（微生物学专业论文）多粘类芽孢杆菌paenibacillus+polymyxasc2+fus基因簇的克隆与分析.pdf

一 符号说明 a t p ：a d e n o s i n e5 - t r i p h o s p h a t a s e ，5 腺苷三磷酸 b p ：b a s ep a i r , 碱基 d n a ：d e o x y r i b o u n c l e i ca c i d ，脱氧核糖核苷酸 d n t p ：d e o x y r i b o u n c l e o t i d et r i p h o s p h a t e ，a t p 、g t p 、c t p 、t t p 混合物 e b ：e t h i d i u mb r o m i d e ，溴化乙锭 e d t a ：e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d ，乙二胺四乙酸 i p t g ：i s o p r o p y l 1 3dt h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e ，异丙基p d 半乳糖苷 i s r ：i n d u c e ds y s t e m i cr e s i s t a n c e ，诱导系统抗性 k b ：k i l o b a s e s ( p a i r ) ，千碱基 k d a ：k i l o d a l t o n ，千道尔顿 l b ：l u r i a - b e r t a n i ，一种基础培养基 n r p s ：n o n - r i b o s o m a lp e p t i d es y n t h e t a s e s ，非核糖体肽合成酶 o r f ：o p e nr e a d i n gf r a m e s ，开放阅读框 p c p ：p e p t i d y lc a r r i e rp r o t e i n ，肽酰载体蛋白 p c r ：p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，聚合酶链式反应 p g p r ：p l a n tg r o w t h p r o m o t i n gr h i z o b a c t e r i a , 植物根际促生细菌 p p a n t ：p h o s p h o p a n t e t h e i n e ，磷酸泛酰巯基乙胺 p p t a s e s ：p h o s p h o p a n t e t h e i n y lt r a n s f e r a s e ，磷酸泛酰巯基乙胺转移酶 s d s ：s o d i u md o d e c y ls u l f a t e ，十二烷基硫酸钠 t a i l p c r ：t h e r m a la s y m m e t r i ci n t e r l a c e dp c r , 热不对称交错p c r t b e ： i r i s - b o r i c - a c i d e d t ab u f f e r , i r i s 硼酸e d t a 缓冲液 x g a l ：5 - b r o m o - 4 一c h l o r o 一3 一i n d o l y - d - d - g a l a c t o s e ，5 溴- 4 一氯- 3 一吲哚a d 半乳糖苷 l a l ：m i c r o l i t e r , 微升 y 弋 ii i i ii i i q 5 0 0 、，i t li【 ，i i - ， _ t 7 i 。p ， 摘要1 a b s t r a c t 3 1 弓i 言6 1 1 植物根际促生细菌6 1 2 生防细菌抗菌机制7 1 2 1 产生铁载体7 1 2 2 拮抗作用8 1 2 3 植物诱导抗性15 1 2 4 空间营养竞争作用。1 6 1 2 5 重寄生作用1 7 1 3 微生物防治的优点1 8 1 4 微生物防治中生防细菌的应用1 8 1 5 非核糖体肽类生物合成机制2 0 1 5 1 非核糖体肽合成酶的结构2 0 1 5 2 非核糖体肽的一般合成过程2 1 1 5 3 芽孢杆菌脂肽抗生素合成过程2 3 1 5 4 芽抱杆菌非核糖体肽的应用前景2 8 1 6 具有生防作用的多粘类芽孢杆菌2 9 1 6 1 产生的抗菌物质3 0 1 6 2f u s a r i c i d i n 合成分子机制3 8 1 7 本研究的目的意义4 l 1 8 研究内容、技术路线及方法4 1 1 8 1 研究内容4 2 1 8 2 技术路线4 2 1 8 3 研究方法4 2 2 材料与方法4 4 2 1 菌株与质粒4 4 2 2 培养基及试剂4 4 2 2 1 培养基4 4 2 2 2d n a 提取试剂4 4 2 2 3p c r 试剂4 4 2 2 4 感受态细胞制备试剂( c a c l 2 法) 4 5 2 2 5 琼脂糖凝胶电泳试剂4 5 2 3 主要仪器设备4 5 2 4 基因组d n a 的提取4 6 2 5 琼脂糖凝胶电泳4 7 2 6d n a 浓度的确定4 7 2 7n l 冲s 基因保守区p c r 扩增4 7 2 8n i 冲s 基因保守区域侧翼序列的克隆4 8 2 8 1t a i l p c r 引物的设计4 8 2 8 2t a i l p c r 反应体系4 9 2 8 3t a i l p c r 反应条件5 0 2 9 f u s 基因簇的克隆5 0 2 1 0p c r 产物凝胶回收5 1 2 1 1d h 5 0 t 感受态细胞制备( c a c l 2 法) 5 1 2 1 2p c r 产物克隆5 2 2 。1 3 重组质粒的筛选与鉴定5 2 2 1 3 1i p t g - x g a l 筛选。5 2 2 1 3 2 菌落的快速裂解及质粒大小的检查5 3 2 1 4 序列测定5 3 2 15d n a 序列分析5 3 2 16 结构域预测5 3 2 17f u s a a 6 氨基酸残基成分分析5 4 3 结果与分析5 5 3 1 多粘类芽孢杆菌( pp o l y m y x a ) s c 2 的n r p s 基因保守区域克隆5 5 3 2n i 冲s 基因保守区侧翼序列的克隆5 5 3 3 加基因簇的克隆5 6 3 4 加基因簇序列分析5 7 3 5 f u s 基因簇组织示意图5 8 3 6 f u s a 结构域预测5 9 3 7f u s a a 6 氨基酸残基成分分析6 0 3 8 讨论6 1 4 结论6 4 4 1 结论6 4 4 2 尚待完成的工作6 4 参考文献6 5 致谢8 1 攻读学位期间发表论文情况8 2 i i ：| - r 一 - 一 山东农业大学硕士学位论文 多粘类芽孢杆菌( p a e n i b a c i l l u s p o l y m y x a ) s c 2 f u s 基因簇的克隆与分析 摘要 多粘类芽孢杆菌( p a e n i b a c i l l u s p o l y m y x a ) s c 2 是一株从辣椒根际分 离筛选的根际促生细菌，该菌株抗菌谱广，对辣椒根腐病原菌( f u s a r i u m s o l a n i ) 、黄瓜枯萎病原菌( f u s a r i u mo x y s p o r u m s p c u c u m e r i n u m ) 、黄 瓜霜霉病原菌( p s e u d o p e r o n o s p o r ac u b e n s i s ) 、芹菜灰霉病原菌( b o t r y t i s c i n e m ap e r s ) 以及西红柿灰霉病原菌( b o t r y t i sc i n e m a ) 等具有良好的拮 抗效果。 用已报道的检测非核糖体肽合成酶( n o n r i b o s o m a lp e p t i d es y n t h e t a s e s m 冲s s ) 基因保守区的兼并引物t g d 和l g g 为引物，以多粘类芽孢杆菌 ( 户p o l y m y x a ) s c 2 的基因组d n a 为模板进行p c r 扩增，获得一段长 度为4 9 7 b p 的n r p s 基因保守区序列。采用热不对称交错p c r ( t 越l p c r ) 方法，以s c 2 菌株基因组d n a 为模板，根据n r p s 基因 保守区序列，分别向两侧设计特异性引物，扩增该已知序列的两侧序列。 随后，通过多次特异性引物设计，进行t a i l p c r 。同时，根据枯草芽孢 杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) b a m c ，m y c c 、玩c 和解淀粉芽孢杆菌( b a c i l l u s a m y l o 脚u e f a c i e n s ) f z b 4 2b m y c 的同源序列，设计兼并引物进行p c r 扩 增，将得到的所有序列拼接，得到长度为1 9 8 4 4 b p 的d n a 序列。 经b l a s t 比对发现，此d n a 序列与户p o l y m y x ap k b l 中f u s 基因簇 具有很高的相似性，因此，根据户p o l y m y x ap k b l 中f u s a 基因簇与本试 验获得的d n a 序列的同源区域设计一系列兼并引物，进行特异性扩增， 最终得到一条3 2 6 8 0 b p 的d n a 序列。 将得到的总长为3 2 6 8 0 b p 的d n a 序列提交g e n b a n k ，获得序列号 为e u 4 3 l1 8 1 ，该序列包含8 个o r f ，虽p f u s 基因簇，这8 个o r f 分别为 # s g ，f u s f ，f u s e ，f u s d ，f u s c ，f u s b ，f u s a ，加陋，其核苷酸序列与多粘 类芽孢杆菌( pp o l y m y x a ) p k b1 中对应f 拘f u s g ，如f ，f u s e ，乃s d ，f u s c ， 加b ，f u s a ，f u s t e 的相似性分别为9 0 6 1 ，9 3 4 2 ，9 1 7 5 ，8 5 5 4 ， r 多粘类芽孢杆菌( p a e n i b a c i l l u sp o l y m y x a ) s c 2f u s 基因簇的克隆与分析 8 3 2 9 ，8 9 9 5 ，8 8 9 7 ，8 2 8 8 ；其衍生氨基酸序列与多粘类芽孢杆 菌( pp o l y m y x a ) p k b l 中对应的f u s g ，f u s f ，f l l s e ，f u s d ，f u s c ，f u s b ， f u s a ，f u s t e 的相似性分别9 8 7 7 ，9 9 1 5 ，9 8 2 8 ，9 0 6 4 ，9 6 3l ， 9 7 7 8 ，9 6 8 1 ，和7 6 3 5 。另外，通过n c b i b l a s t ，对f u s 基因簇 的每个o r f 进行了初步的功能分析。 ：u s a 为一个完整的2 3 7 2 7 b p 的o r f ，编码7 9 0 8 个氨基酸，对其多肽 序列进行结构域分析，结果表明，该多肽序列包含六个模块，分别为 c a t 、c a - t - e 、c a t 、c a t e 、c a 。t - e 和c a t ；六个模块中的 前五个模块的a 结构域的特异性底物分别为l t h r ，d v a l ，l z y r ，d t h r 和d a s n ，但是第六个模块中特异性底物尚不能完全确定，通过构建系 统发育树可以推测得到，多粘类芽孢杆菌( 只p o l y m y x a ) s c 2 的f u s a a 6 的结构域的特异性底物为d 砧a 。预测的氨基酸残基组成、顺序与多粘芽 孢杆菌( b a c i l l u s p o l y m y x a ) k t - 8 产生的f u s a r i c i d i nc 和多粘芽孢杆菌 ( b a c i l l u s p o l y m y x a ) l 1 1 2 9 产生的l i f 0 3 a 的第l 、2 、3 、4 、5 、6 位 上氨基酸残基组成和顺序完全一致，因此，可以初步判断pp o l y m y x as c 2 可能产生具有抗真菌活性的f u s a r i c i d i nc 。多粘类芽孢杆菌( 尸p o l y m y x a ) s c 2 的f u s a 的六个a 结构域的氨基酸序列与多粘类芽孢杆菌( 户p d 砂 m y x a ) p k b l 的f u s a 的a 1 、a 2 、a 3 、a 4 、a 5 和a 6 结构域的相似性分 别为9 4 1 3 、9 4 8 2 、9 1 5 2 、9 4 5 5 、9 5 3 4 和9 6 7 3 ；其对应的核 苷酸序列同源性分别为8 6 9 5 、8 9 0 0 、8 2 1 8 、8 9 3 8 、8 7 。3 1 和 8 9 4 9 。 关键词：多粘类芽孢杆菌，p g p r , n r p s s ，f u s 基因簇，f u s a r i c i d i n 合成 酶基因 2 ，i， p r i m e r s o ft a i l - p c r , a m p l i f i e dt h ed n as e q u e n c e s f l a n k i n g o nt h e c o n s e r v e dd n af r a g m e n tb yt h em e t h o do ft a i l p c r 、析t l lg e n o m i cd n ao f pp o l y m y x as c 2 勰t e m p l a t e s u b s e q u e n t l y , t h et a i l p c ro fu p s t r e a mo r d o w n s t r e a md n as e q u e n c e so ft h el a s ta m p l i f i e dd n af r a g m e n t sw e n c o n t i n u a l l yc a r r i e do u tf o r s e v e r a lt i m e s a l t e r n a t i v e l y ，d e p e n d i n go i lt h e i d e n t i t yo ft h en r p sg e n et ob a m c , m y c c , i t u cs e q u e n c e so fb a c i l l u ss u b t i l i s s t r a i n sa n db m y co fb a c i l l u sa m y l o l i q u e f a c i e n sf z b 4 2 ，d e g e n e r a t ep r i m e r s w e r ed e s i g n e dt oa m p l i f yt h ea i m e dd n af r a g m e n t s t h e n ，w eo b t a i n e da r e s u l t i n gd n as e q u e n c ew i t ht h el e n g t h o f19 8 4 4 b pb y a s s e m b l i n ga l l a m p l i f i e dd n af r a g m e n t s b l a s ta n a l y s i sr e v e a l e dt h eo r fi si d e n t i c a lt ot h eh o m o l o g o u s 加 g e n ec l u s t e rs e q u e n c eo fp p o l y m y x ap k b1 ，s o ，d e p e n d i n go nt h ei d e n t i t yo f t h ed n af r a g m e n t sh a so b t a i n e dt o 加g e n ec l u s t e ro fp p o l y m y x ap k b1 ， d e g e n e r a t ep r i m e r sw e r ed e s i g n e dt oa m p l i f yt h ea i m e dd n af r a g m e n t s f i n a l l y , w eo b t a i n e dar e s u l t i n gd n as e q u e n c ew i t ht h el e n g t ho f3 2 6 8 0 b pb y 3 多粘类芽孢杆菌( p a e n i b a c i l l u sp o l y m y x a ) s c 2f u s 基因簇的克隆与分析 a s s e m b l i n ga 1 1a m p l i f i e dd n af r a g m e n t s f i n a l l y , t h e 舾g e n ec l u s t e rw a sc l o n e da n ds e q u e n c e d ( t h ea c c e s s i o n n u m b e ro fg e n b a n ki se u 4 3118 1 ) ，a n di ts p a n s3 2 6 8 0b p ，i n c l u d i n g8o p e n r e a d i n gf r a m e s ( t h ef u sg e n ec l u s t e r ) ，t h e ya r ef u s af u s ef u s e , f u s d , f u s e , f u s b , f u s a ，# s t e s i m i l a r i t yo ft h e8o r f si nt h ef u s a r i c i d i nb i o s y n t h e t i cg e n e c l u s t e ro f p p o l y m y x as c 2t ot h ec o r r e s p o n d i n gg e n ef u s g , f u s p , f u s e , f u s d , f u s e , f u s b , f u s a ，f u s r eo f t h ep p o l y m y x ap k b li s9 0 6 1 ，9 3 4 2 ，9 1 7 5 ， 8 5 5 4 ，8 3 2 9 ，8 9 9 5 ，8 8 9 7 ，8 2 8 8 ，a n ds i m i l a r i t yo ft h ed e d u c e d a m i n oa c i ds e q u e n c e st of u s g ，f u s f ，f u s e ，f u s d ，f u s c ，f u s b ，f u s a ，f u s t e o f t h es t r a i np p o l y m y x ap k b li s9 8 7 7 ，9 9 1 5 ，9 8 2 8 ，9 0 6 4 ，9 6 3 1 ， 9 7 7 8 ，9 6 8 1 ，a n d7 6 3 5 ，r e s p e c t i v e l y t h e n ，w od ot h ep r i m a r ya n a l y s i s t ot h e f u sg e n ec l u s t e rb yn c b i b l a s t t h e u s ai s2 3 7 2 7b p ，e n c o d i n gas i x - m o d u l en o n r i b o s o m a lp e p t i d e s y n t h e t a s e t h ed o m a i no r g a n i z a t i o nf o r t h e s es i xm o d u l e sa r ec - a t ， c a t - e ，c - a - t ，c a t - e ， c a t - ea n dc att e ， r e s p e c t i v e l y t h e p r e d i c t e ds u b s t r a t es p e c i f i c i t i e so ft h et o pf i v ea d o m a i n sw i t h i nf u s aw e r e c o n s i s t e n t 晰mt h ef i v ea m i n oa c i d s ，l - t h r ，d v a l ，l - t y r ，d n l ra n dd a s n t h ea m i n oa c i ds u b s t r a t ef o rf u s a a 6c o u l dn o tb ep r e d i c t e db e c a u s ei t s s i g n a t u r es e q u e n c e s h o w sn o s i m i l a r i t y t oad o m a i n s 、析t ha s s i g n e d s p e c i f i c i t i e s ，i n c l u d i n gt h o s ea c t i v a t i n gl - a n dd - m a w eh a v eb u i l du pt h e p h y l o g e n e t i ct r e eo ff u s a - a 6o ft h ep p o i y m y x as c 2u s i n gt h em e g a 4 s o f t w a r e f i n a l l y ，w eh a v ep r e d i c t e dt h a tt h ea m i n oa c i ds u b s t r a t ef o rf u s a a 6 m a yb ed a l a t h ep r e d i c t e da m i n oa c i dc o m p o s i t i o na n ds e q u e n c eo ft h e 尸 p o l y m y x as c 2w a se x a c t l yc o n s i s t e n tw i t ht h ef u s a r i c i d i ncp r o d u c e db y b a c i l l u sp o l y m y x ak t 8a n dl i - f 0 3 ap r o d u c e db yb a c i l l u sp o l y m y x al - 112 9 a c c o r d i n g l y ，pp o l y m y x as c 2m a yb er e s p o n s i b l e f o rt h es y n t h e s i so f f u s a r i c i d i nc ( l i f 0 3 a ) w h i c hh a st h ea n t i f u n g a la c t i v i t y s i m i l a r i t yo ft h es i x ad o m a i n st ot h ec o r r e s p o n d i n gd o m a i na 1 ，a 2 ，a 3 ，a 4 ，a 5a n da 6o ff u s a o fp p o l y m y x ap k b la r e9 4 1 3 ，9 4 8 2 ，9 1 5 2 ，9 4 5 5 ，9 5 3 4 a n d 9 6 。7 3 ，r e s p e c t i v e l y a c c o r d i n g l y ，i d e n t i t yo ft h e i rd n as e q u e n c e sa r e 4 r 山东农业大学硕士学位论文 8 6 9 5 ，8 9 0 0 ，8 2 18 ，8 9 38 ，8 7 31 a n d8 9 4 9 w ed e d u c et h a tf u s a i sa k e yg e n ei n v o l v e di nb i o s y n t h e s i so fn o n r i b o s o m a lp e p t i d ef u s a r i c i d i nc f r o mp p o l y m y x as c 2 k e yw o r d s ：p a e n i b a c i l l u sp o l y m y x a ，p g p r , n r p s s ，f u sg e n ec l u s t e r , f u s a r i c i d i ns y n t h e t a s eg e n e 5 多粘类芽孢杆菌( p a e n i b a e i l l u sp o l y m y x a ) s c 2f u s 基因簇的克隆与分析 1 引言 植物病害是影响农业生产的主要因素之一，目前植物病害防治主要还 是采用化学方法，但由于化学药剂长期使用后，不仅杀伤天敌、引起病菌 抗性增强，还污染环境，甚至危及人们身体健康等一系列严重的问题。因 此，多年来人们一直在寻找一种能安全、有效、无污染的植物病害的防治 方法。 植物土传病害难以防治，植物根际促生菌( p l a n tg r o w t hp r o m o t i n gr h i - z o b a c t e r i a , p g p r ) 的深入研究和发展为解决这一难题展现了诱人的前景。 p g p r 能够高密度地在植物根际定殖，兼有抑制植物病原菌、根际有害微 生物，以及促进植物生长并增加作物产量的作用，更重要的是有些p g p r 能够诱导植物产生系统抗性( i n d u c e ds y s t e m i cr e s i s t a n c e ，i s r ) ，从而提高 植物整体的抗病能力。近2 0 年来，国外这一领域的研究十分活跃，已有 很多成功应用的p g p r 产品，国内应大力加强基础与应用的研究，并推 进其产业化的发展。 国内外大量研究表明，生物防治在植物病害综合防治中具有不可替代 的重要作用。利用植物根际促生细菌( p l a n tg r o w t h - = p r o m o t i n gr h i z o b a c t e r i a , p g p r ) 防治植物土传病害是生物防治的热点领域之一。 1 1 植物根际促生细菌 植物根际是指生物、化学和物理特性受到植物影响的紧密环绕植物根 的区域，它的范围是围绕根表面l 2 m m 厚的薄层土壤，是土壤微生物生活 特别旺盛的区域。这一概念首先于1 9 0 4 年由德国微生物学家l o r e n z h i l t n e r 提出，用以描述豆科植物根系与细菌的特殊关系( h a r t m a n 气 2 0 0 5 ) 。植物根际微生物多而活跃，构成了根际特有的微生物区系。 植物根际促生细菌( p l a n tg o w t h - p r o m o t i n gr h i z o b a c t e d a , 简称p g p r ) 最早由k l o e p p e r 和s c h r o t h 提出，是自由生活在根际土壤或附生于植物根 际的一类可直接或间接促进植物生长、增强植物对逆境胁迫抵抗力的微生 物。直接促生作用指植物激素等生长调节因子的产生和对植物吸收矿物质 的促进作用；间接促生作用包括通过次生代谢产物如抗生素、铁载体、 h c n 等的产生抑制或杀死有害微生物( k l o e p p e re ta t ，1 9 7 8 ；k l o e p p e re l a 1 1 9 8 9 ) 。p g p r 对土壤中有害病原微生物与非寄生性根际有害微生物 6 山东农业大学硕士学位论文 ( d e l e t e r i o u sr h i z o s p h e r em i c r o o r g a n i s m s ，简称d r m o ) 都有生防作用，对 植物吸收利用矿物质营养也有促进作用，并可以产生有益植物生长的代谢 产物，从而促进植物的生长发育( k l o e p p e re ta 1 ，19 8 0 ；s c h i p p e me ta 1 ， 1 9 8 7 ) 。p g p r 对植物的生防作用主要表现在防病和促进生长两个方面， 对病害的防治机制包括拮抗、寄生、竞争、捕食等多种方式。拮抗作用是 通过产生抗菌物质抑制病原生长或直接杀灭病原，是p g p r 用于生防作用 的主要机制之一。 1 2 生防细菌抗菌机制 植物根际促生细菌( p g p r ) 是通过不同机制协同作用来发挥其生防 作用的，包括：产生铁载体抑制病害、合成抗生素、产生各种抑制真菌的 小分子代谢物质、产生抑菌并可具诱导抗性的酶类、空间营养竞争作用等。 在保证p g p r 的正常生理及代谢功能不受改变的前提下，其生防作用也可 通过对p g p r 进行基因重组构建而提高。 1 2 1 产生铁载体 尽管铁是土壤中丰富的元素之一，但是由于土壤中的镰刀菌酸或者是 由于f e ”在自然条件下主要以难溶形式存在，土壤中的铁很难被微生物利 用( n e i l a n d s ，1 9 8 6 ) 。由于土壤中可溶性的铁浓度过低不足以维持微生物 的生长，土壤微生物分泌低分子量铁载体( 4 0 0 1 0 0 d a ) ，它与铁具有强 的亲和力( k d - - 1 0 2 0 到1 0 - 5 0 ( c a s t i g n e t t i 和s m a r r e l l i ，1 9 8 6 ) ，并且可以 将其转运到胞外受体而供微生物生长( n e i l a n d s ，1 9 8 6 ；b r i 巩1 9 9 2 ) 。 p g p r 通过产生铁载体来螯合根际大部分铁元素，真菌病原菌由于缺 乏f e 元素而无法繁殖生长( o s u l l i v a n 和o g a r a , 1 9 9 2 ) 。合成铁载体的 细菌通过胞外的特异性受体来利用f e 元素。尽管真菌病原菌也合成铁载 体，但其与铁的亲和力远低于p g p r 生防菌株产生的铁载体( s c h i p p e r s 等，1 9 8 7 ) ，因此，p g p r 生防菌株与真菌竞争铁元素而起抑菌作用。与 微生物不同，大多数植物均可在低铁浓度下生长( o s u l l i v a n 和o g a r a , 1 9 9 2 ) ，植物不会因为p g p r 引起铁元素的缺乏而受损，而且，大多数植 物具有利用铁螯合物，使铁载体释放出f e 3 + 供植物利用。 1 9 8 8 年k l o e p p e r 等首次试验证实了铁载体嗜铁素在p g p r 对土传病 害的生防中的重要作用。试验了几株属于p g p r 的荧光假单胞菌，发现只 7 多粘类芽孢杆菌( p a c n i b a c i l l u sp o l y m y x a ) s c 2i l l s 基因簇的克隆与分析 有在低铁条件下，这些菌株才能产生黄绿色的嗜铁素，并具有与产生菌相 似的抑菌作用。这种机制的依据如下：1 嗜铁素缺失突变体的抑菌活性低 于其亲本；2 由假单胞菌产生的色素对铁具有高的螯合性；3 向土壤中加 入铁的螯合物使假单胞菌的生防活性丧失；4 根围富集嗜铁素。 1 2 2 拮抗作用 拮抗微生物的拮抗作用指拮抗微生物通过分泌一种或多种拮抗物质， 作用于病原菌的细胞壁、细胞膜、蛋白质合成系统、能量代谢系统、细胞 分裂等，而直接抑制或杀死病原菌。拮抗作用是拮抗微生物防治植物病害 的一个重要机理( c o o l1 9 9 5 ) 。自然界中大多数细菌可以产生对自身或 其它微生物有抑制作用的拮抗物质，这些拮抗物质包括：毒素；溶菌 酶或蛋白酶等；缺陷型噬菌体；具有拮抗作用的初级代谢途径中的副 产物和它次生代谢产物，如氨类、有机酸、过氧化氢酶等；抗生素： 细菌素或细菌素类似物等。 1 2 2 1 芽孢杆菌( b a c i l l u ss p p ) 产生的拮抗物质 抗生素类物质：产生抗生素是芽孢杆菌( b a c i l l u ss p p ) 抗菌作用 的一个重要因素。芽孢杆菌的抗生素形成有核糖体和非核糖体合成两类， 核糖体合成的是小分子量的抗菌多肽一细菌素。非核糖体合成的抗生素包 括脂肽抗生素( 1 i p o p e p t i n ) 、多肽抗生素和次生代谢产生的其它抗菌活性 物质，如挥发性抗菌物质和脂肪氨基酸氮氧衍生物等。 脂肽抗生素：脂肽类的抗菌物质，在多数菌株中被合成，是拮抗作用 中起作用的主要成分。脂肽抗生素根据其结构上的差异分为伊枯草菌素 ( i t u r i n ) 家族( t s u g ce t 口，2 0 0 1 ；r e g m ee la 1 ，1 9 9 4 ) 、表面活性素 ( s u r f a c t i n ) ( p e y p o u x e ta 1 ，1 9 9 9 ) 和芬枯草菌素( f e n g y c i n a ，b ) ( l i n e ta 1 1 9 9 9 ；v a n i t t a n a k o me la 1 ，1 9 8 6 ) ，加上一些结构未知的环肽抗生素。 目前枯草芽孢杆菌产生的抗菌物质研究比较多的有伊枯草菌素 ( i t u r i n ) 等。伊枯草菌素是从枯草杆菌菌株培养中提取出来的一大类 脂肽类化合物，它是一类小分子环脂肽类物质，由1 个c 1 4 一c 1 7 的b 一氨 基脂肪酸链( ba a ) 与一个以稳定的手性顺序l d d l l d l 排列的7 肽 组成( f e i g e n i e rce ta l ，1 9 9 3 ) 包括i m _ d n a 、b 、c 、d 、e ，芽孢菌素 ( b a c i l l o m y c i ) d 、f 、l 以及抗霉枯草菌素( m y c o s u b t i l i n ) ( a s a k a e la 1 ， 8 山东农业大学硕士学位论文 1 9 9 6 ；d u i t m a ne ta 1 ，1 9 9 9 ) 等，他们对大多数的致病酵母和霉菌具有强烈 的抗菌能力，其中以i t u r i na 的抗菌活性最强。i t u r i na 可以从许多的枯 草芽孢杆菌的发酵液中提取出来，它的化学结构为一个c i 4 1 5 3 氨基脂肪 酸通过羧基和b 氨基与7 肽( l a s n d t y r - d a s n l g l n l p r o d a s n l s e r ) 末端基团形成内脂( 图1 1 ) ( g r a u a e ta 1 2 0 0 0 ) ， i t u r i na 具有广谱的抗真菌活性，但是对于细菌仅限于某些种类。张桂英 等( 2 0 0 4 ) 通过研究拮抗菌对甘蔗黑穗病菌拮抗作用，通过用p c r 技术， 扩增抗霉菌枯草杆菌素操纵元中m y c b 基因，发现p c r 产物和伊枯草菌素 a 合成酶操纵元中的1 t u b 基因的同源性为9 7 9 8 ，说明其抗菌作用机 制和i t u r i na 的产生有关。 图1 1 伊枯草菌素a 的结构 f i g 1 1 s t r u c t u r eo fi t u r i na 表面活性素( s u r f a c t i n ) 家族脂肽抗生素不仅是高活性的生物表面活 性剂，同时具有抗真菌、抗病毒、抗肿瘤、抗支原体活性和一定程度的抗 细菌活性( v o l l e n b r o i c he t a l ，1 9 9 7 a ；k r a c h te t a l ，1 9 9 9 ；k a m e d a e t a l ，1 9 7 2 ； v o l l e n b r o i c he ta 1 ，19 9 7 b ；b e m h e i m e re ta 1 ，19 7 0 ；t s u k a g o s h ie ta 1 ，19 7 0 ) ， 包括枯草芽孢杆菌( b s u b t i l i s ) 产生的s u r f a c t i n 、e s p e r i n s 和地衣芽胞杆菌 ( b 1 i c h e n i f o r m i s ) 产生的s u r f a c t a n t8 6 、l i c h e n y s i n a d ( k o n ze ta i ，1 9 9 9 ) ， 结构特点为一个c 1 3 1 5 3 羟基脂肪酸通过p 羟基和羧基与7 肽 ( g l x l e u d l e u v a l a s p ( a s n ) d l e u l e u ( 1 e 或v a l ) ) 末端基团形成 内脂( 图1 2 ) 。它的作用机制为，它能够与细胞膜上的磷脂( p h o s p h o l i p i d s ) 互作，引起离子通道的形成( s h e p p a r de la 1 ，1 9 9 1 ) ，螯合一、二价阳离 子( o s m a ne ta 1 ，1 9 9 9 ) 从而抑制多种酶类如环磷酸腺苷化磷酸二酯酶 ( c a m pp h o s p h o d i e s t e r a s e ) ( h o s o n oe ta 1 ，1 9 8 3 ) 和胞质p l a 2 ( k