（微生物学专业论文）地衣芽孢杆菌普鲁兰酶编码基因的克隆与表达.pdf

摘要 摘要 普鲁兰酶( ec 3 2 1 4 1 ) 是一种能够专一性切开支链淀粉分支中的q 1 ，6 糖菅键，从 而剪下整个侧支，形成支链淀粉的解支酶。它在淀粉加工工业中有着非常重要的用 途，可以大规模的提高淀粉的利用率和生产效率。普鲁兰酶可以单独使用，亦可以与 其它酶配合使用，当前较成熟地应用于高葡糖浆，高麦芽糖浆和干啤酒生产中。普鲁 兰酶的水解性质决定了它具有提高淀粉质原料利用率、降低粮耗的作用，因此它在淀 粉加工工业中有着重要的用途和良好的市场前景。地衣芽孢杆菌的全基因组序列已在 2 0 0 4 年被公布，对基因组序列分析显示，其中有一段大小为2 1 3 3b p 的片段可能编码 普鲁兰酶基因，并被标注为a m y x 多年来，地衣芽孢杆菌作为外源基因表达宿主被用于 包括普鲁兰酶在内的多种外源蛋白的表达，但有关地衣芽孢杆菌自身产生的普鲁兰酶 及其基因则国内外均未见实验研究报道。 本论文以p c r 方法从地衣芽孢杆菌染色体d n a 中扩增出a m y x 基因蛋白编码 区，插入大肠杆菌表达载体p e t 2 8 a t 7 启动子下游。经普鲁兰酶活性检测、s d s p a g e 及大肠基因组d n a 的p c r 扩增分析表明，普鲁兰酶基因在b l 2 l ( d e 3 ) d p 得到了正确 的表达。在实验室发酵时，检测到的酶活大约为5 6u m l 。重组工程菌连续转接5 代 后，经接种培养、诱导发酵及p c r 反应鉴定表明具有良好的遗传稳定性。 重组菌所产的普鲁兰酶分子量约为8 0 k d 左右；重组酶的最适作用温度范围为3 5 - - 4 5 ，在p h6 0 条件下，3 0 - 5 0 之间酶活性变化不大；最适作用p h 范围为 5 5 6 5 ，在温度为4 0 时，有较广泛的p h 稳定范围，p h 为5 0 - - - 7 0 范围内，该酶 都具有较高的活性；该酶具有很好的热稳定性，4 0 保温6 4h 仍有4 0 的残余酶活。 该酶反应不需要金属离子的参与，但是很多离子如a g 十、c u 2 + 、z n 2 十、c 0 2 + 、m n 2 + 、 f e p 、c d 2 + 和p b 2 + 对该酶有不同程度的抑制作用；添加m 9 2 + 和c e + 对酶活性有不同程 度的促进作用；而添加c 、n a 十、l i + 、n i 2 + 和b a 2 + 对该酶无明显的激活或抑制作用； 5 1 0 。m o l l 的s d s 使酶完全失活，这可能是由于该普鲁兰酶分子中缺乏二硫桥结构的 缘故。 对重组菌的发酵条件进行了初步优化，采取了单因素试验分别考察了不同的氮 源、诱导时机、培养温度、初始p h 、装液量、接种量对产酶的影响。得到了产酶的最 佳培养基：酵母膏l ，蛋白胨1 ，n a c i1 ，k 2 h p 0 4 0 0 1 7 ，m g s 0 4 - 7 h 2 0 0 0 1 2 ，m n s 0 4 7 h ：oo 0 1 2 ；产酶的最佳培养条件：培养3 h 后诱导，培养温度为2 0 ，培养基的p h 值为6 0 ，装液量为2 5 0m l 摇瓶加入培养基2 0m l ，接种量1 0 。 通过优化后酶活提高到6 5u m l 左右。 以上结果表明，本研究构建的基因工程菌能够表达普鲁兰酶，实验室摇瓶发酵 时，酶活约为5 6 u m l ；其粗酶的酶学性质得到了初步研究；通过对发酵条件进行优 化，最佳发酵条件的普鲁兰酶产量平均可达到( 6 5 士o 1 ) u m l 。因此，该株工程菌所 产的普兰酶为普鲁兰酶酶制剂的工业化生产及应用奠定了一定的基础。 关键词：普鲁兰酶，地衣芽孢杆菌，a m y x , 酶学性质，发酵条件优化 a b s t r a c t a b s t r a c t p u l l u l a n a s e ( p u l l u l a n a s e - 6 - g l u c a n o h y d r o l a s e ，e c 3 2 1 41 ) i su s u a l l yc o n s i d e r e da d e b r a n c h i n ge n z y m et h a ts p e c i f i c a l l yc l e a v e sa 一1 ，6g l y c o s i d i cl i n k a g e si np u l l u l a n ，s t a r c h ， a m y l o p e c t i n ，a n dr e l a t e do l i g o s a c c h a r i d e s t h ee n z y m ei sw i d e l yu s e di ns t a r c h - p r o c e s s i n g i n d u s t r y , b e c a u s ei tc a np r o m o t et h eu t i l i t ye f f i c i e n c ya n dp r o d u c t i v i t yo fs t a r c h o na l a r g e s c a l e t h em o s ti m p o r t a n ti n d u s t r i a la p p l i c a t i o no fp u l l u l a n a s ei su s e di nc o m b i n a t i o n 埘t hg l u c o a m y l a s eo ri b - a m y l a s e ，r e s p e c t i v e l y , i nt h es a c c h a r i f i c a t i o np r o c e s s ，a n di t sf u l l b l o w na p p l i c a t i o ni su s e df o rt h ep r o d u c t i o no fd e x t r o s e ，h i g l l - m a l t o s es y r u p sa n db e e rf r o m s t a r c hh y d r o l y a s e s p u l l u l a n a s ec a ni m p r o v et h eu t i l i z a t i o nr a t eo fs t a r c hm a t e r i a l ，d e c r e a s e t h ec o n s u m p t i o nf o ri t sh y d r o l y z i n gc h a r a c t e ra n dt h i sm a k ei tv e r yi m p o r t a n ta n dp r o m i s i n g i nt h ei n d u s t r y a n a l y s i so ft h ec o m p l e t eg e n o m es e q u e n c eo fb a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s ，w h i c h h a sb e e np u b l i s h e di n2 0 0 4 ，r e v e a l e dap u t a t i v ep u l l u l a n a s eg e n ew h i c hw a s213 3b pa n d a n n o t a t e da sa m y x f o rm a n yy e a r s b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i sa sah o s tf o rh e t e r o l o g o u sg e n e e x p r e s s i o nw a su s e d f o re x p r e s s i n g v a r i e t yh e t e r o l o g o u sp r o t e i ni n c l u d i n gp u l l u l a n s e h o w e v e r ，t h e r ei sn or e p o r to nt h es t u d yo fp u l l u l a n a s ea n d i t sg e n eo fb a c i l l u sl i c h e n i f c i r m i s i nd o m e s t i ca n do v e r s e a s i nt h i sr e s e a r c hp a p e lt h ec o d i n gr e g i o no fa m y xg e n ew a sa m p l i f i e df r o mg e n o m ed n a o fb 1 i c h e n i f o r m i sb yp c ra n di n s e r t e di n t ot h ed o w n s t r e a mo ft 7p r o m o t e ro ft h ee x p r e s s i o n v e c t o rp e t 2 8 a 1 1 1 ep o s i t i v et r a n s f o r m a n t sw e r ec h a r a c t e r i z e db yp u l l u l a n a s ea c t i v i t y d e t e r m i n a t i o n ，s d s p a g e ，a n dp c ra m p l i f i c a t i o na g a i n s te c o l it o t a ld n a i td e m o n s t r a t e d t h a tg e n eo f p u l l u l a n s eg o tp r o p e re x p r e s s i o ni ne c o l i t h et r a n s f o r m a n t sn a m e db l 21 ( p e t - 2 8 a - b i p ) s e c r e t e dr e c o m b i n a n tp u l l u l a n a s e ，w h i c hh a dt h ea c t i v i t y o f5 6u m l t h e e x p e r i m e n to ff e r m e n t a t i o na n dp c r m e t h o ds h o w e dt h a tb l 21 ( p e t - 2 8 a - b 硝h a dag o o d g e n e t i cs t a b i l i t y t h em o l e c u l a rw e i g h to ft h ep u l l u l a n a s ew a sa b o u t8 0k d t h eo p t i m u mr e a c t i o n t e m p e r a t u r ea n dp hr a n gf o rt h ee n z y m ea c t i v i t yw a sf o u n dt ob ef r o m3 5t o4 5d e g r e e sca n d f r o mp h5 5t o6 5 ，r e s p e c t i v e l y f u r t h e r m o r e ，t h ep u l l u l a n a s ee x h i b i t e das t a b l ea c t i v i t yu n d e r a b r o a dp hf r o m5t o7a t4 0d e g r e e s c ，as t a b l ea c t i v i t yb e t w e e n3 5a n d5 5d e g r e e sca tp h 6 0 ，a n dg o o dt h e r m o s t a b i l i t y , w h i c hh a dar e s i d u a la c t i v t i t ya f t e r6 4h o u r sa sm e a s u r e da t4 0 d e g r e e sca n dp h6 0o f4 0p e r c e n t m e t a li o n sw e r en e e d l e s si n t h ee n z y m a t i cr e a c t i o n ， h o w e v e r , t h ep u l l u l a n a s ea c t i v i t yw a si n h i b i t e dm o r eo rl e s sb yt h ea d d i t i o no fs o m ei o n ss u c h a sa g + 、c u 2 + 、z n 2 + 、c 0 2 + 、m n 2 + 、f e 2 + 、c d 2 + a n dp b 2 + ，w a si m p r o v e db yt h ea d d i t i o no f m 9 2 + a n dc a 2 + a n dw a ss l i g h t l ya f f e c t e db yt h ea d d i t i o no fk + 、n a + 、l i + 、n i 2 十a n db a 2 + i n a d d i t i o n ，m a yb eb e c a u s et h a tt h ep u l l u l a n s em o l e c u l a rh a dl e s sd i s u l f i d e b o n d ，t h ea d d i t i o no f s d s ( 5 10 3 m o l l ) i n h i b i t e dt h ee n z y m ea c t i v i t ya b s o l u t e l y t h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so fr e c o m b i n a n tw e r eo p t i m i z e d a n l y s i st h ee f f e c to f n i t r o g e n s o u r c e ，i n d u c t i o n t i m e ，t e m p e r a t u r e ，p h ，b r o t ha m o u n ta n di n o c u l a t i o na m o u n t o nt h ee x p r e s s i o no fp u l l u l a n a s e t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h eo p t i m u mc u l t u r em e d i u m ： y e a s t e x t r a c t 1 ，p e p t o n e1 ，n a c il ，k 2 h p 0 4o 0 1 7 ，m g s 0 4 7 h 2 00 0 1 2 ， m n s 0 4 7 h 2 00 012 ：t h eo p t i m u mc o n d t i o n s ：i n d u c t i o na f t e rc u l t i v a t i o nf o r3h o u r s ， c u l t i v a t e dt e m p e r a t u r ea n dp hr e s p e c t i v e l yw a s2 0d e g r e e sca n dp h6 0 v o l u m eo fm e d i u m 竺墅坠 2 0 m l 2 5 0 m l ，a n d10 o fi n o c u l u ms i z e u n d e rt h eo p t i m 啪c o n d i t i o l l ss 1 1 0 wt 1 1 a t t 1 1 e a c t i v i t yo ft h er e c o m b i n a n tp u l l u l a n a s ew a s u pt oa b o u t6 5u 札 a e c o r d i n gt oa b o v e ，t h ey i e l do ft h ep u l l u l a n a s ef r o mt h e r ec o m b i l l a n te ，fw 笛 6 u m l ；e z y m ep r o p e r t i e so ft h ec r u d e e n z y m ew e r es t u d i e d ；b yo p t i m i z a l i o n0 f f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n ss h o wt h a tt h ea v e r a g e p u l l u l a n a s ea c t i v i t yw a s ( 6 5 士0 1 ) u m l is o t h er e c o m b i n a n tp u l l u l a n a s eh a dw i d ef o r e g r o u n di ni n d u s t i a l p 删u c t i o n 锄du t i l i 2 a t i o n ! 叩o a s ：b a c i l l u sl i c h e 刀i f o r m i s , m l u l a n a s e ，a m y x , , e n z y m ep r o p e r t i e s ，o p t i m i z i n go f i e n n e n t a t i o nc o n d i t i o n s 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是拳人在导师指导- f 进, f - i - 的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 签名： 魄蛆蕊 日 期： 塑。g ：左 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件争磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签 名：敬圈越 导师签名： 日期： 第一章绪论 第一章绪论 1 1 概述 淀粉是由葡萄糖通过a - l , 4 葡萄糖苷键构成的直链淀粉和a - 1 ，6 位有分支的支链淀 粉组成的混合物。淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的统称，广泛存在于动物、植物和微 生物中，它最早实现了工业化生产并且是迄今为止用途最广、产量最大的一个酶制剂 品种1 1 1 。表1 1 列出了几种在工业生产中常见的淀粉酶类别。 表1 1 几种常见的淀粉酶类1 3 】 t a b 1 一is e v e r a ln o r m a lk i n d so f a m y l o l y t i ce n z y m e 由于受到种种因素的影响，在以上几种淀粉酶中，解支酶的生产应用规模较小【3 】。 而工业用大部分淀粉质原料含有7 5 - 8 5 的支链淀粉，支链淀粉不能被分解则影响 到淀粉的利用率。支链淀粉是由若干个a 1 ，4 葡萄糖链由a - l ，6 糖苷键结合而成的高度 分支的多糖，它每隔2 0 - - 2 5 个葡萄糖单位就有一个支链点，所以支链淀粉含4 5 的t , 1 ，6 糖苷键。为改善淀粉酶对淀粉的作用效果，提高淀粉利用率，世界各国为了降 低生产成本，提高效益，纷纷投入大量的人力、财力研究开发解支酶。直链淀粉和支 链淀粉及其结构如图1 1 所示。 江南大学硕士学位论文 图1 - 1 直链淀粉( 1 ) 和支链淀粉( 2 ) 及其结构示意图 f i g 1 1t h es t r u c t u r eo f a m y l a s e ( 1 ) a n df r a g m e n to f t h es t r u c t u r eo f a m y l o p e c t i n ( 2 ) ( t h el e n g t ho f c h a i n saa n dbi n2 v a r i e s ) 能够分解淀粉中a 1 ，6 葡萄糖苷键的酶，通称为解支酶( 淀粉脱支酶，d e b r a n c h i n g e n z y m e ) ，如寡- l ，6 - 葡萄糖苷酶( e c 3 2 1 1 0 ，o l i g o - 1 ，6 g l u c o s i d a s e ) 、普鲁兰酶( e c 3 2 1 4 1 ，p u l l u l a n a s e ) ，异淀粉酶( e c3 2 1 6 8 ，i s o a m y l a s e ) 、支链淀粉6 葡聚糖水解酶 ( e c 3 2 1 6 9 ，a m y l o p e c t i n - 6 - g l u c a n o h y d r a s e ) 以及植物来源的r 酶”( 植物支链淀粉脱支 酶，a m y l o p e c t i nd e b r a n c h i n ge n z y m e ) 等。解支酶来源不同，性质上也会有较大差别。 其中，普鲁兰酶是种能够专一性切开支链淀粉分支点中的a 1 ，6 糖苷键，从而剪下整 个侧支，形成直链淀粉的解支酶【4 】。它可以将最小单位的支链分解，最大限度地利用淀 粉原料，因此是一种工业上有重要应用价值和需求量大的酶类。由于人们最初注意到 这种酶能水解普鲁兰糖的a 1 ，6 糖苷键，故称普鲁兰酶【3 】。 普鲁兰糖( p u l l u l a n ) 是由a 1 ，6 键连接的麦芽三糖单元构成的线性多糖。微生物来源 的普鲁兰酶能够分解普鲁兰多糖，它的最小作用底物是6 2 麦芽糖基麦芽糖。普鲁兰酶 作用于普鲁兰糖的机制如图1 2 所示i l 】 图1 - 2 普鲁兰酶作用普鲁兰糖机制 f i g 1 - 2a c t i o np a _ t t e mo fp u l l u l a n a s eo np u l l u l a n 虽然热力作用能促进水解的发生，但并非淀粉、糖原和糊精中所有仅1 ，6 糖苷键都 能被该酶水解，水解发生的基本条件是，在c 【1 ，6 糖苷键的两端至少有2 个1 ，4 糖苷键 2 第一章绪论 相连的d 一葡萄糖1 5 , 6 1 。另外，w a l l e n f e l s 通过纸层析发现，普鲁兰酶作用普鲁兰糖除产 生麦芽三糖、麦芽二糖基麦芽三糖外，还产生麦芽四糖和麦芽三糖基麦芽三糖等1 7 j 。国 外学者对普鲁兰酶深入研究后，进一步将该酶细分为四大类，相互之间的水解特性有 所不同1 8 】。 普鲁兰酶能专性地催化断裂支链淀粉中的a 1 ，6 糖苷键的性质决定了它在改善淀 粉酶对淀粉的作用效果、提高淀粉利用率、降低粮耗、提高产品质量及开发新的产品 方面有着相当巨大的价值，在淀粉加工工业中有着重要的用途和良好的市场前景。此 外，由于目前淀粉原料加工过程中所用的淀粉水解酶作用条件的差异，淀粉的水解必 须分步进行。淀粉制糖的酶法水解工艺分为液化和糖化两个步骤，液化过程采用中性 q 淀粉酶在9 0 - 1 0 5 。c 高温下进行，糖化过程采用酸性糖化酶在5 5 c 一- - 6 0 c 条件下进 行。目前世界上以酶法( 仅淀粉酶和糖化酶) 生产淀粉糖的最高转化率d e 值为9 6 ，是 酶法生产工艺的一个极限数值。这是因为糖化酶对淀粉中的0 【1 ，6 糖苷键作用力较弱， 从而影响淀粉的最终水解度。降低淀粉浆浓度或者增加糖化酶的剂量，在理论上可以 突破这个极限，但前者大大增加了生产负荷、提高了成本，后者能够诱发葡萄糖的聚 合反应，生成异麦芽糖，影响最终收率。一种有效的改进工艺是在淀粉制糖糖化过程 中添加普鲁兰酶，水解残余的a 1 ，6 糖苷键，则可使d e 值提高至9 7 以上【3 ，4 1 。由于糖 化酶作用p h 较低( p h4 5 - - 一5 o ) ，作用温度较高( 5 5 。c 6 0 c ) ，在淀粉制糖工业中与糖 化酶配合使用的普鲁兰酶如能具有相似的作用p h 和作用温度范围，则能大大开拓其市 场。 1 2 普鲁兰酶的国内外研究概况和发展趋势 1 2 1 普鲁兰酶的主要生产菌种 普鲁兰酶最初是由b e n d e r 和w a l l e n f e l s 于19 6 1 年通过产气气杆菌a e r o b a c t e r a e r o g e n e s ( 典型菌为肺炎克雷伯氏杆菌) 发酵获得，他们报道了该酶良好的酶学性能( 酶 作用最适p h5 5 - - 一6 0 ，最适温度为5 0 c ) f 9 j 。之后，各国的科研人员经过广泛深入的研 究，从不同地区的微生物中获得该酶，掀起了开发普鲁兰酶的高潮。 日本的y o s h i y u k i t a k a s a k i 于19 7 5 年发现蜡状芽苞杆菌覃状变种( b a c i l l u sc e r e u s 阳，彬弦d 姚s ) 可同时产生两种淀粉酶：p 淀粉酶和普鲁兰酶i l o i 。最适作用条件为p h6 o 6 5 ，温度5 0 ，最大转化率( 淀粉水解产生麦芽糖) 大约为9 5 。酶学研究中发现，此 酶在p h5 0 ，温度6 0 。c 依然保持大部分活性。工艺条件的研究发现氮源对产酶有很大 的影响。没有有机氮源，菌种生长非常贫瘠，蛋白胨、牛肉浸膏、酪蛋白都是较为理 想的氮源。摇瓶培养时，普鲁兰酶的产量随着氮源( 牛肉浸膏和蛋白胨) 浓度的增加而增 加。通过对比不同的碳源发现，淀粉、糊精、麦糖和葡萄糖都是十分有效的碳源，而 蔗糖则不能被利用产酶。随着碳源浓度的增加，普鲁兰酶产量亦呈现增加趋势。此外金 属离子对产酶有重要作用，c a 2 + 和b a 2 + 能有效地促进b 淀粉酶的产生，m n 2 + 有效地促 江南大学硕士学位论文 进普鲁兰酶的产生。但严重抑制p 淀粉酶的产生。c 0 2 + 、z n 2 + 、f e 2 + 、m 9 2 + 和s r 2 + 对产 酶无影响。 八十年代初，丹麦n o v o n o r d i s k 公司获得嗜酸性分解普鲁兰多糖芽苞杆菌( b a c i l l u s a c i d o p u l l u l y t l c u s ) 。该公司经过投入巨资开发研究，于1 9 8 3 年在日本和欧洲市场同时商 业化销售，商品名为p r o m o z y m e 。该普鲁兰酶有p r o m o z y m e2 0 0 l ( 2 0 0p u n g ) 和 p r o m o z y m e6 0 0 l ( 6 0 0p u n m l ) ，酶活是在温度为4 0 ，p h5 0 时测定的。温度对酶 活的影响为p h5 o 时，6 0 时酶活最大，4 5 和6 8 时活力仍为6 0 的二分之一， 2 0 时相对酶活小于2 0 ；p h 对酶活的影响为温度6 0 时，p h5 o 左右酶活最大， p h4 0 和p h6 0 时酶活降至5 0 以下，p h3 3 时酶活接近o ；在6 0 ，p h4 5 5 5 时，7 2 h 后仍可以保留5 0 - 6 5 的酶活。n o v o 公司的p r o m o z y m e 占领了中国乃至世 界的大部分市场份额，如今，它是应用的最广、产量最大的普鲁兰酣，- 2 1 。 1 9 8 6 年，日本的y o s h i y u k it a k a s a k i 报道了一株能产生耐热、耐酸普鲁兰酶的枯草 芽苞杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) ，被命名为b a c i l l us s u b t i l i st u 。此菌种所产生的为普鲁兰酶 和淀粉酶的混合酶，可水解淀粉为麦芽三糖和麦芽糖，水解普鲁兰搪为麦芽三糖。其 中普鲁兰酶最适作用温度为6 0 ，最适作用p h 为7 0 - - 7 5 ，但在p h 5 0 时亦有约5 0 的酶活【l 引。 1 9 8 7 年，德国的e m a d i 和g a n t r a n i k i a n 等报道了一株能同时产a 一淀粉酶、普鲁 兰酶和葡萄糖淀粉酶的菌种：耐热产硫梭菌( c l o s t r i d i u mt h e r m o s u l f u r o g e n e s ) 。该菌种所 产普鲁兰酶最适反应温度为7 0 。c , - - , 7 5 c ，最适作用p h 为4 9 - 5 2 t 1 4 】。事实上，早在 1 9 8 5 年，美国威斯康星大学的h h h y u n 和密歇根州立大学的j g z e i k u s 就有过此菌种 的报道，他们深入研究了通过此菌和c l o s t r i d i u mt h e r m o h y d r o s u l f u r i c u m 同培养以提高 酶产量的机理。 其实，产普鲁兰酶的菌种还有很多，像中间埃希氏杆菌e s c h e r i c h i ai n t e r m e d i a ，缓 和链球菌s t r e p t o c o c c u sm # i s 以及链霉s t r e p t o m y c e s s p 等1 1 , 3 j 。 还有报道称筛选到的碱性普鲁兰酶，酶能够在p h6 o 1 1 0 有稳定的酶活。在碱性 条件下能专一性的水解茁霉多糖、淀粉、糖原、支链淀粉和相应低聚糖中的q 1 ，6 键。 碱性普鲁兰酶是洗涤剂的有效添加剂。对于碱性普鲁兰酶的研究是从1 9 9 2 年a r a 和 i g a r a s h i l l 2 】发现以来开始的，国内仅有马晓军等人报道筛选到一株稳定的耐热碱性普鲁 兰酶生产菌株芽孢杆菌b a c i l l u s s p s x 1 2 c 6 7 1 b j 。 近年来人们开始从不同来源的基质中筛选产普鲁兰酶的菌株，筛选到了各种类型 的菌株，包括各种芽孢杆菌如：b a c i l l u ss pk s m l 8 7 6 1 1 6 j ，b a c i l l u ss ps 1 【1 7 l ，丑 历口卯阳拧s l l 8 1 ，b a c i l l u sa c i d o p u l l u l y t i c u s l l 9 1a n db a c i l l u ss p t 2 0 1 ，以及产耐热普鲁兰酶的菌株 t h e r m o p h i l i c ， b a c i l l u ss pa n 7 等，特别是耐热酶的筛选越来越受到人们的关注。如 b a c i l l u ss t e a r o t h e r m o p h i l u s ，c l o s t r i d i u mt h e r m o s u l f u r o g e n e s ，c l o s t r i d i u mt h e r m o c e l l u m ， d e s u l f u r o c o c c u sm u c o s u s ，f e r v i d o b a c t e r i u mp e n n a v o r a n s ，p y r o c o c c u sf u r i o s u s ，p y r o c o c c u s w o e s e i ，t h e r m o a n a e r o b a c t e rs p ，t h e r m o c o c c u s a g g r e g a n s ，t h e r m o c o c c u s c e l e r , t h e r m o c o c c u sg u a y m a g e n s i s ，t h e r m o c o c c u sp r o f u n d u s ，t h e r m o c o c c u s h y d r o t h e r m a l i s ， t h e r m o c o c c u sl # o r a l 括i 2 l j 等等。但是这些嗜热菌的最适温度达到1 0 0 ，对于发酵工艺 第一章绪论 非常困难，而且太多数酶是胞内酶，不分泌到细胞外。所以直接采用这些菌株生产普 鲁兰酶的工业化困难狠大t 人们试图用细胞固定化技术解决这一问题。l ( 1 i n g e b 叼。捌 等人报道，将不同厌氧菌用海藻酸凝胶固定，胞外酶的比活力显著提高，而且海藻酸 是安全的产品可以用于食品工业，但目前还是处于探索阶段。所以随着重组基因技术 的发展深入摹因工程手段就越来越引起人们的关注。 1 2 2 普鲁兰酶的分子结构 至今为止，关于普鲁兰酶的晶体结构( 见图1 3 ) 报道卟是很多，但是在根据序列相 似性对糖苷酶水解键水解酶的分类，判断昔鲁兰酶属于q 淀粉酶第1 3 家族，这个家族 巾包含了3 0 多种酶，可以分为水解酶、转移酶、异构酶三大类。这些酶能够水解和合 成n l ，4 、q l ，6 、一l ，2 巾l ，3 m 1 ，5 、a l ，1 糖昔键，其中很多酶的结构已经被报道，他 们都采取了( p 血) 8 的结构，通过生物信息学的研究表明，这个家族的蛋白质都有一 个共同的结构，即酶的活性中心都足o a ) 8 折叠简的结构，命名为结构域a 。第1 3 家族的大多数酶还具有结构域b ，它是位于( 1 3 t e ) s 折叠筒中，足第= 个b 片层与第三 个。螺旋之间的一段序列，其特点是结构和长度差异较大推测其功能是与底物的结 合有关。在紧接着( b 位) 8 折叠筒后，还有结构域c ，紧接着结构域c ，部分家族成员 还有结构域d 。 髯 ， 、￥， 圃1 3 普鲁兰酶的晶体结构i 。i f i 9 1 - 3 t h e t h t c e “i m e n s i o n a ls m e so f p u l l u l a n a s e 1 2 3 基因工程技术在普鲁兰酶研究领域的应用 从上世纪八十年代起，基因工程技术逐渐应用于普鲁兰酶的研究与开发中。1 9 8 4 年，日本科学家利用r p 4 ：m u c t s 把k l e b s i e l l a a e r o g e n e s 中的普鲁兰酶基因体内转移入 太肠杆菌并在其中得以有效表达，但此大肠肝菌的酶活水平不高且在非选择性培养基 中表现型极不稳定。1 9 8 5 年t a k i z a w a 通过把普鲁兰酶基凼( 包括结构基因和操纵基因1 克隆入多拷贝载体p b r 3 2 2 ，得到比野生菌株酶活水平高2 0 4 0 倍的工程菌，此工程菌 江南大学硕士学位论文 能保持高酶水平二周。在上述研究中，大部分的酶都是胞内的，不分泌到胞外，而 k l e b s i e l l aa e r o g e n e s 则往往在细胞表面积聚普鲁兰酶，这种现象是工业生产中所不需要 的。19 9 9 年，t e a g u e w m a r t i n 等人从b a c i l l u sn a g a n o e n s 捃( a t c c5 3 9 0 9 ) ( u s p t0 6 ，3 0 0 ， 1 1 5 ) 中分离出了普鲁兰酶基因，并在原核生物表达系统枯草芽苞杆菌中得到了表达， 所产生的重组普鲁兰酶具有很好的应用特性。该酶在6 0 c 时测得最适反应p h 为 5 0 1 ，在p h4 5 条件下测得最适温度为6 2 5 ；在p h4 5 ，6 0 保温5 5h 后仍有5 0 的 残余酶活，具有较好的热稳定性【2 4 ，2 5 1 。自此以后许多普鲁兰酶基因得到了克隆和表 达。特别是进入九十年代后，这些工作进展速度大大加快，相继有许多耐热普鲁兰酶 基因，特别是上述高温菌的普鲁兰酶基因被克隆、测序、在大肠和枯草杆菌中表达， 并申请专利保护。但真正形成产业化的还并不多见。用于克隆和表达普鲁兰酶基因的 微生物见表1 2 。 表i - 2 用于克隆和表达普鲁兰酶基因的微生物 t a b 1 - 2m i c r o b i a ls o u r c e sf o rc l o n i n ga n de x p r e s s i o no f t h ep u l l u l a n a s eg e n e s o r i g i no ft h ec l o n e dp u l l u l a n a s eg e n e e x p r e s s i o ns y s t e m r e f e r e n c e b a c i l l u sn a g a n o e n s i s i z 刈 b a c i l l u ss u b t i l u s18 d e s 诅矗讲d c d i c c 略m u c o s u s 2 6 1 b a c i l l u s 口c 洳州蛐檐甜【2 7 】一 b a c i l l u sd e r a r a i f i c a n s l 2 7 1 冗忍d ( 幻砌p 溯淞聊口砌搬【2 7 】一 j 咕p 五比z d 刀l o 明傩a r a y l o d e r a n o s a l 2 7 1 b a c i l l u ss t e a r o t h e r m o p h i l u s 2 s b a c i l l u ss u b t i l u s 搿e b s 祧抖 一 t h e r m o p f i l i ct h e r m u s 3 0 1 e s c h e r i c h i ac o l i e y r o c a c c u sw o e s e p o l e s c h e r i c h i ac o l i c l o s r i d i u mt h e r m o h y d r o s u l 胁c u m 3 2 1 e s c h e r i c h i ac o l i b a c i l l u ss t e a r o t h e r m o p h i l u st r si2 8 3 3 】 b a c i l l u ss u b t i l u s 砀p m ，埘a m d 3 3 【3 4 】 e s c h e r i c h i ac o i l & b a c i l l u ss u b t i l u s 刀j e 聊l d 口，置r d 6 f 玉册6 ，剧3 5 1 e s c h e r i c h i ac o l i & b a c i l l u ss u b t i l u s b a c i l l u ss pk s m l 3 7 8 | 3 6 1 b a c i l l u ss u b t i l u s 从以上这些报道中可以看出，目前关于基因工程技术在普鲁兰酶研究领域的探索 还是有很多，这证实了利用基因工程手段来提高普鲁兰酶表达的有效性。但至今国内 还没有从微生物中克隆出普鲁兰酶基因，构建基因工程体系，得到新普鲁兰酶的报道 【1 5 】 o 综上所述，从目前普鲁兰酶的应用和研究现状来看，以后研究和发展的方向主要有 三个方面： 6 侈加加加加殂勉孔笱弱卯 勰 凹 第一章绪论 ( 1 ) 通过基因工程手段构建基因工程菌，迸一步提高酶的产量和活性，降低生产成 本，真正实现该酶产业化； ( 2 ) 利用定点突变技术进一步提高其应用特性，如改变其对底物的亲和性、p h 适性 和耐热特性等； ( 3 ) 从应用上来看，目前普鲁兰酶主要应用于以淀粉为原料的食品等工业部门，特 别是在淀粉糖和酿造行业中应用广泛，因此高活性液体普鲁兰酶的开发和应用将具有 巨大的市场。 1 3 普鲁兰酶的应用1 1 , 3 1 由于普鲁兰酶能够专一性地切开支链淀粉分支点中的a 1 ，6 糖苷键，从而剪下整个 侧支，形成直链淀粉，故最早被应于淀粉、糖原及其它有关化合物细微分子结构的理 论研究。近年来，普鲁兰酶己作为淀粉解支酶类中的一个新酶种，应用于以淀粉为原 料的食品等工业部门，大规模地提高了淀粉的利用率和生产效率。普鲁兰酶可以单独 使用，亦可与其它酶配合使用，相辅相成收到良好的效果。 它的应用主要表现在以下几个方面： ( 1 ) 单独使用普鲁兰酶，使支链淀粉变为直链淀粉 直链淀粉具有凝结成块、易形成结构稳定的凝胶的特性。因此，可作为强韧的食 品包装薄膜。这种薄膜对氧和油脂有良好的隔绝性，又因涂布开展性好，故适合于作 为食品的保护层。其醋酸衍生物又可作为纺织纤维，还用于浆纱、纤维上光以及作为 胶粘剂、包扎材料等等。直链淀粉还适合于淀粉软糖制造，也可用作果酱增稠剂，用 于装盛油脂含量高的食品，以防i 卜油的渗出以及肉食品加工。近年来，在食品工、f p 中 提倡使用可被生物降解的薄膜，直链淀粉在这些方面具有较大的发展前