（微生物学专业论文）干扰素调节因子3的调控研究.pdf

，：0 o fi nt e r f e r o n 3 at h e s i ss u b m i t t e df o rt h ed e g r e eo fm a s t e r c a n d i d a t e ：l u oz h e n s u p e r v i s o r ：a s s o c i a t ep r o f l ic h u n h u a h u b e iu n i v e r s i t y w u h a n ，c h i n a 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，并提供目录检 索与阅览服务；学校可以允许采用影印、缩印、数字化或其它复制手 段保存学位论文；在不以赢利为目的的前提下，学校可以公开学位论 文的部分或全部内容。( 保密论文在解密后遵守此规定) 作者签名：写寺肜 指导教师签名；爹厉娣 日期： 。b 、叨 日期：沙l p 侈、易7 摘要 干扰素调节因子3 在调节病毒入侵的先天免疫应答中发挥重要的作用。i r f 3 激活的细微调节对于i r f 3 功能的发挥至关重要，我们通过酵母双杂交的方法找 到了一个可以与i r f 3 相互作用的蛋白s g t a ，免疫荧光分析表明i r f 3 与s g t a 共定位于细胞质中，使用g s t - p u l l d o w n 、免疫共沉淀进一步的证实了它们之间 的相互作用。为了进一步的探索它们之间的相互作用的生理意义，我们构建了一 个能够抑制细胞内s g t a 蛋白表达的s i r n a 表达载体，通过r n a i 的方式降低 s g t a 含量，导致仙台病毒介导的i f nb 启动子的转录活性下降。因此，我们推 测s g t a 与瓜f 3 相互作用可能促进了i r f 3 的激活。 关键词：i r f 3 ；s g t a ；g s tp u l l d o w n ；荧光共定位；免疫共沉淀；r n a i ； i f n l 3 启动子 a b s t r a c t i n t e r f e r o nr e g u l a t o r yf a c t o r3 ( i r f 3 ) p l a y sac r u c i a lr o l ei nm e d i a t i n gc e l l u l a r r e s p o n s e st ov i r a li n f e c t i o n t h ef i n e t u n i n go ft h ea c t i v i t yo fi r f 3i sn e c e s s a r yf o ri t s f u n c t i o n i nay e a s tt w o h y b r i ds c r e e n i n gf o rp o t e n t i a li r f 3 i n t e r a c t i n gp r o t e i n s ，w e i d e n t i f i e dt h es m a l lg l u t a m i n e r i c h t e t r a t r i c o p e p t i d e ( t p r ) 一c o n t a i n i n g ，a l p h a ( s g t a ) a sa l li r f 3 - i n t e r a c t i n gp r o t e i n i m m u n o f l u o r e s c e n ta n a l y s i ss h o w e dt h a t i r f 3w a sc o l o c a l i z e dw i t hs g t aw i t h i nt h ec y t o p l a s m t h ei n t e r a c t i o nw a sf u r t h e r v e r i f i e db yg s tp u l l - d o w na n dc o - i m m u n o p r e c i p i t a t i o ne x p e r i m e n t s t of u r t h e r e x p l o r et h ep h y s i o l o g i c a ls i g n i f i c a n c eo f t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e ni r f 3a n ds g 玩w e c o n s t r u c t e das m a l li n t e r f e r i n gr n a ( s i r n a ) e x p r e s s i o nv e c t o rt a r g e t e ds g t a k n o c k d o w no fe x p r e s s i o no fs g t ab yr n ai n t e r f e r e n c ea t t e n u a t e dt h ea c t i v a t i o no f t h ei f n b p r o m o t e rt r i g g e r e db ys e v t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a ts g t am a yb e i n v o l v e di nt h ev i r u s i n d u c e da c t i v a t i o no fi r f 3 k e yw o r d s ：i r f 3 ； s g t a ；g s tp u l l d o w n ；f l u o r e s c e n c et e s t ；c o - i p ；r n a i ； i f n bp r o m o t e r i l k d d h m i n s e c d m s 0 d n t p e d l a i p t g s d s k i l o d a l t o n d a y h o u r m i n u t e s e c o n d d i m e t h y ls u l f o x i d e 氨苄青霉素 卡那霉素 克 微克 毫升 微升 碱基对 千碱基 千道尔顿 天 小时 分钟 秒 二甲基亚砜 d e o x y 血e d i a m i n et r i p h o s h a t e脱氧核糖核苷三磷酸 e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d乙二胺四乙酸 i s o p r o p y l t h i o 1 3dg a l a c t o s i d e 异丙基一b d 一半乳苷 s o d i u md o d e c y l s u l p h a t e十二烷基硫酸钠 x - g a l5 一b r o m o 一4 一c h l o r o 一3 一i n d o l y 1 3dg a l a c t o s i d e5 溴一4 一氯3 - 口引哚1 3d 半 乳糖苷 l bl u r i a _ b e r t a n im e d i u m i i i l b 培养基 1 2 干扰素调节因子3 1 1 2 1i r f 3 的分子结构及生理功能2 1 2 2i r f 3 的磷酸化与激活2 1 2 3m f 3 的调控研究3 1 2 3 1i r f 3 的正向调控研究3 1 2 3 2 瓜f 3 的负调控研究5 1 3t p r 蛋白6 1 3 1t p r 模体7 1 3 2s g l a 7 1 3 3s g t a 的结构和功能”8 1 4r n a 干扰9 1 3 1 r n a 干扰的作用机制1 0 1 5 研究目的1 0 2 材料与方法”1 2 2 1 材料“1 2 2 1 1 菌株，细胞系和质粒1 2 2 1 1 1 菌株1 2 2 1 1 2 细胞系1 2 2 1 1 3 质粒1 2 i v 2 11 4 引物：一1 3 2 1 2 培养基1 4 2 1 3 试剂和酶1 4 2 1 4 主要缓冲液：1 4 2 2 方法“1 6 2 2 1p c r 一1 6 2 2 2 质粒d n a 的抽提”1 7 2 2 3 大肠杆菌感受态细胞的制备1 7 2 2 4 大肠杆菌的常规转化1 8 2 2 5 大肠杆菌的快速转化1 8 2 2 6s d s p a g e 1 8 2 2 7 免疫印记1 9 2 2 8h e k 2 9 3 细胞的复苏”2 0 2 2 9h e k 2 9 3 细胞的冻存”2 0 2 2 1 0 哺乳动物细胞系h e k 2 9 3 的组织培养”2 0 2 2 1 1 哺乳动物细胞的转染2 0 2 2 1 2 目的基因在大肠杆菌中的表达”2 1 2 2 1 3g s t 融合蛋白的纯化2 1 2 2 1 4g s t - p u l ld o w n 2 2 2 2 1 5 间接免疫荧光2 2 2 2 1 6 免疫共沉淀”2 3 2 2 1 7 双荧光素酶报告基因检测2 4 v - 2 5 - 2 5 2 6 2 7 2 8 2 8 下降2 9 3 2 3 2 4 2i l r f 3 与s g t a 的相互作用的生理意义3 2 4 3 展望”3 3 参考文献3 4 致i 勇十”4 0 v i 1 前言 1 1 干扰素调节因子 1 前言 干扰素调节因子家族( i n t e r f e r o nr e g u l a t o r yf a c t o rf a m i l y ，i r f s ) 是一类在分子结 构特征上保守的转录因子家族，一共有9 个分别为i r f i 9 ，为螺旋一转角一螺旋蛋白，其 分子结构主要分为两个部分即d n a 结合结构域和转录激活结构域，其所有的成员的前 1 1 5 个氨基酸同源性较高，5 个保守的酪氨酸( t y r ) 重复模体被1 0 - - - - 1 8 个氨基酸残基分开。 一些成员还含有脯氨酸( p r o ) 富集结构域、i r f s 相关结构域( 1 a d ) 和丝氨酸或苏氨酸磷酸 化调控位点。m f s 广泛表达在各类细胞中，许多成员被病毒、脂多糖( l p s ) 和肿瘤坏死 因子( t u m o rn e c r o s i sf a c t o r ，t n f ) 等信号刺激之后，i r f s 可以结合在相似的d n a 序列 上，如干扰素刺激反应元件( i n f s t i m u l a t e dr e s p o n s ee l e m e n t ，i s r e ) l ，干扰素调节因子 家族调控着整个i 型干扰素系统，包括干扰素的产生，到不同的干扰素应答，因此，它 们为机体提供了一个主要的抵抗病原体入侵的方式。由于家族成员众多，每一种成员有 各自的特点，因此，各种成员在调控免疫的过程中都发挥着自己独特的生理功能。i r f s 除了能够诱导先天免疫和适应性免疫的产生外，它们在某些细胞的生长和分化方面也发 挥着调节作用i 引。 在9 个i r f s 中，瓜f 3 和i r f 7 在t o l l 1 i k e 受体信号通路中最早被激活的，在早期i 型i f n 的产生中起到关键性作用。i r f 3 和i r f 7r 一范够被i k b 家族激酶磷酸化激活，激活后形成二 聚体，然后定位到细胞核中调节i 型i f n 的转录。i r f l 与i r f 2 在分子结构上类似，它们 的d n a 结合结构域上高度同源，但蛋白质c 端的转录激活域部分不同，它们竞争性的结 合干扰素或干扰素刺激基因上游的调控序列【引，i r f i 能够刺激i f n 和i s g 的转录，而i r f 2 结合相应的靶序列后，抑制i f n 和i s g 基因的转录。i r f 4 是淋巴细胞特异性的转录因子， 与i r f s 中的其他成员或转录因子p u 1 结合形成转录复合物【4 1 ，调节i f n 及淋巴因子的表 达，并参与b 细胞的成熟、t 细胞转化及抗病毒的免疫应答。i r f 8 主要表达于造血系统 细胞中，它能够促进髓系分化，调节白血病细胞的免疫反应【引，因此被认为是潜在的抑 癌基因。i r f 9 主要是通过和其他因子协同作用，参与i f n 的抗癌效应1 6 j 。 湖北人! 学硕十! 学位论文 1 2 干扰素调节因子3 干扰素调节因子3 ( i n t e r f e r o nr e g u l a t o r yf a c t o r3 ，i r f 3 ) 属于 家族中的一种，在病毒感染早期，细胞对抗病毒的感染主要依赖于i 型 i r f 3 对i 型i f n 的产生起关键性作用。 1 2 1i r f 3 的分子结构及生理功能 i r f 3 是由4 2 7 个氨基酸组成的转录因子，分子量大约为5 5 k d ，属于螺旋转角 螺旋蛋白，组成型的表达于多种细胞的胞质中。i r f 3 分子的结构( 如图1 - 1 ) ：从 n 端到c 端依次为d n a 结合结构域( d b d ，第1 1 3 4 位) 、转录激活结构域( t a d ， 第1 3 4 3 9 4 位) ，t a d 包含核定位序列( n l s ) 、核输出序列( n e s ) 、脯氨酸富含 区( p r o ) 、i r f 相关结构域( 1 a d ) 和和反应结构域( r d ，第3 8 2 4 2 7 位) 。t a d 的两侧由两个相互作用的自身抑制结构域( a i d ) 组成，r d 的第3 8 5 4 0 5 位氨基 酸内有两套丝氨酸苏氨酸( s e 仉1 l r ) 磷酸化位点。其中第3 8 6 位s e r 是i r f 3 激酶 的靶位点，它的磷酸化对于i r f 3 的活化起决定作用n n 图1 - 1i r f 3 分子结构不葸图 研究表明，当机体受到病毒感染等因素刺激时，可导致i r f 3 分子c 端的丝氨酸残 基磷酸化，从而解除了t a d 两端的a i d 的相互作用，暴露出i a d 和d b d ，促使i r f 3 形成同源二聚体，接着i r f 3 二聚体与c b p ( c r e bb i n d i n gp r o t e i n ) p 3 0 0 1 8 1 形成三聚体， 当i r f 3 二聚体与c b p p 3 0 0 形成三聚体后可使i r f 3 以三聚体的形式由细胞质进入细 胞核内，并结合在i f n 启动子调控区的i r f 3 的d n a 结合位点上，启动i 型i f n 的转 录。i r f 3 不能单独诱导i f n a 和b 的表达【8 1 ，它必须与n f 1 ( b 和a t f 2 c j u n 形成转 录增强复合体才能共同诱导i f n 的表达【9 1 ，从而激活细胞内的先天免疫应答。 1 2 2i r f 3 的磷酸化与激活 1 前言 i r f 3 参与众多的生理生化反应发挥其生理功能主要依赖于i r f 3 的磷酸化激活， 多种因素可以导致i r f 3 的磷酸化激活，如d s r n a 、病毒感染等。在i r f 3 的分子绐构 内有许多与i r f 3 激活相关的磷酸化位点，图卜1 中以明确标出。最早被确认与磷酸化 相关的是3 8 5 、3 8 6 位的两个丝氨酸残基| l 川，研究人员用丙氨酸替代这两个丝氨酸后， 当用病毒感染细胞后，发现i r f 3 不能被激活，进一步的研究表明，这两个丝氨酸的磷 酸化可能跟i r f 3 与c b p p 3 0 0 的相互结合有关【1 1 l 。到目前为止，i r f 3 分子内的磷酸化 位点以基本明确，不同的磷酸化位点的发挥着不同的功能，如i r f 3 分子内的3 9 6 、3 9 8 、 4 0 2 、4 0 5 位的丝氨酸残基与4 0 4 位的苏氨酸残基它们都是病毒诱导的磷酸化位点1 1 2 j ， 当这些氨基酸被突变后，病毒感染细胞不能激活i r f 3 。而i r f 3 分子中的1 3 5 位丝氨酸 残基是d n a 蛋白激酶( ( d n a d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s e ，d n a - p k ) 磷酸化的作用位点【1 3 l ， 当细胞内的d n a 受到损伤时，d n a 蛋白激酶使该位点的丝氨酸磷酸化，激活的i r f 3 在细胞核内的停留时间延长，也抑制了i r f 3 的降解。研究还发现，在正常的细胞内就 有磷酸化的i r f 3 ，只是这种磷酸化的瓜f 3 分子的磷酸化可能仅仅发生在其n 端，进一毒 步的研究表明，生长因子、t n f a 等都能够通过m a p k k k 相关途径促使取f 3 的n 端 磷酸化。有人推测n 端的磷酸化可能影响某些蛋白质对m f 3 的调控。目前的研究表明 多种蛋白质参与了1 r f 3 的磷酸化调控，大量的实验证明，i r f 3 的活化必须依赖相关的 激酶，如i k k e 、t b k l 掣1 4 , 1 5 , 1 6 】，而多数参与调解i r f 3 调控的蛋白主要是通过调解这 些激酶的活性来增强或是减弱i r f 3 的活性。 。 1 2 3i r f 3 的调控研究 1 2 3 1 瓜f 3 的正调控研究 研究表明，在由病毒或双链r n a 引起的i r f 3 的激活和干扰素的产生先天免疫应答中 t b k l 发挥了重要的作用。相关文献报道，h s p 9 0 能够调节因病毒感染而导致的i r f 3 的 激活，通过h s p 9 0 特异性的抑制剂g a ( g e l d a n a m y c i n ) 抑隹j i j h s p 9 0 的活性或是通过r n a i 的方法下调细胞h s p 9 0 的水平，从而导致因病毒感染引起的i r f 3 的激活受到抑制【1 7 1 ， 般认为h s p 9 0 作为分子伴侣的功能主要是维持蛋白质分子结构的稳定，但是通过g a 抑锋j l j h s p 9 0 的功能，并未发现内源性的i r f 3 发生降解，说明h s p 9 0 调节的i r f 3 的活性并 不是通过直接稳定i r f 3 的分子结构来发挥作用的。已有文献证实t b k l 作为一种激酶 ( t a n kb i n d i n gk i n a s e l ) 能够使i r f 3 发生磷酸化1 1 4 1 5 1 ，通过g a 抑斜i i j h s p 9 0 的活性发现细 胞内t b k l 易发生降解，说明t b k l 分子稳定性需要h s p 9 0 的作用，随后的免疫共沉淀实 3 湖北人学硕十学位论文 验证实，h s p 9 0 、i r f 3 和t b k l 在病毒的刺激下能够形成三元复合物【1 8 j ，最终实验结果 表明h s p 9 0 促进i r f 3 激活主要是通过与t b k l 相互作用，使t b k i 的分子结构处于稳定状 态来调节i r f 3 磷酸化激活，它们三者之间是通过形成三元复合物来调控i r f 3 的。 研究发现，当病毒感染细胞后，t r i m 2 1 ( t r i p a r t i t em o t i f - c o n t a i n i n g2 1 ) 可以1 r f 3 干h 互 作用【1 9 】，在机体的抗病毒反应中，t r i m 2 1 是维持i r f 3 激活所必须的。在细胞内过表达 或是敲除t r i m 2 1 会分别导致i r f 3 调节的基因的表达的增强或减弱，其可能的分子机制 是t r i m 2 1 - t - 扰t p i n l ( p e p t i d y l p r o l y lc i s t r a n si s o m e r a s e ，n i m a - i n t e r a c t i n g1 ) 与i r f 3 的相 互作用【2 0 】，从而阻止了i r f 3 的泛素化降解。t r i m 2 1 的b 3 0 2 结构域的一个保守模块是对 于瓜f 3 的调节时起关键性作用，t r i m 2 1 存在或是缺乏时导致机体的抗病毒效应的明显 增强或是减弱。 r h og t p a s er a c l 和p 2 1 激活激酶( p a k l ) 是病毒引起的i r f 3 激活路径中i k k e 和t b k l 的上游蛋白【2 l 】。当病毒感染细胞后，r a c l 被激活，并且调控i r f 3 的磷酸化及 活性，抑制r a c l 会导致i f n b 启动子的活性减弱，并增强病毒的复制。p a k l 作为r a c l 的下游效应物1 2 2 】，能够调节i k k e 和t b k l 的活性，从而建立一个最早的病毒引起的 i r f 3 激活信号路径。相关实验结果表明，r a c l 不是激酶，因此，它可能不能够导致i r f 3 的磷酸化，而激酶p a k l 作为r a c l 的下游效应物已经被证实它能够参与信号转导从而 改变基因的表达【矧，但是i r f 3 报告基因启动子活性检测表明，尽管过表达p a k l 不能 影响i r f 3 启动子的活性，但是p a k l 活性受到抑制，会导致i r f 3 的启动子活性下降。 说明p a k l 的活性不是病毒介导的i r f 3 激活所必须的。因此，p a k l 可能参与了维持 1 前言 到i r f 3 的降解受到抑制，同时细胞骸内的i r f 3 的停留t 卜t f n j 延长，所有结果表明，在具 有d n a p k 活性的细胞中，i r f 3 的降解进程被延缓，进一步的研究显示，i r f 3 的1 3 5 为t h r 磷酸化能够减弱i r f 3 的核输出，通过显微注射在体外d n a p k 磷酸化的i r f 3 和没有处理的i r f 3 ，通过荧光可以观察到，被d n a p k 磷酸化的i r f 3 的核输出被明显 的抑制，这些数据表明d n a p k 通过磷酸化i r f 3 的1 3 5 位t h r 来阻止i r f 3 的核输出， 从而抑制其降解，由此延长了i r f 3 的生命周期。 1 2 3 2i r f 3 的负调控研究 在i r f 3 的调控的研究过程中发现，i r f 3 具有多种剪切变体，已有文献报道，i r f 3 的一种剪切变体i r f 3 a 能够抑制i r f 3 的活性【2 5 1 ，i r f 3 a 缺乏部分d n a 结合区，不能够 结合在i r f s 结合元件及i f n 刺激应对元件上，i r f 3 a 通过与i r f 3 形成异源二聚体而阻 止m f 3 形成同源二聚体而抑制了i r f 3 由细胞质进入细胞核，进而抑制瓜f 3 发挥生理 功能。i f n b 启动子有两个p r d s ( p o s i t i v er e g u l a t o r yd o m a i n s ) ，p r di 、p r d i i i ，它们 都能够与特异性的转录因子结合，与i s r e 的功能类似。，i r f 3 a 在各种细胞中都有表 达，研究人员将i r f 3 a 和瓜f 3 分别与i s g l 5 基因的i s r e 或i f n b 启动子的两个p r di i i i 在体外进行结合，通过e m s a ( e l e c t r o p h o r e t i cm o b i l i t ys h i f ta s s a y ) 检测发现，i r f 3 a 不能够像i r f 3 一样结合i s g l 5 基因的i s r e 以及p r di i i i 。鉴于此原因，i r f 3 a 可能 不是一个转录激活子，而是一个病毒介导的信号路径中的抑制子。共转染瓜f 3 和i r f 3 a 于h e c i b 细胞，发现i r f 3 调控的一系列报告基因如i f n b 、i s r e 等都发生明显的下降， 该结果说明i r f 3 a 可能抑制了i r f 3 活性。免疫共沉淀的结果显示，i r f 3 和i r f 3 a 在病 毒感染后可以形成异源二聚体，种种证据表明i r f 3 a 是i r f 3 激活的一个负调节子。另 有研究报道，m f 3 的另一种剪切变体瓜f 3 n i r s 3 对i r f 3 的活性也有抑制作用，在肝癌 细胞内过表达m f 3 n i r s 3 和i r f 3 ，发现受i r f 3 调控的i f n b 的转录活性减弱，并能够 促进病毒的生长【2 6 1 。尽管在肝癌细胞中，i f n 的产生途径是有缺陷的【2 7 1 ，主要是由于此 类细胞内的i r f 3 的功能失调，而此类细胞内i r f 3 n i r s 3 的水平异常之高，通过过表达 i r f 3 能够使d s r n a 介导信号路径得到恢复。在i f n 信号系统健全的细胞内表达 i r f 3 n i r s 3 导致i f n b 对于病毒的应答减弱，同时能够观察到病毒的复制增强。 i r f 3 在先天免疫应答中发挥重要的作用，因此，很多的病毒将它作为识别的靶蛋 白从而抑制它的激活。相关文献报道，i 型单纯疱疹病毒( h e r p e ss i m p l e xv i r u st y p e1 ， h s v 1 ) 的i c p o 蛋白的细胞定位能够阻断i r f 3 调节的先天免疫应答。研究表明i c p 0 5 湖北人学硕： ：学位论文 在细胞内的定位不同而具有不刷的功能【：8 1 ，当i c p 0 定位在细胞核中时，它通过一种经 典的方式在早期的感染中执行着人多数的功能1 2 9 , 3 0 , 3 1 1 ，当i c p o 定位于细胞质中而不是 细胞核中时，i c p 0 介导了i r f 3 的抑制作用以及在病毒感染后期抑制i s g 的表达。细 胞核内的i c p o 能够隔绝i r f 3 和c b p p 3 0 0 使它们远离宿主细胞的染色质，从而阻止i f n 和i s g 的产生。许多研究证实了h s v 1 进入宿主细胞后可以引发i r f 3 依赖的抗病毒的 激i 舌m , 3 a , 3 4 l ，用i c p 0 敲除的突变体去感染宿主，不能导致i r f 3 的激活，在没有免疫的 成纤维细胞中过表达全长的i c p 0 蛋白或在核内表达i c p 0 的突变体会导致细胞的毒性反 应。实验发现i c p 0 蛋白并不能导致i r f 3 路径中的成分的降解，虽然研究发现蛋白酶体 的活性可以改变i c p 0 在细胞中的定位，但是它却不是i c p o 介导的i r f 3 所必须的，因 此，i c p 0 的细胞定位阻止了i r f 3 的活性的分子机制目前仍然不清楚，有待进一步的研 究。 研究报道，e b v ( e p s t e i n b a r rv i r u s 的b g l f 4 蛋白激酶可以抑制干扰素调节因子3 的信 号通路【3 5 1 ，研究人员通过酵母双杂交鉴定出b g l f 4 与i r f 3 的一种剪切变体l r f 3 ( 5 d ) 相互作用，并用g s t p u l l d o w n _ ：和c o i p 验证了二者的相互作用，随后的实验证实b g l f 4 也可以与i r f 3 相互作用，在h e l a 细胞或是2 9 3 t 细胞中，过表达b g l f 4 发现, p o l y ( i ：c ) 诱导 的i r f 3 的激活减弱。进一步的研究发现，b g l f 4 并没有影响p o l y 0 ：c ) 引起的l r f 3 的二聚 化、核定位以及c b p 蛋白的招募，非变性p a g e 显示，在过表达了b g l f 4 的细胞中由 p o l y ( i ：c ) 弓l 起的i r f 3 的二聚化并没有发生改变，随后的免疫荧光检测发现，b g l f 4 存在 与否并不影响i r f 3 的核定位，同时免疫共沉淀试验表明，b g l f 4 没有影响由p o l y ( i ：c ) 引 起的i r f 3 与c b p 蛋白复合物的形成。研究发现b g l f 4 在体外可以是i r f 3 磷酸化，但是它 并不是通过调节i r f 3 与p i n l 的相互作用来促进i r f 3 的泛素化与降解，而是通过阻止i r f 3 与i r f 3 应答元件的启动子的结合来抑* i l m f 3 的功能的。通过染色质免疫沉淀检测表明， 在b g l f 4 ；存在的状况下，p o l y ( i ：c ) 束l j 激细胞导致的i r f 3 与i f n1 3 启动子的结合失效。 研究报道细胞内的p i n l ( p e p t i d y l , - p r o l y li s o m e r a s e ) 蛋白可负调节d s r n a 引起的1 r f 3 的抗病毒反应【3 6 】，d s r n a 的刺激会诱导i r f 3 的s e r 3 3 9 - p r 0 3 4 0 磷酸化，从而导致i r f 3 与p i n l 的相互作用，最终导致i r f 3 的多聚泛素化和蛋白酶体依赖的i r f 3 的降解。通 过r n a 干扰或是基因敲除抑制p i n l 的表达，导致i r f 3 依赖的i f n b 的转录增强与病毒 复制的减少。 1 3 t p r ( t e t r a t r i c o p e p t i d e sr e p e a t s ) 蛋白 6 1 前言 目前研究表明，热休克蛋白9 0 ( h e a ts h o c kp r o t e i n9 0 ，h s p 9 0 ) 有多种靶蛋白，包 括多种激酶、类固醇激素受体、转录因予以及病毒逆转录酶和内皮细胞一氧化氮合酶等 3 7 , 3 8 1 。h s p 9 0 在体内表现出的多种活性常需要多种共分子伴侣( c o c h a p e r o n e ) 的参与 3 9 , 4 0 1 ，研究发现这些共分子伴侣中有许多都是含t p r ( t e t r a t r i c o p e p t i d e sr e p e a t s ) 模体的 蛋白质。在h s p 9 0 蛋白的c 端有一个t p r 接受位点，许多含t p r 结构域的共分子伴侣如 c h i p ( c a r b o x y lt e r m i n u so fh s c 7 0i n t e r a c t i n gp r o t e i n ) 、h o p ( h e a ts h o c kp r o t e i n9 0 o r g n i z i n gp r o t e i n ) 、p p 5 ( p r o t e i np h o s p h a t a s e5 ) 和大亲免素分子( 1 a r g ei m m u n o p h i l i n s ) 等都可与这一位点结合。 1 3 1t p r 模体 t p r 模体是由3 4 个氨基酸组成的序列单元经串联重复排列而成。它最初是在酿酒 酵母( sa c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 的细胞分裂周期基因编码的周期蛋白中发现的。与酿 酒酵母细胞分裂周期蛋i 刍c d c 2 3 有着较高同源性的其它几个周期蛋白c d c l 6 、s s n 6 和s k l 3 以及裂殖酵母f ，s c h i z o s a c c h a r o m y c e sp o m b e ) q 的n u c 2 + 也有数量不等的t p r 模 体。经序列分析表明，组成t p r 模体的氨基酸残基的大小、疏水性和间隔的距离上均存 在较高的保守性【4 1 1 。其中有8 个氨基酸残基的保守频率较高，形成一个共有序列，即第4 位( w l f ) 、第7 位( ui m ) 、第8 位( g s ) 、第1 1 位( y uf ) 、第2 0 位( s e ) 、 第2 4 位( f y l ) 、第2 7 位( s l ) 和第3 2 位( p l ( e ) 。功能不同的t p r 模体的序列 保守性仅限于这8 个共有氨基酸残基，特别是第8 、2 0 、2 4 、2 7 位残基的保守频率更高。 功能相似的t p r 模体除了存在这8 个保守的共有氨基酸残基外，还有一定的序列保守 性。例如，与h s p 9 0 直接相互作用的t p r 蛋白( h o p ，p p 5 ，c y p 4 0 ) 的t p r 模体中，在 8 个共有氨基酸残基旁侧仍有一些小的、疏水性的和带电荷的氨基酸残基也是保守的，它 们在介导与h s p 9 0 的相互作用中很重要【4 2 1 。t p r 模体的研究表明，t p r 模体含有约5 0 的a 螺旋，但很少有或没有b 折叠。t p r 模体二级结构是由两个反平行的a 螺旋结构域a 和b 组成。结构域a 含有共有保守残基为4 、7 、8 、1 0 和1 1 位，而结构域b 中包含第2 0 、2 4 、2 7 位残基。t p r 模体的a 螺旋规律性重复排列形成了一个右手超螺旋构象并产生一个两亲 性的沟( a m p h i p h i l i cg r o o v e ) ，许多靶蛋白可以与之互补结合。 1 3 2s g t a ( s m a l l g l u t a m i n e r i c ht e t r a t r i c o p e p t i d e ( t p r ) 一c o n t a i n i n g ， a l p h a ) 7 湖北人学硕j 卜学位论文 s g t a 属于t p r 蛋白家族，最早发现是作为一种与独立的细小病毒属h 1 或h i v - 1 的非结构蛋白相互作用的蛋白。为螺旋转角螺旋蛋白，由3 1 4 个氨基酸组成，分子量 为3 5 k d ，在大多数组织细胞中都有表达。通过免疫荧光定位，发现在细胞核与细胞质中 都有s g t a 的存在。其分子中含有三个串联重复的t p r 结构，每一个t p r 形成一个反 向平行的a 螺旋，在其c 端富含谷氨酰胺残基。在s g t a 参与的众多的生命活动中，t p r 模块发挥着主要的作用，尤其是前两个t p r 模块。目前研究表明，它作为一种共分子伴 侣在细胞周期调控、转录抑制、应激反应、蛋白质转运、r n a 剪接、蛋白质折叠中发挥 重要作用【4 3 , 4 4 , 4 5 , 4 6 】。 1 3 3s g t a 的分子结构及相关功能 s g t a 的分子结构主要有三部分组成：n 端部( 1 - 8 9 a a ) ，中心三个重复的t p r ( 9 0 1 9 2 a a ) 和c 端部( 1 9 3 3 1 4 a a ) ( 如图1 2 所示) 。相关报道表明，s g t a 具有e 3 泛素连接 酶的活性，例如，它能够与热休克同源蛋白7 0 ( h e a t s h o c kc o g n a t e p r o t e i n7 0 ，h s c 7 0 ) 的c 端相互作用【4 7 1 ，s g t a 作为一种共分子伴侣调节h s p 7 0 的活性。在己知的共分子伴侣 中，它们都可以调节伴侣复合物的活性，s g t a 在体外的活性和t p r 的空间排列上类似 于c h i p 。两个蛋白都可以微弱的抑$ 1 j a t p a s e 和h s p 7 0 的再折叠活1 生 4 8 1 。并且两个蛋白 的t p r 与h s p 7 0 的相互作用是必须的，研究表明，s g t a 严重的影n l f i j h s c 7 0 的a t p a s e 活性， 这准确的反应了h s c 7 0 的再折叠受s g t a 影响。s g t a 与h s p 7 0 的c 端调节区的t p r 受体位 点相互作用。c h i p 可能也具有同样的相互作用位点。s g t a 与c h i p 的相互关系目前不是 很清楚，c h i p 在蛋白质折叠和蛋白质降解方面发挥着关键性作用。s g t a 缺乏一个明显 的u b o x ，而c h i p 和e 4 泛素连接酶家族都具有这个结构【4 9 1 。因此s t g a 可能是c h i p 的一 个竞争性对手，通过结合h s p 7 0 相同的位点，竞争性的抑制c h i p 介导的蛋白水解作用。 另外，s g t a 可以与b 一淀粉样肽相互作用【5 0 】，通过双链r n a 抑制s g t a 的表达，发现毒性 相关的b - 淀粉样肽的表达也受到抑制。 s g t a 能够与多种蛋白相互作用，目前报道的主要有，h s p 9 0 、g r o w t hh o r m o n e r e c e p t o r ( g h r ) 、h i v 的g a g 和v p u 蛋白等【5 1 5 2 5 3 1 。在与h s p 9 0 的相互作用中，发现了 s g t a 作为t p r 家族的成员，既可以与h s p 9 0 a 互作，又可与h s p 9 0 b 互作，目前对于 s g t a 与h s p 9 0 a 的互作的生理意义并不清楚，但是在与h s p 9 0 b 的互作的研究中发现， 用g a 处理h e l a 细胞，发现二者之间的互作受到抑制，同时发现s g t a 在细胞核内的 积累明显的增多，一般情况下s g t a 是作为共分子伴侣在胞质内与h s p 9 0 结合，当细 r 1 前言 胞发生凋亡时，可以发现s g t a 与h s p 9 0 的分离，并且s g t a 在细胞核内的含量增加， 所以研究人员推测s g t a 在细胞核内的定位可能与细胞的捌亡关。在7 7 2 1 细胞内表达 s g t a 会促进该细胞的凋亡【5 4 l ，实验表明，在凋亡丌始的细胞内异常的表达s g t a ，细 胞内的d n a 碎片与细胞核破坏增强。当细胞内的s g t a 被敲除，细胞的凋亡进程明显 的减弱。所有的结果表明，s g t a 可能是一个促凋亡因子。s g t a 能够与g h r 互作参 与了泛素化系统，而泛素化系统又参与了g h r 的内化作用1 5 5 1 ，但是这并没有影响到 s g t a 与g h r 的的相互作用，说明g h r 与s g t a 的互作发生在g h r 的内化作用之前， 因此，s g t a 可能是作为一个泛素化系统的调节器，通过竞争u b e 模块来下调g h r 的 水平。s g t a 与h i v 的v p u 和g a g 蛋白也发生联系，其具体的分子机制目前还不清楚， 一般认为，v p u 可以影响g a g 的不同折叠，并且v p u 是通过改变s g t a 与h s p 7 0 的伴 侣复合物的活性来影响g a g 的折叠，总之，s g t a 参与众多的生理活动，随着研究的深 入，它的具体功能将被一一揭开。 1 4r n a 干扰 t p r 图1 - 2s g t a 的分子结构示意图 早在1 9 9 0 年进行转基因植物有关研究时偶然发现，将全长或部分基因导入植物细 胞后某些内源性基因不能表达，但这些基因的转录并无任何影响，并将这种现象称为基 因转录后沉默( p o s t t r a