分子生物学技术28763ppt课件

,分子生物学技术的原理及应用 The Popular Technology in Molecular Biology: Principle and Application,一、分子杂交与印迹技术 Molecular Hybridization & Blotting Technology,核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex) 。,复性,RNA,DNA,探针 (probe) 一小段用同位素、生物素或荧光染料标标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。,（一）分子杂交,斑点杂交：dot blotting DNA array DNA chips 蛋白质芯片 原位杂交：细胞原位杂交 组织原位杂交,DNA点阵,目 录,目 录,是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。,蛋白质芯片(protein chip),（二）转移印迹技术,（一）DNA印迹技术 (Southern blotting) 用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。,（二）RNA印迹技术 (Northern blotting) 用于RNA的定性定量分析。,（三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting) 用于蛋白质定性定量及相互作用研究。,目 录,三种印迹技术的比较,放射自显影照片,目 录,二、聚 合 酶 链 反 应 Polymerase Chain Reaction,模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+,（一）PCR反应条件,5,Primer 1,5,Primer 2,5,5,Template DNA,（二）基本工作原理,目 录,目 录,（三）PCR的基本反应步骤,变性 95C,延伸 72C,退火 Tm-5C,1. 目的基因的克隆 2. 基因的体外突变 3. DNA和RNA的微量分析 4. DNA序列测定 5. 基因突变分析,（四）PCR的主要用途,（五）几种重要的PCR衍生技术,1. 反转录PCR技术 2. 原位PCR技术 3. 实时PCR技术,实时PCR技术原理,目 录,三、核 酸 序 列 分 析 Nucleic Acid Sequence Analysis,核酸序列分析的方法：,化学裂解法 (Maxam-Gillbert法),DNA链的末端合成终止法 (sanger法),（一）化学裂解法(Maxam-Gillbert法),基本原理,基于某些化学试剂可以使DNA链在1个或2个碱基处发生专一性断裂的特性，精确地控制反应强度，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同分子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同的DNA片段，将这些片段经电泳分离。 分析前，用同位素标记DNA的5末端，经放射自显影即可在X胶片上读出DNA链的序列。,基本步骤,将DNA的末端之一标记上放射性同位素（32P） 再对DNA样品分别进行多组具碱基特异的、随机的不完全的化学修饰 在修饰碱基位置化学法断开DNA链 通过具有可分辨长短仅一个核苷酸之差的PAGE电泳，将DNA断裂片段按分子大小分开 根据放射自显影胶片上显示的末端标记片段的分布情况，直接读出DNA的核苷酸序列。,5 HO-GATCGGACCT 3 标记 5 32P-GATCGGACCT 3 不完全修饰 修饰G 修饰G和A 修饰T和C 修饰C 化学裂解 电泳分离 G G+A T+C C 全长核酸 ,（二）DNA链末端合成终止法,目 录,（三）DNA自动测序,采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。,DNA自动测序结果举例,目 录,四、基 因 文 库 Gene Library,基因组DNA文库 (genomic DNA library) cDNA文库 (cDNA library),基因文库 (gene library),是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。,基因组DNA文库,目 录,第一轮筛选,第二轮筛选,第三轮筛选,基因组文库筛选结果举例,五、遗传修饰动物模型的建立及应用,The Establishment and Application of Heredity-Modified Animal Model,转基因技术 采用基因转移技术使目的基因整合入受精卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子宫，使之发育成个体。,转基因被导入的目的基因 转基因动物(transgenic animal) 目的基因的受体动物,（一）转基因技术,目 录,核转移技术克隆动物 即动物整体克隆技术，将动物体细胞核全部导入另一个体的去胞核的受精卵内，使之发育成个体，即克隆(clone)。,（二）核转移技术,基因剔除技术 也称基因靶向(gene targeting)灭活，有目的去除动物体内某种基因的技术。,（三）基因剔除技术,六、蛋白质相互作用研究技术,Research Technology of Interaction of Protein,蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主要完成者。几乎所有的重要生命活动，包括DNA的复制与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢等等，都离不开蛋白质之间的相互作用。,蛋白质之间相互作用研究的重要性,酵母双杂交 各种亲和分析（亲和色谱、免疫共沉淀等） 荧光共振能量转换效应分析 噬菌体显示