死的护理教学查房课件
- 手表买卖合同协议书
- 科研伦理与学术规范期末考试
- 水压桩施工方案
- 质量事故处理流程图
- 既有建筑维护与改造通用规范
评论
0/150
提交评论