辽宁省科技进步奖申报书及填写说明.doc

辽宁省科学技术奖励申报书（适用于自然科学奖、技术发明奖、科技进步奖）一、项目基本情况奖种：科技进步奖 学科（专业）评审组代码：2093 序号： 编号：项目名称中 文中药复方治疗缓慢性心律失常的机制与药效研究英 文The mechanism and efficacy research of the compound Chinese medicine treating tardy arrhythmia主要完成人侯平主要完成单位 推 荐 单 位（盖 章）项目名称可否公布可 否所获奖励或推荐专家(名单) 密级及保密期限无密级主 题 词 缓慢性心律失常；中药复方；机制；药效学科（专业） 分 类 名称： 代码： 3 6 0 3 0 所属国民经济行业ABCDEFGHIJKLMNOP任务来源 A国家计划 B部、委 C省、市、自治区 D基金资助 E国际合作 F其他单位委托 G自选 H非职务 I其他计划(基金)名称和编号项目起止时间 起始： 2009年 1月 1日 完成： 2014年 1月 1日1二、项目简介 （项目所属科学技术领域、主要内容、特点及应用推广情况）本研究通过总结中医药治疗缓慢性心律失常概况，选取典型治法和方药进行临床疗效观察与作用机制探讨。研究中采用中药复方参仙升脉口服液，该方由红参、淫羊藿、丹参等8味药组合而成,功能温补心肾、活血化瘀,用于治疗心肾阳虚、血瘀寒凝、脉络受阻所致脉迟证。观察其对缓慢性心律失常患者心率与生活质量的影响。从分子生物学角度探讨中药复方治疗缓慢性心律失常的机制，建立缓慢性心律失常大鼠模型，采用以下关键技术:1.应用免疫组化及Leica Q550CW图象采集和分析系统检测中药干预前后大鼠cAMP/cGMP、Na+-K+-ATP 酶的活性及缝隙连接蛋白CX45表达。2.应用胶原酶酶解分离法对心室肌细胞单离，应用膜片钳全细胞记录技术观察主要有效成分对大鼠心肌细胞离子通道电流Ca2+i和Na+i的变化。3.应用超声影像学观测中药复方干预前后缓慢性心律失常大鼠心律及心脏功能参数的变化。本研究创新点在于从多个分子生物学角度揭示中药复方治疗缓慢性心律失常机制：1.中药复方通过调整阴阳，提高缓慢性心律失常大鼠cAMP/cGMP、Na+-K+-ATP酶活性，增强缝隙连接蛋白Cx45的表达。2.采用目前最前沿的膜片钳技术，观察中药有效成分单体对大鼠心肌细胞离子浓度及离子通道的影响。3.应用超声影像学技术评价中药复方对缓慢性心律失常疗效。将研究结果以“中药复方对缓慢性心律失常大鼠缝隙连接蛋白CX45的影响”、“中药复方对缓慢性心律失常大鼠离子通道变化的影响”、“中药复方干预后缓慢性心律失常大鼠心脏超声下改变研究”为查新点，国内未见相同研究的文献报道，可知本项目率先在国内进行了中药复方治疗缓慢性心律失常的机制与药效研究，为药物治疗缓慢性心律失常开辟了新途径，填补了西药在该领域中长期应用的空白，也从多角度揭示了中药治疗缓慢性心律失常的机制，为其临床治疗中的应用提供了有力的客观依据。目前在我市多家医院临床应用都收到了良好的经济效益与社会效益。本项目已发表学术论文共20篇，出版著作1部，培养博士研究生1人，硕士研究生7人。（不超过800个汉字）2三、项目详细内容1立项背景缓慢性心律失常是因起搏传导系统退行性改变导致的一类疾病，随着社会人口老龄化速度加快，该类疾病发病率上升，2020年我国65岁以上老龄人口将达1.67亿人，约占全世界老龄人口6.98亿人的24%。缓慢性心律失常在引发心脏性猝死的心律失常中占到17%-20%的比率，且严重影响患者的生活质量。该疾病的治疗措施目前有药物治疗和起搏治疗两种，起搏治疗作为一种新的治疗手段，由于技术普及率低、治疗费用高、治疗方法有创，使大部分患者难以接受，药物治疗缓慢性心律失常仍然是一个重要的手段。西药目前只能选用增强自律性或传导性药物，如拟交感神经药物（异丙肾上腺素等）、迷走神经抑制药（阿托品等）。上述两类药物的剂型及副作用限制了其临床治疗中的长期应用，目前尚无该病治疗中能够选择长期口服的西药，因此探寻中医药治疗缓慢性心律失常具有十分重要的意义。早在汉代张仲景的伤寒杂病论中就有关于心律失常方面的记载，其言：“心动悸，脉结代”，是对该类疾病脉象的具体描述。中医治疗该类疾病有悠久的历史，但缺少令人信服的临床疗效证据与治疗机制。从近年来发表的缓慢性心律失常相关文献总结，中医药治疗缓慢性心律失常或从辨证论治，或选取经方，或用中成药物，均报道了良好的临床疗效。但对药物的作用机理，对取得良好疗效的机制，所做探讨在科研设计、科研水平上较为粗浅，尚无从分子生物学等先进角度出发进行高水平研究。西医学对缓慢性心律失常从分子生物学的角度得到了很多新的观点和信息，但一般都选取或立足单一角度，缺乏系统的研究，对其发病机制目前也无公认的学说。本项目根据临床实际，梳理文献内容，认为心肾阳虚为缓慢性心律失常发病之本, 血脉瘀阻为缓慢性心律失常发病之标，针对此病因病机，建立温补心肾、活血祛瘀大法，选用典型中药复方进行研究。（不超过800个汉字）32详细科学技术内容见第九页 （纸面不敷，可另增页）43 发现、发明及创新点：本研究率先在国内从分子生物学水平进行中药复方治疗缓慢性心律失常的机制与药效研究，秉承中医古法，总结缓慢性心律失常中医证治概况，归纳出该病的中医病因病机，选取典型中药复方，从多个分子生物学角度揭示中药复方治疗缓慢性心律失常机制：1. 应用免疫组化及Leica Q550CW图象采集和分析系统检测中药干预前后大鼠cAMP/cGMP、Na+-K+-ATP 酶的活性及缝隙连接蛋白CX45表达。发现中药复方可提高缓慢性心律失常大鼠cAMP/cGMP、Na+-K+-ATP酶活性，增强缝隙连接蛋白Cx45的表达。2. 应用胶原酶酶解分离法对心室肌细胞单离，采用膜片钳全细胞记录技术，观察中药有效成分单体对大鼠心肌细胞离子浓度细胞内钙离子浓度、高电压依赖性钙离子通道、钠电流的影响。3.应用超声影像学技术评价中药复方对缓慢性心律失常疗效。发现缓慢性心律失常大鼠心肌功能减低；中药复方治疗后大鼠每搏量提高，说明其能提高缓慢性心律失常大鼠心肌功能。（不超过400个汉字）4保密要点：（不超过100个汉字）55 与当前国内外同类研究、同类技术的综合比较1.在研究方向方面，查阅缓慢性心律失常相关研究文献及成果，中医药治疗缓慢性心律失常类研究，大多为采用验方或经方进行缓慢性心律失常治疗的临床或实验观察，实验方案多以检测心率或窦房结功能为主，较为局限或单一。本研究从整体上研究中药复方对心率、心功能的影响，借助于先进的分子生物学手段，在分子水平和离子通道角度深入探讨中医药治疗缓慢性心律失常的机制，目前国内尚无同水平研究的相关报道。2.在技术成熟度方面，本研究传承“迟缓脉属虚寒”理论，使用温补心肾、活血逐瘀方药，疗效确切。而细胞移植等心脏生物起搏研究目前还处于动物实验阶段，排斥反应、靶基因选择、潜在的致心律失常作用、安全性等诸多问题尚未解决。3.在应用推广方面，起搏治疗是目前西医学中治疗缓慢性心律失常的主要有效手段，但费用昂贵、技术普及率低。而中药复方费用相对较低，无论从剂型、价格、药效都将使患者有很好耐受性与依从性，降低医疗费用支出，减轻患者治疗损伤，具有更好的经济效益与社会效益。 6（不超过800个汉字）6应用情况缓慢性心律失常主要是心脏起搏传导系统退行性改变导致的一类疾病，随着年龄增高，该类疾病发病率逐渐上升。中药治疗缓慢性心律失常安全性好，价格相对较低，患者依从性好。本研究选取典型中药复方，从分子水平深入揭示其治疗缓慢性心律失常的作用机制，并观察其临床疗效。从2010年始，3次参加国际会议、多次参加国内高水平会议，通过讲座与发表大会论文等形式，将实验方案与结果与国内外同行进行学术交流与分享，获得了同行的认可，2010-2012年每年举办心律失常学习班1次。目前本研究成果已在我市五所医院（辽宁中医药大学附属医院、辽宁中医药大学附属二院、辽宁中医药大学附属四院、辽宁省人民医院、沈阳医学院附属中心医院）展开应用，年均治疗病人2000例以上，自2009年起累计治疗病人10400余例，治疗有效率95%以上。 (根据新应用证明调整）成果转化、推广或产业化方面还需帮助解决的问题77经济、社会效益单位：万元人民币项目总投资额回收期 栏目年份新增产值（推广面积:万亩）新增利润(增产:万斤)新增税收（增收）创收外汇节支总额累计 经济效益额的计算依据：每例患者起搏治疗总费用平均在5万元左右，使用寿命约6-8年左右，平均费用达6500元/年；而中药复方治疗费用平均2000元/年，人均年减少医疗费用约4500元，经济效益比差异十分明显。目前在我市五所医院年均治疗病人2000例，年均收入增加400万元，降低医疗支出900万元，5年累计治疗患者近10400例，经济效益总额达2000余万元，减少医疗支出4500余万元。 (根据新应用证明调整） 社会效益：我国目前已进入老龄化社会，2020年我国65岁以上老龄人口将达1.67亿人，约占全世界老龄人口6.98亿人的24%，全世界四个人中就有一个是中国老年人。缓慢性心律失常做为一种传导系统的退行性改变疾病，随年龄增高发病呈显著增高趋势，远期预后差，致死和致残率高。该领域西医尚缺乏能够长期口服的药物应用。心脏起搏治疗是目前缓慢性心律失常诊治中最常用的手段，但为有创治疗，且费用昂贵，技术尚未大范围普及，患者依从性相对较差。中药治疗有很好的耐受性和依从性，更容易被相应患者接受，可更大程度的普及，使该类患者获益，并能降低医疗成本。观察五所医院应用中药复方治疗缓慢性心律失常情况，治疗总有效率达95%左右，使部分患者减少了起搏器的使用，明显节省医疗资源的支出。另外，随着本研究对中药复方治疗缓慢性心律失常机制的揭示及其临床疗效的证实，必将增加医生对其应用的信心，提高临床使用率，收到了良好治疗效果的同时也获得良好的社会经济效益。 (根据新应用证明调整）*本栏目自然科学奖可不填写8四、本项目曾获科技奖励情况获奖时间奖 励 名 称奖励等级授奖部门2013年沈阳市科技进步奖一等奖沈阳市科技局本表所填科技奖励是指： 1.各市政府和厅（局）设立的科技奖励； 2.经省科技厅批准的社会力量设立的科技奖励，但不包括商业性的奖励。五、获得授权专利情况表国 别专 利 号项 目 名 称9六、主要完成人情况表第1完成人姓名侯平 性 别女民族汉族出生地 辽宁 省 葫芦岛 市出生日期 1963 年 05 月 07 日党 派无党派人士 何国华侨工作单位辽宁中医药大学附属医院联系电庭住址 住宅电话 通讯地址及邮政编码 沈阳市皇姑区北陵大街33号，110032电子信箱H毕业学校辽宁中医药大学文化程度研究生学 位硕士职务、职称科主任，教授、主任医师专业、专长中西医结合心血管毕业时间2012.7外语语种英语熟练程度具备一定的听说读写能力 曾获奖励及荣誉称号情况： 获奖：中药复方治疗缓慢性心律失常的机制与药效研究 XXXXXXX缺血性二尖瓣反流机制探讨和干预的临床研究 2010J-2-65-02中医治法在病毒性心肌炎中的应用与研究 2011J-2-82-04冠心病中医证候及治法研究 2010J-2-73-06誉称号：2012年被评为第十届“沈阳市优秀科技工作者”。 参加本项目的起止时间 2009年 1 月 至 2014 年 1 月 创 造 性 贡 献 作为该项目的负责人，参与了课题自立项、方案讨论、试验、归纳、总结、检索、鉴定的全过程。在课题研究、实施的过程中，制定方案、组织工作并进行指导。始终关注和强调课题的工作进展情况、处理方案、试验结果以及经济效益，对该项目的研究成功起了决定性的作用。 本人签名：_ 年 月 日1010七、主要完成单位情况表单位名称第完成单位单位性质联系人联系电话传 真电子信箱通讯地址及邮政编码主要贡献 单位盖章 年 月 日11 八、推荐、评审意见推荐意见 负责人签 字 推 荐 单 位 （公 章） 年 月 日初评意见 学科（专业）评审组组长签字 年 月 日13评审意见辽宁省科学技术奖评审委员会（公章） 年 月 日审定意见辽宁省科学技术奖励委员会（公章） 年 月 日14九、详细科学技术内容（不超过15页）中药复方治疗缓慢性心律失常的机制与药效研究 技术总结报告（一）中医理法方药分析 缓慢性心律失常是以心率减慢为特征的一类心律失常，主要包括窦性心动过缓、病态窦房结综合征、窦房传导阻滞、房内传导阻滞、束支传导阻滞、室上性和室性逸搏等疾病。缓慢性心律失常辨证论治常属于中医学心悸、胸痹、脉结代、昏厥、怔忡、眩晕等范畴。以眩晕、心悸、气短、胸闷甚至昏厥等症状为主，其脉证均以迟缓为特征，属于缓脉、迟脉、结脉等范畴。中国古代医家大多认为此类病证是由气虚血寒、阳虚阴盛、脏腑虚损所致，治疗大多采用温补之法。查阅文献，现代医家多参照“厥脱”“心悸怔忡”胸痹”“虚损”等病证门类的临床治疗思路进行辨证论治。认为其常见病因为感受外邪(如风、寒、暑、湿、燥、火或厉气等) 的侵袭，七情内伤（长期的情志抑郁或情志不舒），饮食失节，嗜好烟酒等辛辣之品等。本研究据古引今，认为心肾阳虚为缓慢性心律失常发病之本，血脉瘀阻为缓慢性心律失常发病之标，心肾阳虚、血脉瘀阻是缓慢性心律失常的基本病理变化。心肾阳虚可导致血脉瘀阻的病理改变的出现，血脉瘀阻会进一步加重心肾阳虚，二者互为因果，相互影响。只有将心肾阳虚和血脉瘀阻有机结合起来，才能正确反应缓慢性心律失常发生的病理变化，才能抓住治疗关键。 针对缓慢性心律失常心肾阳虚、血脉瘀阻的基本病机，建立温补心肾、活血祛瘀大法，药物红参、淫羊藿、补骨脂（盐炙）、枸杞子、麻黄、细辛、丹参、水蛭组成。红参:味甘、微苦，温。归脾、肺、心经。 神农本草经曰:“主补五脏，安精神，定魂魄，止惊悸。”药性论谓之:“主五脏气不足，五劳七伤，虚损痞弱，补五脏六腑，保中守神。”主治秘要“补元气，止渴，生津液”。本草经疏云:“人参能回阳气垂绝，却虚邪于俄顷益真气，则五脏皆补矣。”遵生八笺则云：“润肺生津，生气生脉。” 本草从新“大补元气，生阴血，亦泄虚火。”医学起源云：“治脾肺阳气不足补中缓中。”得宜本草:“能通行十二经。”本草要略言其“通经活血”。红参有大补元气，复脉固脱，益气摄血。用于体虚欲脱，肢冷脉微，气不摄血，崩漏下血；心力衰竭，心源性休克。淫羊藿:味辛、甘，温。归肝、肾经。本草纲目：“淫羊藿，性温不寒，能益精气，真阳不足者宜之。”日华子本草：“治一切冷风劳气，补腰膝，强心力，丈夫绝阳不起，女子绝阴无子，筋骨挛急，四肢不任，老人昏耄，中年健忘。”主治功能：补肾阳，强筋骨，祛风湿。补骨脂:味辛、苦，性温。归肾、心包、脾、胃、肺经。本草纲目：治肾泄，通命门，暖丹田，敛精神。本草经疏：补骨脂，能暖水脏；阴中生阳，壮火益土之要药也。其主五劳七伤。主治功能：补肾助阳；纳气平喘；温脾止泻。主肾阳不足；下元虚冷；腰膝冷痛；阳痿遗精；尿频；遗尿；肾不纳气；虚喘不止；脾肾两虚；大便久泻。枸杞子:味甘，性平。归肾、肝经。药性论:“能补益精诸不足，易颜色，变白，明目，安神。”食疗本草:“坚筋耐老，除风，补益筋骨，能益人，去虚劳。”王好古:“主心病嗌干，心痛，渴而引饮，肾病消中。”纲目:“滋肾，润肺，明目。”主治功能：滋肾，润肺，补肝，明目。治肝肾阴亏，腰膝酸软，头晕，目眩，目昏多泪，虚劳咳嗽，消渴，遗精。细辛：味辛，性温，小毒。归肺、肾、心经。本草纲目:“细辛辛香性温而善走窜，开窍启闭，温通血脉而止痛。”医林纂要药性云“润肾，直达命门之气，以窜达于九窍百骸，潜通咽后。”。主治秘要：“止诸阳头痛，诸风通用之。辛热，温阴经，散水寒，治内寒。”医学启源:“辛热，温阴经，散水寒，治内寒。”。药性论“开胸中滞”。名医别录：“温中下气，破痰，利水道，开胸中安五藏，益肝胆，通精气。”细辛功可散寒祛风，通窍止痛，温肺化饮。麻黄:味辛、苦，性温，入肺、膀胱经。本草求原:“气温入肝，味苦入心”。日华子本草:“通九窍，调血脉，开毛孔皮肤，逐风，破癥瘕积聚，逐五脏邪气。”汤液本草云:“气温，味苦甘而苦。气味俱薄，阳也，升也。甘热纯阳。手太阴之剂。入足太阳经，走手少阴经、阳明经药。”。麻黄功能发汗解表，宣肺平喘，利水消肿。丹参：味苦，性微寒。归心、心包、肝经。本草纲目：“破宿血，补新血，调经脉”。神农本草经：“破癥除瘕，止烦满，益气”。妇人明理论“一味丹参散，功同四物汤”。本草正义“丹参专入血分，功在活血行血，达脏腑而化瘀滞”。景岳全书“能养血活血，生新血，行宿血，亦能养阴定志”。丹参功能活血通经、祛瘀止痛、养血安神。水蛭：味咸苦，性平，有毒。入肝、膀胱经。本经：主逐恶血、瘀血、月闭，破血瘕积聚，无子利水道。汤液本草：水蛭，苦走血，咸胜血，仲景抵当汤用虻虫、水蛭，咸苦以泄畜血，故经云有故无殒也。本草经疏：水蛭，味咸苦气平，有大毒，其用与虻虫相似，故仲景方中往往与之并施。咸入血走血，苦泄结，咸苦并行，故治妇人恶血、瘀血、月闭、血瘕积聚，因而无子者。血畜膀胱，则水道不通，血散而膀胱得气化之职，水道不求其利而自利矣。堕胎者，以具有毒善破血也。功能主治：破血，逐瘀，通经。治蓄血，症瘕，积聚，妇女经闭，干血成痨，跌扑损伤，目亦痛，云翳。 组方配伍特点：（1）温阳活血同施。素问通评虚实论“邪气盛则实，精气夺则虚”，“实则泻之，虚则补之”。方中以红参、淫羊藿、补骨脂（盐炙）、枸杞子、麻黄、细辛温补心肾，以水蛭、丹参活血祛瘀。诸药合用，通补兼施，活血而不伤正，温阳而不凝滞，二法并用，相辅相成。（2）标本兼顾。黄帝内经：“间者并行，甚者独行”，“治病必求于本”。缓慢性心律失常为起搏传导系统退行性改变所致疾病，病情复杂，虚实夹杂，病情变化多端。但其核心病机仍以心肾阳虚为本，血脉瘀阻为标。治疗当标本兼顾，以治本为主，兼以治标。温阳益气与活血化瘀同用。(二)、项目主要研究内容1 实验材料1.1 实验动物SPF级SD雄性大鼠48只（鼠龄9m、24m各24只），体重200350g，许可证号：SLXK京2009-0004，北京华阜康生物科技股份有限公司提供。1.2 实验药品麻黄碱（南京泽朗医药科技公司，98.0%），-细辛醚（Sigma，批号03124JRV，70%），去甲乌药碱（南京泽朗医药科技公司，98.0%），胶原酶V（Sigma，美国） 参仙升脉口服液：红参、淫羊藿、补骨脂（盐炙）、枸杞子、麻黄、细辛、丹参、水蛭。厂家：山东步长制药有限公司，批号：国药准字Z20080183 1.3 主要试剂10%水合氯醛：取10g水合氯醛溶于ddH2O，定容至100ml，室温保存。0.1MPBS（DEPC水）：取30.8gNa2HPO4，2.8gNaH2PO4和8.5gNaCl溶于ddH2O，定容至1000ml，加1mlDEPC，搅拌混匀后过夜，次日高压消毒30min，室温保存。4%多聚甲醛（DEPC-PBS）：取8g多聚甲醛溶于0.1MPBS（DEPC水），定容至200ml，现用现配。兔抗大鼠Cx45一抗及SP、DAB显色试剂盒均由北京博奥森生物技术有限公司提供。cAMP/cGMP、Na+-K+-ATP酶试剂盒：南京建成生物工程研究所提供1.4 主要仪器及设备数码显微镜，OLYMPUS BX41型。日本OLYMPUS公司生产。生物显微镜，CHA型，日本OLYMPUS公司生产。体温计 本校实验动物中心提供安图斯anthos2010型酶标仪 奥地利产品电热恒温培养箱，HHB11500型，上海跃进医疗器械厂生产。微量移液器，美国热电公司生产。全自动真空组织脱水机 爱华TSJ-1天津航空机电公司生物组织包埋机 BMJ-1 LEICARM 2135 德国原装光学显微镜 OLYMPUSBHS CH-2 日本产品美国百胜 Havmorlic Au-5全自动五分类多物种血液分析仪 HEMAVET950 美国产品脱水机，LEICA 300型，德国徕卡公司生产。石蜡包埋机，EG1150型，德国徕卡公司生产。切片机，LEICA RM2235型，德国徕卡公司生产。心电图电脑软件PCLAB生物信号采集处理系统 北京微信斯达科技发展有限责任公司eppendorf微量称液器 德国产品离心机LDJ4-0.8 北京医用离心机厂r自动计数仪 Packard公司生产5302型激光扫描共聚焦显微镜（FV1000S-SIM/IX81，日本OLYMPUS）P-97 Flaming/Brown Micropipetter Puller（美国Sutter instrument company）MultiClamp700B（美国Axon）pClamp9数据分析软件（美国Axon）抛光器（MF-9，Narishige）CF7D2型离心机（Hitachi Himac）。心功能检测仪器：利用超声PHILIPS 7500，探头为高频经食管超声10MHz。2 实验方法2.1 实验动物的饲养2.1.1 分组 SPF级SD雄性大鼠36只,体重200250 g,北京华阜康生物科技股份有限公司提供,许可证号:SLXK京2009-000436只大鼠随机分为空白对照组模型组和治疗组(参仙升脉口服液),每组12只,单笼饲养2.1.2 饲养SPF级SD雄性大鼠36只,体重200250 g每日8时给予模型组大鼠和治疗组大鼠普萘洛尔15 mgkg-1d-1,给予空白对照组大鼠淀粉片15 mgkg-1d-1每日14时给予治疗组大鼠参仙升脉口服液0.2 ml/只灌胃,模型组及空白对照组大鼠给予生理盐水0.2 ml/只灌胃,连续7 d第8天早晨测定各组大鼠心率后,乌拉坦麻醉取材并检测指标2.1.3心脏超声检测：采集心脏的二维、M型超声心动图像和脉冲多普勒检测血流频谱，测量评价心脏结构和功能的各项参数。每一测量点记录5个心动周期;由获得M型心动图测量心率(HR)，左室舒末期内径,左室收缩末内径，左室短轴缩短率(FS%)和射血分数(EF%)。利用经食管超声探头我们对2只大鼠图象不满意，其余大鼠均可获得反映心脏结构和功能的二维、M型超声心动图及反映心脏血流动力学的血流频谱。2.2 实验步骤：严格按照试剂盒说明书 进行2.2.1 石蜡切片制备2.2.2 HE染色2.2.3 免疫组化步骤2.2.4 Cx45灰度值测定将切片染色后，选取染色良好区域，应用Leica Q550CW图象采集和分析系统，将每张切片在显微镜下(400倍)选取5个互不重叠视野，测定单位面积阳性细胞表达的灰度平均值作为其表达情况，取均值为一只大鼠该蛋白的表达结果。此系统将白色灰度值设定为255，将黑色灰度值设定为0，故灰度值越高，表达越弱。2.2.5 心肌细胞离子电流变化测定急性心室肌细胞单离：动物麻醉后迅速开胸取出心脏，置于4C预冷0.9%L氯化钠注射液中冲洗，剪开心包，经主动脉插管悬挂与改良的Langendorff灌流装置上，依次用正常台氏液（含(mM) 143 NaCl, 5.4 KCl, 0.30 NaH2PO4, 5 HEPES, 5.5 glucose, 0.5 MgCl2, and 1.8 CaCl2 (NaOH 调pH 7.4)、低钙台氏液（Ca2+浓度为20-70 mol/L）经主动脉根部逆行灌流，当心脏跳动完全停止时，改用含胶原酶V（0.3mg/ml）的台氏液消化20-30min，再以Kraftbrune（KB）液（mM: KOH 70,Glutamic acid 50,KCl 40,KH2PO4 20,Taurine 20,MgCl2 3,Glucose 10, HEPES 10, CaEGTA 0.5, HCl调pH 7.4）灌流，除去胶原酶后，将心室取下在KB中缓慢吹打孵化，过滤离心后，将心室肌细胞置于KB液中稳定冷藏保存4-8h内使用。整个灌流系统温度保持在37C，所有液体均用95% O2+5% CO2饱和。荧光探针标记：将急性单离心室肌细胞接种于经0.01%多聚赖氨酸包被的激光共聚焦测钙专用NEST细胞培养皿上静止30min。待细胞完全贴壁后移去培养皿内液体，将198 L正常台氏液和2 L Ca2+荧光探针染料Fluo-3/AM（终浓度为5mol/L）混匀后加入培养皿小室中，37 孵箱避光孵育45 min，使Fluo-3/AM与Ca2+充分结合。测定前用正常台氏液清洗3次，加入200 L含钙或无钙台氏液待测。将培养皿置于激光扫描共聚焦显微镜（FV1000S-SIM/IX81，日本OLYMPUS）载物台上，在光镜下找到形态完整、横纹清晰的细胞，对其进行扫描（频率为0.2 Hz）。膜片钳全细胞记录技术：根据Hamill等方法进行全细胞膜片钳记录实验。吸几滴细胞悬液加入细胞池中，置于倒置显微镜（IMT-2，Olympus）工作台上，放置10min左右，待细胞贴壁后用台氏液持续灌流，流速为3ml/min，温度保持在252C，选择表面光洁、横纹清楚的细胞作为实验对象，利用三维液压微操纵器（MO-203，Narishige）移动电极，并轻压在细胞表面，用负压使电极尖端与细胞膜表面形成G高阻封接后，再以较大负压吸破细胞膜，补偿电容电流及电极串联电阻，形成全细胞记录。记录信号经Ag-AgCl电极引导，电流经放大器（Axopatch 700B，美国Axon）放大，再经Digidata 1440进行A-D转换采集数据，由pClamp10.0软件处理和分析。用P-97电极拉制器（Sutter instrument company）将玻璃微电极拉制后，经抛光器（MF-9，Narishige）抛光，充灌电极内液后尖端阻抗为5-10M。电极内液组成为（mM）CsCl 130, HEPES 5, MgCl2 1, K2ATP 5, CPK 5, EGTA 1, CsOH 调pH至 7.2。电极外灌流液为台氏液。 Ca2+i变化测定：Fluo-3AM被动扩散进入细胞后，被酯酶水解释出Fluo-3，Fluo-3与Ca2+络合，在488 nm处的激光激发而产生荧光，其荧光值与Ca2+i呈正相关，即以荧光值变化表示Ca2+i变化，以平均荧光强度代表Ca2+i。激发波长为488nm，发射坡长526nm。先测定静息状态下Ca2+i水平，再加入相应浓度的试药麻黄碱、-细辛醚或去甲乌药碱，观察细胞内Ca2+i的动态变化情况。 细胞内Na+浓度（Na+i）变化的测定 胶原酶酶法分离单个豚鼠心室肌细胞，应用膜片钳全细胞模式记录钠电流。在电压钳状态下，由-120 mV的保持电位去极化到+20 mV，刺激电压持续50 ms，记录到一个快速失活的电流，即电压依赖性钠电流。观察细辛醚给药前后该电流值大小的改变。3 结果 3.1 各组大鼠心率统计结果 与空白组相比,模型组大鼠心率降低(P0.01);与模型组相比,中药复方治疗组大鼠心率明显升高(P0.01)见表13.2 各组大鼠心肌组织中Cx45蛋白的表达 与空白组相比,模型组缝隙连接蛋白Cx45表达降低(P0.01);与模型组相比,参仙升脉组缝隙连接蛋白Cx45表达升高(P0.01)见表23.3 与空白对照组相比，模型组大鼠Na+-K+-ATP酶的活性明显降低（p0.01）；与模型组相比，参仙升脉组大鼠Na+-K+-ATP酶的活性明显升高（p0.05）。3.4与空白对照组相比，模型组大鼠cAMP含量降低（p0.01），cGMP含量升高（p0.01，cAMP/cGMP比值降低（p0.01）；与模型组相比，参仙升脉组大鼠cAMP含量升高（p0.05），cGMP含量降低（p0.01），cAMP/cGMP比值升高（p0.01）。3.5与空白对照组相比，模型组大鼠心率降低（p0.01），左室射血分数明显增加（p0.01）；与模型组比较，参仙升脉组心率升高（p0.01），射血分数没有明显变化，心输出量增加。3.6 麻黄碱、-细辛醚和去甲乌药碱对细胞内钙离子浓度的影响表6所示，Fluo-3/AM荧光探针法表明，2M麻黄碱使单离大鼠心肌细胞Ca2+i升高，达给药前浓度的122.996.93%，有统计学意义。而2M细辛醚和2M去甲乌药碱则使Ca2+i下降约17%和11%，与给药前相比有显著差异性。-细辛醚使心肌细胞Ca2+i降低作用与其在皮质神经元的作用基本相同。 表6.急性单离大鼠心肌细胞Ca2+i变化。注：*，与给药前相比，t-检验P0.01。细胞内钙离子浓度的升高来源有细胞内钙释放和外钙内流两途径。当细胞外液钙浓度降为零时，细胞内钙离子浓度升高与外钙内流无关。因此，2 M 麻黄碱使Ca2+i升高的钙离子来源可通过细胞外液钙离子浓度为零确定。实验结果见表7，在细胞外钙为零时，2 M 麻黄碱不再使Ca2+i升高，说明麻黄碱可使细胞外钙离子通过通道流入而使Ca2+i升高。表7. 细胞外液钙浓度变化对2 M 麻黄碱在单离大鼠心肌细胞引起Ca2+i变化的影响。注：*， P0.01，与给药前相比，经t-检验呈显著性差异。3.7 麻黄碱、细辛醚和去甲乌药碱对高电压依赖性钙离子通道的影响全细胞电压钳法测定心肌细胞高电压依赖性钙离子电流。设定保持电位-40mV，指令电压为-50 +50mV，步阶电压10mV，刺激频率为2Hz，刺激间隔为6s，记录ICa。为消除细胞间误差，电流值以电流密度（pA/pF）表示。2M麻黄碱显著提高了心肌细胞约30%ICa峰电流密度（见表8、表9），由给药前的1.650.08 pA/pF升高至2.150.27 pA/pF，与Ca2+i变化呈相同趋势，说明麻黄碱对于钙离子流动的影响在于可使细胞膜电压依赖性的钙通道开放，钙离子大量流入细胞内，从而使Ca2+i升高。而2M-细辛醚和2M去甲乌药碱并未提高心肌细胞ICa峰电流密度，相反有下降趋势，也与其对Ca2+i的影响呈同向，但尚未有统计学意义（见表9）。表8 2M麻黄碱给药前后I-V曲线变化图。设定保持电位-40mV，指令电压为-50 +50mV，步阶电压10mV，刺激频率为2Hz，刺激间隔为6s，记录ICa。与给药前相比，麻黄碱给药后的高电压依赖性钙通道电流密度显著性提高。*，P0.05，与给药前相比，配对t-检验有显著性差异。表9 麻黄碱、细辛醚和去甲乌药碱各单体给药前后钙离子峰电流密度变化比较。2M麻黄碱显著性提高了峰电流密度，而2M 细辛醚或2M去甲乌药碱没有提高钙通道峰电流密度，反呈下降趋势，但尚未呈显著性差异。与给药前相比，*P0.05。3.8 细辛醚给药前后钠离子电流变化给药前钠电流基础值约为29.93.4 pA/pF，而110-5 M细辛醚使电流降低至18.42.3 pA/pF （n = 4）。根据Students t-test统计P 0.05，有统计学意义。 结果图：附：免疫组化照片（三）、主要研究结果与创新点1 从分子生物学角度探讨中药复方治疗缓慢性心律失常机制1.1调整阴阳，提高Na+-K+-ATP酶活性缓慢性心律失常的形成不外乎自律性异常（包括窦性心动过缓、窦性停搏、病态窦房结综合征）和传导性异常（包括窦房传导阻滞、房室传导阻滞以及室内传导阻滞）两种。心肌细胞的电生理特性是决定和影响传导性的主要因素，自律性的高低主要取决于4期自动去极化的速度及最大复极电位与阈电位之间的差异，并且受电解质浓度及自主神经的影响和调节。Na+-K+-ATP酶的生理作用有：形成心肌细胞膜内、膜外离子不均匀分布；活动具有生电性直接影响静息电位。研究发现Na+-K+-ATP酶活性降低会导致心肌细胞自律性、传导性以及离子通道的异常，这可能是缓慢性心律失常的发病机制之一。80本实验结果显示，空白组24m大鼠Na+-K+-ATP酶含量与9m大鼠相比差异显著，说明缓慢性心率失常大鼠Na+-K+-ATP酶活性减低；治疗组大鼠Na+-K+-ATP酶与空白组相比有明显差异，说明温阳活血方能提高大鼠Na+-K+-ATP酶活性。起搏传导系统退行性改变以老年人多见，随着年龄的增加，窦房结内的P细胞逐渐减少，脂肪组织和弹力纤维却渐多，一些老年人的窦房结功能因此出现异常，表现为心率减慢。素问阴阳应象大论：“年四十，而阴气自半，起居衰矣。”，年老体弱，阳气虚衰，无力鼓动心脉而易发本病。纵观近十年该病的研究文献，多数医家均认为本病是以心肾阳虚为本，瘀血为标的虚实夹杂之证。现代研究发现，cAMP、cGMP含量的变化可作为阴阳虚实演化的参照指标，血浆cAMP/cGMP含量变化cAMP下降，cGMP升高，cAMP/cGMP降低是公认的阳虚证特异性病理变化之一81。本实验结果发现，空白组24m大鼠与空白对照组相比，大鼠cAMP下降，cGMP升高，cAMP/cGMP降低，存在阳虚证的表现；治疗组与模型组相比，大鼠cAMP升高，cGMP降低，cAMP/cGMP升高。细胞内cAMP增加会使在同样膜电位水平时心肌细胞If通道的激活加速，If离子流幅值增大，从而引起舒张期自动去极化加速，心肌细胞自律性增高。而cGMP的增加会降低ICa-L通道、If通道和缝隙连接的电导，使心肌细胞自律性降低82。可见，参仙升脉口服液能改善缓慢性心律失常大鼠的阳虚病理状态，具有温阳及提升大鼠心肌细胞自律性的作用。素问生气通天论：“阴平阳秘，精神乃治”，参仙升脉口服液能调节衡量阴阳变化的cAMP、cGMP含量，能明显提高缓慢性心律失常大鼠心率，增强Na+-K+-ATP酶活性，是其改善起搏传导系统退行性改变的机制之一。1.2 增强缝隙连接蛋白Cx45表达现已知，心脏离子通道异常是致心律失常主要的或根本的原因。心脏的缝隙连接( Gap junction，GJ )通道是心肌细胞之间的一种特殊连接通道，相邻细胞紧贴边缘的功能接触区域即为细胞间隙连接，是一种具有亲水性、低选择性和低电阻等特点通道，胞质中的离子（Ca2+）和小分子物质（cAMP、cGMP）等可通过此通道相互沟通，能快速交换细胞间的电和化学信息，是心肌细胞维持电生理搏动的结构基础，对心律失常发生具有直接和即刻的作用。连接蛋白( connexin，Cx)是构成细胞间GJ的分子基础，目前共发现20种连接蛋白，在人的心血管系统内发现的Cx主要是Cx40、Cx43、Cx45、Cx37和Cx46。Cx45分布于整个传导系统，是窦房结和房室结间隙连接的主要成分。研究表明窦房结功能障碍与缝隙连接蛋白Cx45的关系密切。窦房结组织损伤后，窦房结细胞之间的Cx45表达量降低，从而引发细胞间电偶联与机械偶联异常，使窦房结功能下降。本实验观察参仙升脉口服液对缓慢性心律失常大鼠缝隙连接蛋白Cx45表达的影响实验结果显示,与空白组相比,模型组缝隙连接蛋白Cx45表达降低,差异有统计学意义(P0.01),提示缓慢性心律失常发生时有缝隙连接蛋白Cx45表达降低的表现;与模型组相比,治疗组缝隙连接蛋白Cx45表达升高,差异有统计学意义(P0.01),提示参仙升脉口服液能提高缓慢性心律失常大鼠缝隙连接蛋白Cx45表达参仙升脉口服液能提高缝隙连接蛋白Cx45表达,这可能是其抗缓慢性心律失常的分子生物学机制之一。2 中药复方主要有效成分对缓慢性心律失常大鼠心肌细胞离子通道电流影响2.1对钙通道影响中药麻黄的有效成分麻黄碱是一种肾上腺素能受体激动剂，既能促进去甲肾上腺素能神经末梢释放去甲肾上腺素，又能直接作用于肾上腺素受体发挥拟肾上腺素作用。麻黄碱可激动1受体使心肌收缩力增强，心输出量增加，心率加快。本研究证明麻黄碱还可使钙离子通过高电压依赖性钙离子通道流入心肌细胞，细胞内钙离子浓度升高，因而可兴奋心肌细胞。-细辛醚使通过高电压依赖性钙通道的电流密度稍有减弱，使细胞内钙离子浓度显著下降，表明-细辛醚有一定的钙通道阻滞作用而使冠脉血管扩张。研究证明去甲乌药碱能轻微上调-肾上腺素受体，提高窦房结自律性和改善房室传导而具有强心和提高心率作用。因此，-细辛醚与去甲乌药碱有改善心肌血供和增加心输出量的作用。同时，本研究发现-细辛醚和去甲乌药碱均呈轻微降低钙内流趋势，可减轻细胞内钙超载，进一步证实-细辛醚和去甲乌药碱可对受损伤的心肌细胞有保护作用。由此可见主要有效成分麻黄碱升高细胞内钙离子浓度和促进高电压依赖性钙离子内流，对心肌细胞的兴奋作用与-细辛醚、去甲乌药碱降低细胞内钙离子浓度，对心肌细胞的保护作用相反相成，可能是中药复方治疗缓慢性心律失常的作用机制之一。2.2 对钠通道影响窦房结细胞中正常钠离子通道可能只在舒张期除极的时候部分开放,因为窦房结中央的小细胞最大舒张电位(MDP)接近一60mv,这个电压范围内大多数钠离子通道都处于失活状态,很难被激活。实际上,钠电流的激活仅限于窗电流范围内。随后,在一60到一40mv时钠通道部分开放,产生小的内向电流,对舒张期除极有一定作用，由于许多通道在延长的舒张期不能完全失活,许多通道可能被再次激活,钠通道再次开放,这使得钠通道在整个激活电位范围内持续小频率开放。这将导致如下效应：首先，持续的内向钠电流会增加舒张期去极化末段的速度；其次，该电流在会增加动作电位上升支的速度;最后也是重要的是平台期间的持续内向钠电流将延长动作电位时程，总的结果是窦性节律变慢,这表明APD的增加是其主要效应。在动作电位的平台期和舒张期去极化,膜电阻相对较高。目前发现INa,L可导致小鼠窦房结功能紊乱，会影响心率，出现明显心动过缓。本实验观察到中药细辛有效成分之一细辛醚会使钠电流降低，这可能是其抗缓慢性心律失常机制之一。3 中药复方可提高缓慢性心律失常大鼠心肌功能鼠科动物胸壁薄、心脏体积小，低频相控阵探头很难获得清晰的图像。随着超声技术的发展，高频探头的出现使得适用于心脏超声适用于大鼠3-4，使得平价其心脏结构与功能成为可能。Watson LE5等认为8MHz的探头空间分辨率为0.2 mm，时间分辨率为5ms，可以克服大鼠由于心率快和心脏体积小造成的干扰；本研究首