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疫苗的制备 10生化制药 38号 张雪萌摘要：自古以来，人们一直对传染病有着莫大的恐惧。尽管古代社会对病原生物感染的科学知识，但人们从实践中积累了一些预防感染的经验。在与病原生物作斗争的漫长历史进程中，免疫的观点得到了发展与深化，人类更以其聪明才智研制出了疫苗，并扩大生产，对人类做出了巨大的贡献 。关键词：病原生物、预防、免疫、感染、疫苗、生产引言：在二十世纪，疫苗是人类对抗传染疾病的最成功的武器之一。时至今日，日常使用的常规疫苗依然是预防大量传染性疾病的非常有效的工具。目前，新的疫苗技术在以下两个方向得以迅速发展：1、改进现有的疫苗；2、针对目前尚无疫苗可用的疾病开发新疫苗。现代生物技术为当前疫苗的开发提供了强劲的动力。【1】免疫学的发展为现代医学的疾病治疗与预防提供了重要的理论基础，并形成了疫苗免疫预防传染病的敢于对策。现代免疫学已经全面突破了抗传染范畴，已成为生命科学的前沿学科，它对医学和生命科学的全面与均衡发展起到了重要的推动作用。【2】 疫苗的作用机制【2】 疫苗模拟天然感染过程，使注射疫苗的个体建立病原体特异的免疫记忆。反复接触病原体个体或那些接受过疫苗的人能对病原体做出比未免疫个体更强更快的反应。因为体内存在记忆型T细胞和B细胞。疫苗所有诱导的细胞免疫和体液免疫的能力跟疫苗的本质以及疫苗如何投递（比如所用的计量、吸收途径和佐剂）有关。有效的疫苗通常有较广的病原体特异性。病原体特异的T辅助细胞、细胞毒T淋巴细胞的活化和扩增以及成熟B细胞分泌的抗体使致病病原体灭活，或清除病原体感染的细胞最终起到预防疾病的作用。（R.J.Y.霍 M.吉巴尔地 疫苗开发的基本要求：【3】1、病原体的发现与确认；2、 病原微生物在可以为人接受的细胞培养系统中的生长制备；3、 减毒、灭活和亚单位灭活方法的选择；4、 合适的减毒或是灭火技术，以保证人体能够接受的反应性和引起的免疫原性；5、 必须使用佐剂、可引起合适的免疫反应、稳定性和长期的免疫效率的规范化；6、 对安全性、反应性及免疫原性的临床前评价；7、 再对照临床试验中有关保护效率及免疫持续效果的证据；8、 能够为在产品使用上能够为公共所接受的使用标志的设计；9、 在生产规模上的制备，问号的核发，生产和产品的发放。疫苗的制备原则：安全性、有效性、生产适应性、稳定性疫苗的制备工艺 【4】一、病毒性疫苗的制备工艺1、毒种准备 毒种的选择 病毒性疫苗生产和鉴定用的毒种应由国家药品检定机构中国药品生物制品检定所，或国务院药品监督管理部门认可的单位保存、鉴定及批发。 种子批的制备 疫苗生产用病毒应以病毒种子批系统为基础进行三级管理，即原始种子批、主种子批和工作种子批。三级种子批按各毒种的相应培养条件进行传代，同时控制传代次数，主种子批和工作种子批的生物学特征与原始种子批一致。 毒种的保存 按规定方法保存各级种子批的毒种，所用技术手段有加入保护剂、冷冻干燥等，并保存在低温条件下。2、病毒培养基质 使用动物或人体来源的培养细胞作为制造病毒性疫苗的培养基质，包括：动物或人源的连续传代细胞系、二倍体细胞或及原代细胞。个别病毒性疫苗如禽流感疫苗用鸡胚生产。3、病毒接种与培养取工作种子批毒种按一定比例稀释成毒种悬液。一般当细胞培养成单层后，挑选生长良好的细胞瓶，按与细胞的规定比例接种毒种悬液。在适当温度下培养适当时间，待病毒毒种充分吸收细胞或复制到一定程度后（如出现一定病变时），更换培养液，即将营养液换为血清含量低（月2%）的相应培养液，习惯上称维持液，意为维持细胞存活，使病毒大量复制，继续培养到相应的规定时间。4、病毒收获用细胞培养病毒一般在细胞病变达到一定程度时收获病毒，如病毒自然释放到培养液中只需收获培养液；若病毒不释放到培养液中而积累在细胞内，则需收获细胞并需后续加工，使病毒从细胞中释放出来。5、灭活或加保护剂制备灭活疫苗和减毒活疫苗对于收货后的病毒有不同的处理方法。灭活疫苗要进行灭活处理，一般要加入防腐剂。减毒活疫苗一般要加入稳定剂或保护剂，以保护病毒的活性特别是免疫活性。6、纯化有些疫苗不经纯化步骤，直接制成原制疫苗；有些疫苗的纯化步骤在灭活之前，即先进行纯化，然后再灭活。纯化的方式一般采用超滤、离子交换色谱、离心法等。7、配制收获病毒经加工处理制成疫苗原液并经鉴定合格后，根据病毒水平可以适当稀释，再制成半成品。2、 细菌性疫苗的制备工艺1、 菌种准备菌种的选择 疫苗生产和检定用的菌种和检定用的菌种应由国家鉴定机构中国药品生物制品检定所，或国务院药品监督管理部门认可的单位保存、检定及分发。种子批的制备 疫苗生产用菌种应以种子批系统为基础进行三级管理，即原始种子批、主种子批和工作种子批。三级种子批按各菌种的相应培养条件进行传代，同时控制传代次数，主种子批和工作种子批的生物学特征与原始种子批一致。菌种保存 按规定方法保存各级种子批的菌种，所用技术手段有加入保护剂、冷冻干燥等，并保存在低温条件下2、 培养基的制备培养基有不同的用途，有用于菌种保存的培养基，用于菌苗制备的培养基，用于生产毒素的培养基，用于无菌试验的鉴定用培养基；不同的培养基有不同的配制方法和制备方法，而制备不同的疫苗所用的培养基也不相同，生产中要严格按各种不同细菌性疫苗制备的具体技术规程制备相应的生产用培养基。3、 菌种接种发酵培养取经验检查符合要求的工作种子批菌种，按规定量接种相应培养基。培养方法：细菌性疫苗生产中用于菌苗培养的方法主要有固体培养法和液体通气培养法。大规模生产多采用液体液体通气培养法。培养条件：培养条件如培养温度、培养时间、培养期间的pH值变化、气体条件等都需按规程严格控制。细菌培养温度通常为37+1摄氏度，需氧菌要通气培养，让培养基中含有一定的氧量。4、 收获菌体固体培养基的细菌采集：采集细菌时应逐瓶用肉眼检查，污染杂菌者废弃，未污染杂菌者将菌苔刮入含PBS的大瓶中，充分摇匀制成菌体悬液，每瓶分别作纯菌实验，将试验合格的菌体悬液储存。液体培养法的细菌采集：直接将培养物收集到大瓶中，再逐瓶进行纯菌实验，发现杂菌生长者废弃。将收获物存放冷库，待分装。原液自采集日起用于配制加工不得少于规定日限。5、 灭活对于灭火细菌性疫苗，在原液中加入杀菌剂，我国多采用甲醛作为杀菌剂，最终浓度不产过1%，置响应温度放置一定时间，杀菌后的菌体悬液要进行无菌检查，菌体悬液要保存于2到8摄氏度。减毒活疫苗无需灭活过程。6、 纯化有些疫苗是由菌体制成的，制备这类疫苗仅需收获菌体而不需要进行抗原的提纯，而有些疫苗在生产过程中还需要进行抗原的提纯和精致。下面以制备脑膜炎球菌多糖疫苗为例介绍纯化多糖抗原的步骤：在收获的菌体培养物种先加入甲醛溶液杀菌；离心去菌体；去核酸和可溶性蛋白质；粗制多糖；精制多糖；过滤除菌，制成纯化多糖，-20摄氏度保存。7、 配制收获培养物经加工处理制成疫苗原液并鉴定合格后，更具规程规定稀释为半成品。疫苗的分批分装【4】 疫苗应按照中国药典（2010版）的有关规定分批和分装疫苗的质量控制【4】 疫苗的质量控制有特殊要求，主要包括所用的菌、菌毒的鉴定、原材料鉴定、在制品鉴定、原液鉴定、半成品鉴定、成品鉴定，不同疫苗要求进行的鉴定项目不同根据中国药典所列项目进行检定。生产操作过程应严格在符合药品生产管理规范（GMP）条件下进行。1、 菌、毒种的质量控制毒种：毒种的检定实验一般包括无菌试验、毒种鉴别试验、病毒滴定、病毒外源因子检查、免疫原性检查、猴体神经毒力实验。菌种：种子批必须进行菌种检定，一般包括细菌性态及培养特性检查、纯菌实验、生化反应、毒力实验、血清凝集实验、免疫力实验、抗原性试验等。2、 原辅料的质量控制生产和检定中所用的原材料、试验动物、试药、指示剂等，均应符合国家规定的标准。制品中所用的稀释剂、防腐剂、灭活剂以及增强疫苗的免疫力所用的佐剂等，其质量和用量应符合中国药典的规定，未纳入标准的化学试剂应不低于化学纯。生产用水源应符合国家饮用水标准，纯化水和注射用水应符合中国药典要求。3、 在制品质量控制 各种疫苗生产过程中不同工艺阶段在制品，应按相关疫苗质量控制的规定，进行必要的检测。对加工中在制品的检测性质有在线检测、数据检测和关键质量指标的放行检测等。在线监测可直接检测并调整工艺运行状况，数据检测可取得在制品的有关数据指标以确定进一步加工的工艺参数，而放行检测所检测结果决定某一工序在制品可否加入下一加工工序。病毒性疫苗的细胞培养阶段要进行外源因子检查，疫苗收获液要进行无菌检查；细菌性疫苗收获菌体后应进行纯菌实验，有杂菌者应废弃，灭活疫苗灭活后应进行无菌试验。4、原液的质量控制病毒类疫苗：一般要进行病毒滴液、无菌试验。有的疫苗需进行鉴别试验、灭活试验。细菌类疫苗：一般应进行镜检（菌行应正常、无杂菌）、凝集试验、无菌试验、浓度测定、免疫力实验。对亚单位疫苗：一般进行固体总量测定、各种含量测定、分子大小测定、特异性试验、内毒素含量测定。5、 半成品质量监控对疫苗半成品一般应进行无菌试验。6、 成品的质量监控病毒类疫苗：一般进行鉴别试验、外观检查、化学检定、水分测定、病毒滴定、热稳定性试验、无菌试验、异常毒性试验、牛血清蛋白含量测定。有的疫苗还要进行pH测定、游离甲醛含量测定、硫柳汞含量测定、安全试验。细菌类疫苗：一般进行鉴别试验、外观检查、化学检定、pH测定、含量测定、无菌试验、异常毒性试验、菌形及纯度检查；对亚单位疫苗成品除进行一般检查外，还应根据中国药典进行相应检查。疫苗的储存【5】 根据疫苗的特殊性质，疫苗通常以溶液或冻干剂型在28摄氏度储藏。他们的储藏期限由疫苗的物理化学性质及储藏条件决定，通常可以到到数年。容器的性质也会影响到疫苗的长期稳定。例如，以小瓶做容器时，由于接触会发生吸附作用或pH变化；应当避免水分通过塞子蒸发或吸附。使用pH指示剂或温度、时间敏感标签（“瓶装疫苗监视器”，当其暴露在过高温度或过了产品有效期后就会改变颜色）可以避免意外接种储藏不当或过期的疫苗。（荷兰 达恩J.A.克罗姆林 美国 罗伯特D.辛德拉尔 总结：在历史上人类所从事的科学探索中，没有那一项比疫苗科学所产生的成果用于传染病的预防更具现实意义。【6】20世纪，人们在公共健康发面取得了很大的进步，其中安全有效的疫苗对于延长人的寿命和提高生命质量起到了重要的作用，除了传统的疫苗制剂抵抗疾病，疫苗在不久的将来可以作为免疫治疗抵抗癌症和其他非感染性疾病。【2】 【1】胡野微生物与免疫学基础第一章绪言7页 郑州大学出版社【2】 生物技术与生