高通量筛选技术应用

高通量筛选技术的应用,高通量筛选（ HTS）又称大规模集群式筛选，是由高容量 化合物库、自动化操作、高灵敏度检测、高特异筛选模型、 高效率数据处理 5 个子系统有机组合而成，是一种新型、 高自动化、高灵敏度、高通量的筛选技术。,其理论基础是反向药理学（ reversepharmacology），即基 于受体、酶及离子通道等分子、细胞水平药物作用靶点， 从 现有化合物库中筛选出具有生物活性的先导化合物，在此基 础上再进行组织、器官及疾病相关动物模型研究,TEXT,高通量筛选技术在医药领域的应用,TEXT,高通量筛选技术在酶工程领域的应用,TEXT,高通量筛选技术在基因领域的应用,高通量筛选( high-throughout screening)是近年来迅速发展起来的药物筛选技术 ,它通过运用基 因科学 、蛋白质科学 、分子药理学 、细胞药理学 、微电子技术等多学科理论和技术 , 以及与疾病相关的酶和受体为作用靶点 ,对天然或合成化合物进行活性测试 , 并在此基础上进行筛选 。 高通量筛选具有快速 、高效 、经济 、高特异性等优点 ,其中所用的样品量甚少的特点 尤其适用于天然化合物的活性筛选,药物高通量筛选技术分类（筛选平台）：分子平台、细胞平台、酵母平台、动物平台,动物平台。前两种平台都是体外模型，有些药物在 体外模型中虽然能够显示良好活性，但是进入动物 体内检测的时候活性却大大降低，甚至没有活性。 主要原因是由于在动物体或人体中， 药物作用的发 挥不仅需要药理活性，还与它的分布、吸收、代谢、 排泄有关。有些体外活性良好的药物，由于脂水分 配系数问题， 导致机体不能吸收，或是不能正确分 布到作用靶位点，所以体内活性大幅度降低。动物 平台是近几年发展起来的新技术，在一些疾病的研 究上已经显现了重要作用，但仍旧需要不断完善。,由于天然药物中成分复杂性及多种成分间可能存在的协同作用 , 因此有效成分的分析 、鉴定和筛选是天然药物开发中的一个难题。同时,许多天然药物临床资料相对不足, 仍需要进行必要的再认识和验证 。面对海量的天然药物 , 高通量筛选技术特有微量 、快速 、灵敏和准确等特点。,特点：理性设计和定向进化,现阶段人们还没有完全掌握对酶的空间构象预测 、结构分析 等技术 , 所以试图通过理性设计达到改善酶特性的目的仍然很 难实现 , 因此 , 通过非理性设计特别是定向进化技术来改造酶 特性的策略依然是人们关注的焦点。 酶的定向进化包括两个重要的步骤 , 首先是变异体库的建立 , 其次是对最适突变体的筛选与鉴定,筛选方法分类：,分光光度测量法和荧光检测法：,Rey mo nd 与其同事利用 伞形酮建立了一种巧妙的 高通量筛选方法优点在于 底物能在比较高的温度或 者比较宽的 pH 范围内保 持稳定 , 并且可以通过构 建不同的底物来检测不同 的酶 。,酸检测法：是一种经常应用于脂肪酶或者酯酶的高通量筛选方法 , 主要包括 pH 指示剂法 、乙酸法以及最近出现的荧光钠盐法 。,荧光钠盐( uoresceinsodium salt ) 是一种具有绿色荧光的有机盐 , 当用该盐作为酶促反应的指示剂时 , 随着反应体系中酸的增加 , 该盐的荧光会逐渐被 H +离子所淬灭 , 因此 , 通过检测其在 495 nm 处吸光值的变化我们便可以检测出酶促反应的速率,酵母表面展示技术 ( Surface Display)是一类筛选蛋白质突 变体库的高通量筛选方法, 在抗体蛋白的研究中应用尤其广 泛, 具有高效、灵敏等特点。,基本原理：将外源目的蛋白基因整合到特定的载体后, 通过 电转或其他的转化方法将其导入酵母细胞, 用酵母细胞内蛋 白转运机制将目的蛋白移至细胞表面并且固定在细胞膜上。,酵母表面展示技术：作为真核表达系统, 它具有的翻译后加工 机制对真核蛋白来的表达来说其优越性是显而易见的 ; 其次, 该方法将酶固定在细胞的表面, 从某种意义上来说它起到了固 定化的效果, 而这种效果有可能显著的提高酶的活力或者对映 选择性; 最后, 它是一种真正意义上的高通量筛选方法, 通过荧 光激活细胞分选系统，每次可以对106 1010个突变体进行筛选,RNA干涉（RNAi）在实验室中是一种强大的实验工具， 利用具有同源性的双链RNA（dsRNA）诱导序列特异的 目标基因的沉寂，迅速阻断基因活性。siRNA在RNA沉 寂通道中起中心作用，是对特定信使RNA（mRNA）进 行降解的指导要素。siRNA是RNAi途径中的中间产物， 是RNAi发挥效应所必需的因子。,因此， 高通量 siRNA 筛选技术也成为生物学最强有 力的研究工具之一,高通量筛选技术在基因领域的应用：,将文库siRNA逐一转染到孔板的每个孔， 72 h后， 基因被沉默降低到一定程度。加入包被I-SceI的腺病毒， 侵染细胞过表达I-SceI。 48 h后， 细胞内sensor上靶点序列被I-SceI切割， 诱导同源重组。 将细胞固定染色， 通过高通量筛选仪器获取信号， 进行分析统计。,逐一筛选法：,包括4个步骤: 针对基因编码区靶点的DNA序列在芯片上合 成后，通过公用的接头， PCR克隆进入慢病毒载体，并包 裹病毒；将慢病毒文库侵染细胞，启动shRNA序列表达的 序列被整合到细胞基因组上，而沉默细胞内该基因的表达； 在特定时间、药物诱导下，存活下来的细胞得以扩增；提 取细胞的基因组，深度测序，找到相应shRNA拷贝数。,文库筛选法：,高通量siRNA筛选的新发展方向：,基于自组装细胞芯片的细胞迁移筛选流程图,自组装细胞芯片是在一张玻璃片上覆盖 PNI膜，通过 刻蚀产生规则的小孔矩阵。PNI 膜具有温度敏感性， 低温下遇水快速溶解， 细胞无法在其上生长。 每个 小孔的孔径可以根据需要进行适当调节， 保证其中 容纳的细胞数在 1 000 个左右，具有统计意义。通过 反向转染，可以在刻蚀产生的小孔内点上 RNAi 文库； 在整个芯片上铺细胞，形成细胞岛，每个小岛就是一 个独立的样本。一张 4 cm2 的芯片上，可以容纳 1212 个点，筛选容量超过一个 96 孔板。自组装芯 片具有良好的平行性，孔与孔之间交叉污染极少，可 以有效地保证实验准,高通量筛选技术具有以下几方面的发展趋势： 采用基于细胞的分析筛选方法，可直接在活细胞内检测化合物，提高筛选的准确性； 采用精确的检测