2014级硕士高级免疫学实验技术elisa课件

高级免疫学实验技术 2014级硕士研究生,吉林大学基础医学院 免疫学系,酶联免疫吸附试验 (Enzyme linked immuno-sorbent Assay, ELISA),间接法-测抗OVA抗体的效价,实验原理,实验分组、试剂与器材,试剂： 封闭液(1%PBS-脱脂奶粉) 7ml 洗液(PBS-Tween20) 1瓶 抗OVA抗体 ml 酶标抗体(HRP-GaM) 5ml 底物 5ml 终止液(H2SO4) 2.5ml,器材： 酶标板 1块 200l pipette 1把 1000 l pipette 1把 Tip (大/小) 若干 1.5ml EP管 若干 培养箱43 1个 吸水纸 若干,四人一组，每人做一排,清点好实验物品 加样器的正确使用 加样器头不能混用，尤其是吸酶和底物 底物应现用现配,包被：用0.05M PH9.6碳酸盐包被缓冲液将抗原(OVA，10g/ml)稀释。 100 l/well加入聚苯乙烯酶标板中，4 over night。 封闭：次日，弃去孔内溶液。加入150 l/well 1%PBS-脱脂奶粉(封闭液), 43 for 60mins。 加样：弃去封闭液，加倍比稀释的抗OVA抗体100 l/孔， 43孵育40mins 。孵育结束后，用PBS-T洗三次，每次5min 。 酶抗：酶标抗体 (HRP-羊抗鼠IgG)，100l/well ，置43孵育40mins，用PBS-T洗三次，每次5min 。 显色：于各反应孔中加入新鲜配制的底物溶液100l/well，室温下避光显色。 终止：加50 l/well 2M硫酸(终止液)。(altering the pH) 判定： 肉眼观察：与阴性对照孔相比有明显呈色反应的为阳性孔，相对应的抗体的稀释度倒数为该抗体的效价。酶标仪测量： 490nm滤光片下测光吸收值(A)，与阴性对照相比其A值2，相对应的抗体稀释度为该抗体的效价。,封闭(blocking),高浓度的无关蛋白质 包被时所用的抗原或抗体浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附。见图：,E,E,E,E,E,E,Coating,Blocking,After blocking,After blocking,Without blocking,Effect of Blocking,最常用的封闭剂：,0.5%-1%的牛血清白蛋白（BSA） 10%的小牛血清 1%明胶,洗液（磷酸盐缓冲液，PBS-T）,磷酸盐缓冲液：（PBS） 吐温20（Tween 20): 抑制蛋白质吸附于塑料表面的非离子型表面活性剂 抑制非特异性吸附,包被：用0.05M PH9.6碳酸盐包被缓冲液将抗原(OVA，10g/ml)稀释。100 l/well加入聚苯乙烯酶标板中，4 over night。 封闭：次日，弃去孔内溶液。加入150 l/well 1% PBS-脱脂奶粉(封闭液）, 43 for 60min。 加样： 弃去封闭液，加倍比稀释的抗OVA抗体100 l/孔，（稀释与加板方法）。 43 孵育40mins。 孵育结束后，用PBS-T洗三次，每次5min 。 酶抗：酶标抗体 (HRP-羊抗鼠IgG)，100l/well ，置43孵育40mins，用PBS-T洗三次，每次5min 。 显色：于各反应孔中加入新鲜配制的底物溶液100l/well，室温下避光显色。 终止： 加50 l/well 2M硫酸(终止液)。(altering the pH) 判定： 肉眼观察：与阴性对照孔相比有明显呈色反应的为阳性孔，相对应的抗体的稀释度倒数为该抗体的效价。酶标仪测量：490nm滤光片下测光吸收值(A)，与阴性对照相比其A值2，相对应的抗体稀释度为该抗体的效价。,样品的稀释,抗OVA抗体（样品）的稀释方法 抗体原液稀释度是1:40,女,女,120l PBS-T,120l 抗OVA抗体 （1：40）,120ul,1:160,1:320,1:640,1:2560,1:1280,1:80,加板方法,1:320,1:640,Ab-,Ag- 1:40,1:1280,1:40,1:80,1:160,1:2560,Ag- Ab-,包被：用0.05M PH9.6碳酸盐包被缓冲液将抗原(OVA，10g/ml)稀释。 100 l/well加入聚苯乙烯酶标板中，4 over night。 封闭：次日，弃去孔内溶液。加入150 l/well 1%PBS-脱脂奶粉(封闭液）, 43 for 60mins。 加样： 弃去封闭液，加倍比稀释的抗OVA抗体100 l/孔， 43 孵育40mins。 孵育结束后，用PBS-T洗三次，每次5min 。 酶抗：酶标抗体 (HRP-羊抗鼠IgG)，100l/well ，置43孵育40mins，用PBS-T洗三次，每次5min 。 显色：于各反应孔中加入新鲜配制的底物溶液100l/well，室温下避光显色。 终止：加50 l/well 2M硫酸(终止液)。(altering the pH) 判定： 肉眼观察：与阴性对照孔相比有明显呈色反应的为阳性孔，相对应的抗体的稀释度倒数为该抗体的效价。酶标仪测量：490nm滤光片下测光吸收值(A)，与阴性对照相比其A值2，相对应的抗体稀释度为该抗体的效价。,Enzyme,常用的酶 辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP) 碱性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP)。 葡萄糖氧化酶、-D-半乳糖苷酶和脲酶等。,包被：用0.05M PH9.6碳酸盐包被缓冲液将抗原(OVA，10g/ml)稀释。100 l/well加入聚苯乙烯酶标板中，4 over night。 封闭：次日，弃去孔内溶液。加入150 l/well 1%BSA-PBS-T(封闭液）, 43 for 60min。 加样：弃去封闭液，加倍比稀释的抗OVA抗体100 l/孔，43孵育40mins。孵育结束后，用PBS-T洗三次，每次5min 。 酶抗：酶标抗体 (HRP-羊抗鼠IgG)，100l/well ，置43孵育40mins，用PBS-T洗三次，每次5min 。 显色：于各反应孔中加入新鲜配制的底物溶液100l/well，室温下避光显色。 终止：加50 l/well 2M硫酸(终止液)。(altering the pH) 判 定：肉眼观察：与阴性对照孔相比有明显呈色反应的为阳性孔，相对应的抗体的稀释度倒数为该抗体的效价。酶标仪测量：490nm滤光片下测光吸收值(A)，与阴性对照相比其A值2，相对应的抗体稀释度为该抗体的效价。,显色,显色原理： HRP催化过氧化物的氧化反应，最具代表性的过氧化物为H2O2，其反应式如下：DH2+ H2O2 D+ H2O。上式中，DH2为供氢体，H2O2为受氢体。在ELISA中，DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物，以便作比色测定。,常用的供氢体： 邻苯二胺(O-phenylenediamine,OPD) 四甲基联苯胺(3,3,5,5-tetramethylbenzidine,TMB) ABTS2,2-azino-di-(3-ethylbenziazobine sulfonate-6),OPD,OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRP结合物最常用的底物。 OPD本身难溶于水，OPD2HCL为水溶性。OPD见光易变质，与过氧化氢混合成底物应用液后更不稳定，须现配置现用。 OPD产物用硫酸终止后，显色由橙红色转向棕黄色。,TMB,TMB经HRP作用后共产物显蓝色，目视对比鲜明。TMB性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与H2O2溶液混和即成应用液，可直接作底物使用。 TMB又有无致癌性等优点，因此在ELISA中应用日趋广泛。酶反应用HCL或H2SO4终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为405nm。,包被：用0.05M PH9.6碳酸盐包被缓冲液将抗原(OVA，10g/ml)稀释。100 l/well加入聚苯乙烯酶标板中，4 over night。 封闭：次日，弃去孔内溶液。加入150 l/well 1%PBS-脱脂奶粉(封闭液）, 43 for 60mins。 加样： 弃去封闭液，加倍比稀释的抗OVA抗体100 l/孔。43孵育40mins。 孵育结束后，用PBS-T洗三次，每次5min 。 酶抗：酶标抗体 (HRP-羊抗鼠IgG)，100l/well ，置43孵育40mins，用PBS-T洗三次，每次5min 。 显色：于各反应孔中加入新鲜配制的底物溶液100l/well，室温下避光显色。 终止：加50 l/well 2M硫酸(终止液)。(altering the pH) 判定：肉眼观察：与阴性对照孔相比有明显呈色反应的为阳性孔，相对应的抗体的稀释度倒数为该抗体的效价。酶标仪测量：490nm滤光片下测光吸收值(A)，与阴性对照相比其A值2，相对应的抗体稀释度为该抗体的效价。,终止:,加50l/孔2M硫酸(终止液)。 (altering the pH) 加入终止液后，液体由橙红变为棕黄色。,包被：用0.05M PH9.6碳酸盐包被缓冲液将抗原(OVA，10g/ml)稀释。 100 l/well加入聚苯乙烯酶标板中，4 over night。 封闭：次日，弃去孔内溶液。加入150 l/well 1%PBS-脱脂奶粉(封闭液）, 43 for 60mins。 加样：弃去封闭液，加倍比稀释的抗OVA抗体100 l/孔。 43孵育40mins 。孵育结束后，用PBS-T洗三次，每次5min 。 酶抗：酶标抗体 (HRP-羊抗鼠IgG)，100l/well ，置43孵育40mins，用PBS-T洗三次，每次5min 。 显色：于各反应孔中加入新鲜配制的底物溶液100l/well，室温下避光显色。 终止：加50 l/well 2M硫酸(终止液)。(altering the pH) 判定：肉眼观察：与阴性对照孔相比有明显呈色反应的为阳性孔，相对应的抗体的稀释度倒数为该抗体的效价。酶标仪测量：490nm滤光片下测光吸收值(A)，与阴性对照相比其A值2，相对应的抗体稀释度为该抗体的效价。,预期结果：,根据显色情况，判定抗体的效价,包被：用0.05M PH9.6碳酸盐包被缓冲液将抗原(OVA，10g/ml)稀释。100 l/well加入聚苯乙烯酶标板中，4 over night。 封闭：次日，弃去孔内溶液。加入150 l/well 1%PBS-脱脂奶粉(封闭液）, 43 for 60mins。 加样：弃去封闭液，加倍比稀释的抗OVA抗体100 l/孔，（稀释与加板方法)。 43 孵育40mins。 孵育结束后，用PBS-T洗三次，每次5min 。 酶抗：酶标抗体 (HR