（植物学专业论文）rapd技术和its序列对5个节旋藻样品亲缘关系的研究.pdf

内蒙古师范人学硕i j 学位论文 中文摘要 节旋藻是一类光合自养的原核生物，属于蓝藻门( c y a n o p h y t a ) 、颤 藻目( o s c i l l a t o r i a l e s ) 、颤藻科( o s c i l l a t o r i a c e a e ) 、节旋藻属( a r t h r o s p i r a ) 。 该属的钝顶节旋藻( 么p l a t e n s i s ) 和极大节旋藻( 4 m a x i m a ) 因含有极 为丰富的营养成份和生理活性物质，被誉为“2 1 世纪最理想的食品”和“人 类2 1 世纪最佳保健品 ，所以作为一种商业性藻种而被许多国家开发利 用。自从1 9 4 0 年法国药物学家g r e a c h 在非洲c h a d 湖发现钝顶节旋藻以 来，有关节旋藻应用和基础研究逐渐引起国际上的广泛关注。 1 9 9 6 年，内蒙古农业大学的乔辰教授等在内蒙古鄂尔多斯高原碱湖 发现了3 种节旋藻，填补了我国节旋藻种质资源的空白。近几年，对鄂 尔多斯高原碱湖节旋藻的研究已有很多报道，主要集中在对该地区节旋 藻的发现、形态解剖结构及生理生化特性方面。有关鄂尔多斯高原碱湖 节旋藻遗传多样性、进化地位和亲缘关系的报道较少，2 0 0 8 年邰丽华使 用r a p d 技术仅对2 种不同生境下的钝顶节旋藻进行了分析，李琳使用 a f l p 方法对4 个节旋藻样品的遗传多样性和亲缘关系进行了研究。 本文以内蒙古鄂尔多斯高原碱湖的钝顶节旋藻( a ，) 、鄂尔多斯节旋 藻( a 2 ) 、方胞节旋藻( a 3 ) 、非洲c h a d 湖的钝顶节旋藻( a 4 ) 和墨西哥 t e x c o c o 湖的极大节旋藻( a 5 ) 为材料，运用r a p d 分子标记技术和 1 6 s 一2 3 sr r n a 转录单元内间隔区序列( i n t e r n a l l yt r a n s c r i b e ds p a c e r , i t s ) 对5 个节旋藻样品的遗传多样性进行了研究，试图从d n a 水平探讨它们 的进化地位及亲缘关系，丰富和完善节旋藻种质资源的基础研究内容， 这对于鄂尔多斯高原碱湖节旋藻种质资源遗传多样性的保护和利用具有 重要意义。 r a p d 研究结果显示，扩增得到碱基大小在2 0 0 4 0 0 0 b p 之间的6 8 1 条清晰带，其中多态性条带为6 7 4 ( 9 8 9 7 ) ，平均每条引物得到2 1 2 8 条。5 个样品a 1 、a 2 、a 3 、和a 5 特异性条带数分别为2 7 6 、2 7 3 、1 7 5 、 1 8 5 和2 2 0 。按照谱带数越多，进化程度越高的观点，推测5 个样品进化 程度由低到高的顺序是：a 3 a 5 a 2 一a 1 。与李琳使用a f l p 对方孢节旋 藻a 3 在4 个节旋藻样品间关于进化程度的结果不尽相同，所以a 3 的进 化地位有待于进一步研究。5 个样品间的平均遗传距离在0 3 5 8 1 , - - - 0 7 9 3 5 内蒙古师范人宰锄jl ：学位论义 间，其中和a 5 的遗传距离最小为o 3 5 8 1 ，a 2 和a 5 的遗传距离最大为 0 7 9 3 5 ，其余样品介于它们之间，说明5 个样品存在一定的遗传分化。聚 类分析表明，引进种和a ；的亲缘关系最近，a l 和a 2 次之，而鄂尔多 斯碱湖的方胞节旋藻a 3 与两个引进种和a 5 的亲缘关系较近，2 个不 同原产地的钝顶节旋藻a ，和之间的亲缘关系不是最近的。 i t s 片段的序列分析结果表明：5 个样品的i t s 序列长度在4 7 2 - 4 7 7 b p ，均含t r n a n e 和t r 一8 两个t r n a 基因：g c 含量在4 7 8 8 4 8 0 1 之间，序列间的相似性高达9 1 5 - 1 0 0 ；5 个样品间的遗传距 离在0 0 0 0 - - 0 0 9 1 之间，其中与a 5 、a 2 与a 3 的遗传距离最小，均为 0 0 0 0 ，样品间具有极高的同源性，2 个不同原产地的钝顶节旋藻a ，和 的遗传距离最大为0 0 9 1 。聚类结果表明a ，和、和a 5 间的亲缘 关系与r a p d 结果吻合，表现出种内的亲缘关系不如种间亲缘关系近， 产生这种相悖的原因，推测是由于各自的生态环境明显不同和长期地理 隔离促使两者在遗传上发生了一定的分化。 r a p d 结果表明鄂尔多斯高原碱湖节旋藻a ，与a 2 亲缘关系较近，与 a 3 亲缘关系较远。与i t s 片段对这3 个样品的研究结果不尽相同，作者 推测出现这种差别的原因是i t s 片段长度为5 4 0 b p 左右，仅利用i t s 序 列来考察样品间的亲缘关系可能存在一定的局限性，而r a p d 扩增片段 主要分布于2 0 0 b p - - - 4 0 0 0 b p ，远远大于i t s 片段，不同的标记技术由于所 揭示的遗传位点不同，故在分析结果上存在一定差异。 关键词：节旋藻，r a p d ，i t s 片段，遗传多样性，亲缘关系 内蒙古9 叶i 范大学硕：l ：学位论文 a b s t r a c t a sag r o u po fp h o t o s y n t h e t i ca u t o t r o p h i cp r o k a r y o t e ，a r t h r o s p i r ah a sa b r i g h tp r o s p e c tf o re x p l o i t a t i o nb e c a u s ei tc o n t a i n sa b u n d a n tn u t r i t i o n a l i n g r e d i e n t sa n dp h y s i o l o g i c a la c t i v em a t e r i a l s w o r l dh e a l t ho r g a n i z a t i o na n d f o o da n da g r i c u l t u r eo r g a n i z a t i o nc a l li t “t h eb e s th e a l t hc a r ep r o d u c t sa n d f o o d si nt h e2 1s tc e n t u r y ”s i n c eg r e a c hd i s c o v e r e d a p l a t e n s 括i nc h a d l a k e i n 19 4 0 ，t h er e s e a r c ha b o u t a r t h r o s p i r ah a sb e e np a i dm u c ha t t e n t i o n i n1 9 9 6 ，t h r e es p e c i e so f a r t h r o s p i r aw e r ef o u n di nt h ea l k a l i n el a k eo f e r d o sp l a t e a ub yp r o f e s s o rq i a oe ta 1 ，w h i c hf i l l e dt h eg a p si nt h eg e r m p l a s m r e s o u r c eo fa r t h r o s p i r ai no u rc o u n t r y i nr e c e n ty e a r s ，m a n ys t u d i e sa b o u t a r t h r o s p i r a o fe r d o sp l a t e a uw h i c hi s m a i n l y o nm o r p h o l o g ya n a t o m i c s t r u c t u r ea n dp h y s i o l o g i c a lb i o c h e m i c a lc h a r a c t e rh a sb e e nr e p o r t e d b u tt h e r e i sl i t t l er e p o r to n g e n e t i cd i v e r s i t y , e v o l u t i o na n dg e n e t i cr e l a t i o n s h i p i n2 0 0 8 ， t a il i h u au s i n gr a p dt e c h n i q u ea n a l y z e dt w o s p e c i e so fa p l a t e n s i sf r o m d i f f e r e n te n v i r o n m e n t ，a n dl il i nu s i n ga f l pa n a l y z e df o u rs a m p l e so f a r t h r o s p i r aa b o u tg e n e t i cd i v e r s i t ya n dg e n e t i cr e l a t i o n s h i p i nt h i s p a p e r ，t oe n r i c ha n dc o n s u m m a t et h eb a s i ci n v e s t i g a t i o n o f a r t h r o s p i r aw h i c hi sm e a n i n g f u lt op r o t e c ta n du t i l i z et h eg e n e t i cd i v e r s i t yo f a r t h r o s p i r ag e r m p l a s mr e s o u r c ei ne r d o sp l a t e a u ，t h et e c h n i q u eo fr a p d m o l e c u l a rm a r k e ra n d16 s - 2 3 sr r n a i n t e r n a l l yt r a n s c r i b e ds p a c e r ( i t s ) w e r e u s e dt oa n a l y z et h eg e n e t i cd i v e r s i t yo f a 1 ，a 2 ，a 3 ，a 4a n da 5 t h eg e n o m ed n ao f 5s a m p l e so f a r t h r o s p i r ai sa n a l y z e dw i t hr a n d o m a m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ( 凡谨d ) t e c h n i q u e w i t ht h e1 1 4r a n d o m p r i m e r s ，3 2 p r i m e r sr e v e a l e dt h e i ro b v i o u sp o l y m o r p h i s m sa n d6 81c l e a r b a n d i n g sw h o s es i z e sa r eb e t w e e n2 0 0 b p - - - ，4 0 0 0 b pc a nb eg a i n e d 6 7 4b a n d s o ft h e ma r ep o l y m o r p h i s m ，a n de a c hp r i m e rc a no b t a i n2 1 2 8p o l y m o r p h i c b a n d i n g sa v e r a g e l y t h es p e c i f i cb a n di s2 7 6f o ra b2 7 3f o ra 2 ，1 7 5f o ra 3 ， 内蒙古帅范人学硕l j 学位论文 18 5f o ra 4 ，a n d2 2 0f o ra 5 a c c o r d i n gt ot h em o r eb a n dn u m b e rt h eh i g h e v o l u t i o n a r yl e v e l ，c o n j e c t u r e t h el o wt o h i g he v o l u t i o n a r y l e v e l i s ： a 3 a 5 a 2 a 1 b u tt h er e s u l to fa 3i sd i f f e r e n tf r o ml il i nu s i n ga f l p a n a l y z e df o u rs a m p l e so fa r t h r o s p i r aa b o u te v o l u t i o n a r yl e v e l t h e r e f o r e ，i t n e e d sf u r t h e ri n v e s t i g a t i o n t h ea v e r a g eg e n e t i cd i s t a n c eo ff i v es a m p l e si s b e t w e e n0 3 5 81a n do 7 9 3 5 ，a m o n gw h i c ht h es h o r t e s tg e n e t i cd i s t a n c ei s 0 3 5 8 1b e t w e e ns a m p l ea na n da 5a n dt h el o n g e s ti so 7 9 3 5b e t w e e ns a m p l e a 2a n da 5 i tm e a n st h a tt h e r ew e r es o m eg e n e t i cd i f f e r e n c e sa m o n gs a m p l e s t h ec l u s t e ra n a l y s i sb a s e do nu p m g aa n dt h ed a t ao fg e n e t i cd i s t a n c er e s u l t s d e m o n s t r a t e dt h a tt h ei n t r o d u c e ds a m p l e sa 4a n da 5h a v et h ec l o s e s tg e n e t i c r e l a t i o n s h i p ，a n da 1a n da 2h a v ear e l a t i v e l yf a r t h e rg e n e t i cr e l a t i o n s h i p ，b u t t h eg e n e t i cr e l a t i o n s h i pa m o n ga 3 、a na n da 5i sc l o s e r ，t h ea p l a t e n s i sa 1 f r o me r d o sp l a t e a ua n da nf r o mc h a di sf a r t h e r c o m p a r e dw i t ht h ef i v es e q u e n c e so fi t s ，t h er e s u l t ss h o wt h a t f i v e s e q u e n c e sc o m p r i s e4 7 2 - - 4 7 7n u c l e o t i d e s ，i nw h i c hc o n t a i nt w ot r n ag e n e s ， t r n a i ka n dt r n 8 t h eg cc o n t e n t so fi t sa r e4 7 8 8 - 4 8 0 1 ，a n dt h e s i m i l a r i t i e so fn u c l e o t i d es e q u e n c e sr a n g ef r o m9 1 5 t o1 0 0 t h eg e n e t i c d i s t a n c eo ff i v es a m p l e si sb e t w e e n0 0 0 0a n d0 0 9 1 ，a m o n gw h i c ht h e s h o r t e s t g e n e t i cd i s t a n c ea r eb e t w e e na na n da 5 ，a 2a n da 3 ，a n dt h el o n g e s t g e n e t i cd i s t a n c e a r eb e t w e e na 1a n da 4w h i c hc a m ef r o mt w od i f f e r e n t p r o v e n a n c e s t h ec l u s t e ra n a l y s i s r e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a tt h e g e n e t i c r e l a t i o n s h i pb e t w e e na 1a n da n ，a na n da 5a r ei d e n t i c a lw i t h t h er e s u l to f r a p d ，w h i c hm e a n sg e n e t i cr e l a t i o n s h i p o fi n t e r s p e c i e si sc l o s e rt h a n i n t r a s p e c i e s t h e a u t h o rp r e s u m e st h a tt h ed i f f e r e n te n v i r o n m e n t s a n d g e o g r a p h i c a li s o l a t i o na r et h ep r i m a r y r e a s o n sf o rt h er e s u l t t h er a p dr e s u l ts h o w st h a ta 1a n da zh a v eac l o s e rg e n e t i cr e l a t i o n s h i p ， b u tf a r t h e rt h a na 3 ，w h i c hi sd i f f e r e n tf r o mt h er e s u l to fi t s t h er e a s o nm a y b et h a tt h e r ea r el i m i t a t i o n so n l yu s i n gi t ss e q u e n c et oi n s p e c t g e n e t i c r e l a t i o n s h i pb e t w e e ns a m p l e s w h o s e l e n g t h a b o u t5 4 0 b p ，h o w e v e rt h e a m p l i f i c a t i o nf r a g m e n to fr a p dm a i n l yd i s t r i b u t e s2 0 0 - 4 0 0 0 b p ，e x c e e d i n g i t ss e q u e n c e d i f f e r e n tm o l e c u l a rm a r k e rr e v e a ld i f f e r e n tg e n e t i cl o c u s ，s o 内蒙古师范人学顾i ：学位论文 a n a l y t i cr e s u l t se x i s td i s t i n c t i o n k e y w o r d s ：a r t h r o s p i r a ，1 6 s 一2 3 sr r n ai n t e r n a l l yt r a n s c r i b e ds p a c e r ( i t s ) ，r a p d ，g e n e t i cd i v e r s i t y ，g e n e t i cr e l a t i o n s h i p 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果，尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的 地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不 包含本人为获得内蒙古师范大学或其它教育机构的学位或证书t i 玎使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在 论文中作了明确的说明并表示感谢。 ，z 签名： 过丝 曰期： 砷了年厂月1 0 日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解内蒙古师范大学有关保留、使用学位 论文的规定：内蒙古师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送 交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文 的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容 和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 ， 签名巧薪 锄签名：等暇 ， ， 日期：加口7 年，月f0 日 前言 1 节旋藻概述 前言 ( p r e f a c e ) p r e f a c e刖吾( 、 1 1 分类地位 节旋藻属于蓝藻f - i ( c y a n o p h y t a ) 、颤藻目( o s c i l l a t o r i a l e s ) 、颤藻科 ( o s c i l l a t o r i a c e a e ) 、节旋藻属( a r t h r o s p i r a ) ，是最早出现的光合自养生物之一，在 地球上已有3 5 亿年的生存历史【1 , 2 , 3 , 4 】。有的文献中也把它称为螺旋藻属，事实上有关 节旋藻和螺旋藻是否属于同一个属，一直存在争议。著名蓝藻分类学家g e i t l e r 在蓝 藻纲中将这两个属合并为螺旋藻属，下设节旋藻亚属【4 】，并且这种划分一直被广泛 应用。藻类学家在光镜下发现节旋藻横壁清晰可见，有收缢，而螺旋藻细胞横壁不明 显，横壁处不收缢1 4 】；并且分子生物学的证据也证实了它们之间在遗传本质方面存在 巨大差异，近年来国内外学者综合形态学、生理生化及分子系统学等研究成果形成了 较一致的观点，即将节旋藻和螺旋藻设为颤藻科下两个独立的属，因此伯杰系统细 菌学手册已经正式分立为节旋藻属和螺旋藻属【4 1 ，并建议今后学术用语应称节旋藻， 但目前商业用语仍将其称作“螺旋藻”1 5 ，6 j 。 1 2 分布 目前，已发现的节旋藻有1 4 种，淡水或盐碱湖是其常见的生长地，少数生活在 海洋中【4 , 7 , 8 9 】。1 9 3 5 年曾呈奎在青岛和烟台的海藻研究中记载了采白青岛的巨型 螺旋藻( s p i r u l i n as u b t i l l i s m a ) ，这是我国螺旋藻的最早记录【1 0 】。来自非洲c h a d 湖的 钝顶螺旋藻( sp l a t e n s i s ) 和美洲墨西哥t e x c o c o 湖的极大螺旋藻( sm a x i m a ) 1 1j 是 目前我国商业性生产所用的两个藻种。 1 9 9 6 年，内蒙古农业大学乔辰和李博生教授在鄂尔多斯高原巴彦淖尔碱湖发现 当地碱厂利用湖水生产日晒碱的贮卤池中漂浮着厚厚一层蓝绿色的水华，在显微镜下 观察几乎是很纯的节旋藻( 后鉴定为钝顶节旋藻) 。此后，该课题组先后对鄂尔多斯 高原9 个盐碱湖进行了调研，仅在碳酸赫型的盐碱湖巴彦淖尔、查干淖尔、白音 淖尔和察汗淖尔中发现有节旋藻和螺旋藻的分布。共发现了4 种形态不同的样品，经 南京大学曾昭琪教授鉴定，鄂尔多斯节旋藻( 彳e r d o s e n s i s ) 和巴彦淖尔螺旋藻( s b a y a n n u r e n s i s ) 是2 个新种；钝顶节旋藻p l a t e n s i s ) 和方胞节旋藻翻j e n n e r i ) 是2 个新记录种【9 1 。鄂尔多斯高原是我国著名盐碱湖密集区之一，其盐碱湖面积虽小， 但成群成组分布。该地区大于l k m 2 的湖泊中，有盐碱湖6 1 个，占总湖泊数量的6 5 8 ， 内蒙吉帅范人学颁l j 学位论义 碱湖总面积为1 8 9 k m 2 ，占湖泊面积的5 6 1 。该地区节旋藻和螺旋藻的发现填补了我 国该种质资源的窀向，特别需要指出的是能够形成大面积水华的钝项节旋藻的发现， 使得鄂尔多斯高原成为该藻种在世界上的第二个分布区。 1 3形态特征 节旋藻为原核生物，结构简单，其细胞中没有真正的细胞核，也没有高等植物所 具有的叶绿体、线粒体和高尔基体等细胞器。节旋藻藻丝是由许多圆柱状细胞连结而 成的单列丝状体，呈疏松或紧密的有规则的螺旋形或波浪形，长约5 0 5 0 吮m ，直径 约1 1 2 p m ，两端顶部细胞钝圆，无分枝，无异形细胞，一般无粘性鞘覆盖；偶尔在 成熟的藻丝体或自然断裂的短的藻丝体中可见到褪色的特化细胞，这是其裂殖的现象 1 1 2 1 o 节旋藻分布很广，因生长环境不同其形态也不同。其中多数藻丝体的螺旋比较规 律、均匀，但也有中间紧凑而两端稀疏的：有些藻丝体的螺距短而紧密；有些则很松 弛，整条藻丝体不过2 - 4 个螺旋；有些甚至呈直线状。藻丝体大小也有差别，如钝 顶节旋藻的细胞直径可从3 5 - - 1 1 z m ，螺旋宽度可从2 0 , 1 0 0 9 m i 引。 不同地域或不同生长环境下的节旋藻形态相差较大，即使是在相同的生长环境 下，节旋藻的形态也不尽相同。有研究表明，正常的节旋藻藻株与直线形变异藻株在 超微结构、生理生化以及遗传特征等方面都存在差异，而且直线形变异藻株在特定条 件下会恢复到原来正常的螺旋形态【1 3 】。节旋藻形态的多形性是一种普遍现象，这给以 形态特征为丰要依据的经典分类方法带来了困难，进而影响了节旋藻遗传多样性和亲 缘关系的研究，并制约了节旋藻产业的进一步发展。因此，寻求并建立能有效区分该 类群种属、品系水平的方法就显得极为迫切。 1 4 研究进展 现在作为人类食品的2 种节旋藻早在1 0 0 多年前就被藻类学者以当时新的物种在 学术刊物上发表【引。自从1 9 4 0 年钝顶节旋藻被法国药物学家c r e a c h 在c h a d 湖重新 发现以来1 5 1 ，各国研究者在分类、生理、形态解剖、生态、培养条件和营养成分等方 面展开了一系列的研究。1 9 5 2 年，华盛顿的卡内基研究所( c a r n e g i ei n s t i t u r eo f w a s h i n g t o nb u r i e w ) 发表了藻类培养从实验室到中间工厂一文，总结了第二次世 界大战前后进行一定规模培养节旋藻的情况f 1 4 】。1 9 6 6 年，法国巴斯德研究所的c z a r r o u k 发表了他的博士论文，提出了查氏培养基( z a r r o u km c d i u m ) 【1 5 】。1 9 6 7 年， 法国石油协会g e n v i e v ec l e m e n t 女士第一次公布她试验节旋藻养殖结果，并全面介 2 只l j 置 绍了节旋藻的营养价值、培养方法、收获干燥技术【1 4 】。1 9 7 0 年，o g a w a 等对节旋藻 生长进行了研究( 1 6 j ；1 9 7 9 年和1 9 9 6 年，m e l a c k 和v o n s h a k 等对节旋藻光合作用进行 了研列1 7 , 1 8 j ；1 9 9 2 年，m a r t e l 研究了节旋藻的糖苷酶1 1 9 1 ；1 9 9 6 年和1 9 9 7 年，k e b e d e 对节旋藻生长的最适条件等进行了研究【2 0 2 1 】；1 9 9 8 年，邱丽氚等研究了大节旋藻的 色素、吸收光谱、p o d 同工酶【2 2 1 ；1 9 9 9 年，胡鸿钧对螺旋藻分类进行了研究【冽；2 0 0 0 年，郭厚良等报道了螺旋藻原生质球的制备【2 4 , 2 5 1 ；2 0 0 1 年，茅云翔等用1 6 sr r n a 基 因与1 6 s 2 3 sr r n a 间隔区序列分析鉴定节旋藻和螺旋藻【2 6 j ；2 0 0 3 年，刘金姐对节旋 藻藻蓝蛋白操纵子、r u b i s c o 基因进行了研究【2 7 】；2 0 0 5 年，张晓辉等首次克隆和分析 了节旋藻和螺旋藻2 个属中的h o xy 基因，并将其应用到节旋藻和螺旋藻系统学分析 中【2 8 】；2 0 0 7 年，黄晖对节旋藻分类学地位及生产性状的分子标记进行了研究f 2 9 】，2 0 0 8 年，c h o ig g 等对钝顶节旋藻突变品系y 亚麻酸产量和生物量地增加进行了研究， 2 0 0 9 年，l a m i at r a b e l s i 等对钝顶节旋藻细胞外的多糖进行了研究【3 ，等等。 近几年，关于鄂尔多斯高原碱湖节旋藻的发现、形态解剖结构及生理生化特性方 面的研究已有很多报道。2 0 0 1 年，乔辰等介绍了鄂尔多斯节旋藻新种【9 】；2 0 0 3 年， 刘华等对该地特有螺旋藻的光合色素和光合生理做了研究【3 2 , 3 3 】；2 0 0 2 年和2 0 0 5 年， 栗淑媛等对其过氧化氢酶动力学【3 4 1 、低温对脱氢酶活性和游离氨基酸外渗的影响进行 了研究f 3 6 】：2 0 0 6 年，田秀英等f 3 6 】、袁淑珍【3 7 l 、张三润【3 8 】分别研究了其解剖结构、低 温胁迫和质膜对低温的反应；2 0 0 7 年，毛永强研究了细胞内氧化还原酶对低温的反 应1 3 州等等。但有关鄂尔多斯高原碱湖节旋藻遗传多样性、进化地位和亲缘关系的研究 报道较少，仅见2 0 0 6 年杨茵等对其同工酶和可溶性蛋白的研究【4 0 1 ；2 0 0 8 年，李琳采 用a f l p 技术对其中2 个节旋藻进行了遗传多样性和亲缘关系的研究【4 1 1 。使用 1 6 s 2 3 sr r n a 转录单元内间隔区序列( i n t e r n a l l yt r a n s c r i b e ds p a c e r , i t s ) 对该地节旋 藻亲缘关系的研究尚未见报道。 1 5开发利用 人类食用节旋藻始于何时，现在已经难以考证【5 1 。但直到1 9 6 5 年比利时植物学 家l e a nl e o n a r d 和c o m p e r e 等在非洲c h a d 湖和墨西哥t e x c o c o 湖的节旋藻其化学组 成的首次报道，才引起科学家们的广泛关注【4 2 】。1 9 8 0 年，c h a m o r r o 发表了长达6 万 字的研究报告，证明了食用节旋藻安全无毒，为节旋藻的大规模养殖、保健食品和药 品的开发奠定了基础【4 2 】。经过多年的研究，发现节旋藻含有丰富的蛋白质，其蛋白质 效价也十分高，且氨基酸种类十分齐全、组份均衡，人体必需的八种氨基酸的含量与 联合国粮农组织( f a o ) 所设计的人类食品理想特性标准十分接近【4 3 】。此外节旋藻所 3 内蒙古师范人学硕i ：学位论义 含b 。胡萝卜素是所有食物中最多的，各种维生素含量也很丰富，富含人体所需的各种 微量元素，还含有多糖、褐藻胶、s o d 、y 亚麻酸等多种活性物质。节旋藻有抗辐射、 抗氧化、抑制癌症细胞增值等作用1 2 】，对糖尿病、各种肠胃病、神经性皮炎、白癜风、 高血脂等多种疾病具有明显的预防和辅助治疗作用，因而被联合国粮农组织和世界卫 生组织分别誉为c c 2 1 世纪最理想的食品，和“人类2 1 世纪最佳保健品”【1 0 , 4 4 , 4 5 】。多年来 在世界范围内，某些节旋藻因其营养价值之高，已经进行大规模养殖并投入工厂化生 产。 节旋藻产业发展非常迅速，自从世界上第一个节旋藻工厂于1 9 6 8 年建成以来， 目前已有1 0 多个国家和地区投资节旋藻的研究和生产，销售额已达2 0 亿美元以上。 我国在2 0 世纪7 0 年代引进节旋藻并进行研发，但在近十几年才得到较快的发展，目 前我国节旋藻干粉年产量约占全球产量的4 0 ，成为名副其实的节旋藻养殖大国【4 6 】。 节旋藻具有较高的光效时性，对太阳能的转化率为1 5 ，单位面积产量比大田作 物高出许多。通过节旋藻利用太阳能来制取食物和饲料具有巨大的潜力。藻类植物在 其繁殖过程中可释放出大量氧气，因此通过大规模放养螺旋藻能够净化空气，改善生 态环境【4 训。 随着节旋藻商业开发规模的不断扩大和产业化水平的日益提高，近年来有关节旋 藻的分子遗传学f 4 2 】、高光合效率、形态建成f 4 8 】、耐盐碱f 4 9 】、耐低温f 4 9 j 和抗辐射机制 【5 0 】等基础研究也得到了前所未有的重视并不断深入，其成果不仅极大地推动了节旋藻 产业地进一步发展，而且对光合作用、生物起源与进化、逆境生存与适应机制等重大 生物学问题地研究也起到了匝大地推动作用1 1 ，5 。 2 蓝藻分子生物学研究 蓝藻门( c y a n o p h y t a ) 是一类分布广泛，形态、结构较简单的原核生物。蓝藻的 分类起初主要根据形态特征进行，但是不同的培养条件可能会导致其形态特征发生变 化，因此建立在分子生物学基础上的分类方法已经不断的成熟。分子系统学是近几十 年发展起来的- - 1 - 对生物大分子进行综合分析的前沿学科，它在分子水平上对生物进 行遗传多样性、分类、系统发育和进化等方面的研究，其研究结果对于保护生物多样 性( 尤其是遗传多样性) ，揭示生物进化历程及机理具有十分重要的意义，因此人们 开始从分子水平上寻找生物之间的系统发生关系的证据。近年来，许多基因已被用于 蓝藻的分类和系统发生的研究，如藻蓝蛋白亚基因间隔区p c i g s 区( p h y c o c y a n i n i n t e r g e n e t i cs p a c e r ) ，1 6 sr r n a 和i t s 区及核酮糖1 ，5 二磷酸羧化酶加氧酶基因大 4 刖昌 亚基基因( r b c l ) 等。 随着分子生物学的深入丌展，d n a 序列和蛋白质资料的积累同益丰富，促使了 利用核苷酸序列和氨基酸序列的同源性来研究物种间的演化关系。核苷酸和蛋白质是 遗传信息的载体，因此它们可能成为推断系统发生关系最直接的证据。d n a 序列广 泛用于各种生物类群的遗传多样性分析、种属关系以及系统进化的分析，一方面是因 为分子资料方便获取和分析，另一个重要的原因是利用分子资料可以在形态学资料以 外独立的推导出某一类群的系统发育假设，同时也为检测形态进化的假说提供了一个 独立的证据来源【1 3 】。分子系统学早期主要应用于陆地生物，在2 0 世纪7 0 年代后才在 藻类中得到广泛应用，通过藻类分子信息的分析比较研究藻类系统发生的学科，称为 藻类分子系统学。2 0 世纪8 0 年代藻类分子系统学兴起以后，应用各种分子手段研究 蓝藻的系统发生、亲缘关系及地理分布已成为热点【4 , 5 1 】。近1 0 多年来，蓝藻分子系统 学研究越来越深入。 蓝藻分子系统学的发展建立在分子标记技术的基础上。分子标记主要包括蛋白质 标记、d n a 序列分析、d n a 指纹分析及d n a 的构象变化与s s c p 分析【2 8 】。蓝藻分 子系统学研究方法主要包括：蛋白质标记、d n a 碱基组成、d n a d n a 杂交、d n a 指纹分析及基因序列。这些工作有助于理解不同表型的遗传基础以及解决某些蓝藻鉴 定问题，各有优劣。 在d n a 一级结构水平上检测多念性最直接的方法是进行d n a 的序列分析，即 测定核苷酸在基因组d n a 特定区域的排列顺序。序列分析可提供高度重复的、信息 丰富的数据，适合于中等和高层次分类群的系统学研究，近年来用于居群水平的研究 也逐渐增多。 2 11 6 sr r n a 基因和i t s 序列 r r n a 是研究细菌进化和亲缘关系的重要指标，它含量大( 约占细菌r n a 总量 的8 0 ) ，并存在于所有细菌中，r r n a 基因由保守区和可变区组成。在细菌中高度 保守，素有“细菌化石”之称，是细菌系统分类学研究中最有用和最常用的分子钟。 多数原核生物有3 种核糖体r n a ( r r n a ) ，分别是5 sr r n a 、1 6 sr r n a 和2 3 s r r n a l 5 2 1 。其中编码1 6 sr r n a 的基因长度约1 5 k b 左右，包含序列变化较大的可变区 和序列基本保守的恒定区。原核生物的分类鉴定及系统学分析可利用比较可变区 d n a 序列差异性的方法。r n a 基因在所有细胞生物中均存在并且高度保守，其分子 演化速率相对较慢，可以准确的确定亲缘关系较远的物种间系统发育关系。在对蓝藻 进行较高分类阶元上的研究时，广泛采用的一种分子标记就是1 6 sr r n a 基因，常被 5 内浆吉帅范人学颁 ：学位论文 用于鉴定种以上的株系，对于种以下的水平，有9 9 6 的同源性，分辨率不蒯4 7 1 。2 0 0 1 年茅云翔等利用1 6 sr d n a 对螺旋藻和节旋藻进行了系统发生分析，认为在这个基【大j 位点上能够将螺旋藻和节旋藻区分丌1 2 6 1 。 需要指出的是，众多研究表明，1 6 sr r n a 基因序列一般更适合于属间分类，而 对种以下水平往往会因个体间差异位点少、分辨率不够等原因，而得不到合理、满意 的分类结果【5 2 】。 通常，编码r r n a 基因的不同亚基间排列顺序是1 6 s 2 3 s 5 s ，极少数小基因组的 寄生生物：t j 夕i , 1 5 3 , 5 4 】i1 6 sr r n a 和2 3 sr r n a 之间以及2 3 sr r n a 和5 sr r n a 小亚基 之间存在着长度不同的核苷酸片段间隔，称为i t s ( r d n ai n t e r g e n i ct r a n s c r i b e d s e q u e n c e s ，i t s ) 。i t s 片段的长度差异在不同物种之间非常大，即使在同一基因组内 不同操纵子上的i t s 片段长度也可能不同。i t s 片段的高度可变性不仅表现在长度的 差异上，d n a 序列上的差异更大。此外i t s 内部还夹杂着一些基因功能单位，t r n a 基因是比较常见的一种，主要是t r n a a a 8 、t r n a 和t r n a g h ，t r n a 基因种类及碱 基个数的不同也导致了i t s 序列上的差异。因而可以提供丰富的变异位点和信息位 点，所以在对亲缘关系较密切的蓝藻和细菌进行分类鉴定、系统发育和结构变迁等方 面的研究时，可被用作精细的分子指标。核糖体r r n a 基因转录间隔区( i t s ) 在高 等植物中已经被广泛用作研究系统和演化的重要分子标记，特别适合研究属、种级的 系统发生和分类研究【5 5 1 。 根据l e b l o n db o u r g e t 等人的研究，i t s 片段的进化速率是1 6 sr d n a 的1 0 倍1 5 引。 作为一种进化速率相对较快的分子标记，i t s 可以应用于属下、种下水平的研究p6 l ， 已逐步成为在种和亚种水平上对蓝藻进行系统发生研究的有力工具【5 4 j 。 通过p c r 可获得多种i t s 片段混合的扩增产物，采用克隆技术可分离混合的扩 增产物，并对每个克隆子都进行测序从而获得所需i t s 片段的序列；或者通过电泳分 离混合的扩增产物得到所需长度的条带，在紫外灯下割胶回收后进行直接测序【“】也能 获得目的i t s 片段的序列。随着分子生物学的飞速发展，近年来已发展的一些全新的 d n a 测序方法，如毛细管凝胶电泳法、陈列毛细管凝胶电泳法、超薄层凝胶板电泳 法以及杂交法、质谱法、原子探针法、流动式单分子荧光检测法等已应用到i t s 序列 分析中【5 7 1 。d n a 序列的测定为微生物的分类鉴定提供了更可靠的证据，结合基因序 列数据库中已知菌种的d n a 序列对所测i t s 片段进行详细的序列对比，可分析被试 菌种与已公布d n a 序列的菌种间的同源性。目前，i t s 基因序列数据库非常丰富。 继v o l k e rg u r t l e r 之后，s a r a hl b o y e r 等对6 3 个属的共9 4 种常见细菌( 包括真细菌、 6 前言 古细菌、蓝细菌和真核质体) 的i t s 序列的长度和结构做了总结【5 8 1 。o t s u k a 等人对 4 7 株微囊藻的i t s 序列进行了分析【1 2 】。史全良等通过对共生念珠藻i t s 序列的研究 发现，共生念珠藻i t s 序列存在多拷贝现象，推测出现这种现象是不等交换的结果， 各拷贝间i t s 序列的差异表现在结构和碱基组成上的不同【5 9 l 。研究表明尽管蓝藻与 其它真细菌一样，不同种类其r r n a 操纵子会有差异【2 】，但在蓝藻中，同一种类r r n a 操纵子具有较大的保守性【3 j ，庄丽等对微囊藻属和颤藻属r d n a1 6 s 2 3 s 基因间隔区 的分析来看，该区域在属间和种间具有相对较高的突变速率，而在种内则非常保守1 4 j 。 用作蓝藻系统发育分析分子标记的基因序列除1 6 sr r n a 基因和i t s 序列，还有 r u b i s c