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微生物微生物检验技术检验技术 基础知识基础知识 目 录 v一、微生物基本介绍 v二、培养基 v三、菌种 v四、微生物限度检查法 一、微生物基本介绍 1、微生物的定义 微生物是一些形体微小，以单细胞或简单多细胞、 甚至是没有细胞结构的形式存在的低等生物的统称 。 2、微生物的分类 微生物的主要分类单位：域、界、门、纲、目、科 、属、种、变种、亚种（小种）、型、菌株（品系 ） “种”是最本的分类单位，例：大肠埃希菌 一、微生物基本介绍 3、微生物的特点 v体形微小； v结构简单； v生长繁殖快； v种类繁多，分布广，适应性强。 v包括：细菌、酵母菌、霉菌、放线菌、立克次氏体 、支原体和病毒等。 一、微生物基本介绍 4、微生物形态结构 v4.1细菌 v4.2真菌（包括酵母菌和霉菌） 一、微生物基本介绍 5、微生物与我们 v每张人民币带细菌：900万个； v人体体表及体内存在大量的微生物； v皮肤表面：平均10万个细菌/平方厘米； v口腔“细菌种类超过500种； v肠道：微生物总量达100万亿； 一、微生物基本介绍 （未清洗的手） （凉水洗的手） （洗洁精洗后的手） （洗洁精洗后，消毒剂消毒的手） 二、培养基 1、培养基的制备 v培养基的配制： 按处方配制，使用按处方生产的符合规定的脱水 培养基 二、培养基 配制时注意： v不得使用结块或颜色发生改变的脱水培养基； v常用的溶剂是纯化水、蒸馏水，避免使用自来水，因其中含 有氯等抗菌物质； v脱水型培养基应完全溶解于水中，再分装灭菌； v加热助溶，注意不要过度加热； v如需要添加其它组分，加入后应充分混匀； v配制用的容器最好用中性玻璃或聚乙烯容器； v配制培养基一般要在1小时内完成，如果室温高，配制时间 过长，易使培养基受污染； 二、培养基 2、培养基的灭菌 v已配制好的培养基最好尽快灭菌； v一般培养基采用湿热灭菌，即高压蒸汽菌，通常是12115 分钟； v湿热灭菌必须严格控制灭菌温度和时间，不可重复高温灭菌 ； v高压蒸汽灭菌锅在使用时，内置物品不能太多，不要堆积形 成死角。 v要定期对压力表等进行检定，检定周期一般为半年； v定期对灭菌效果进行检验，可采用生物指示菌法、化学变色 纸片（如湿热灭菌指示条）等进行验证。 二、培养基 3、培养基的贮藏 v贮藏注意： v灭菌后的培养基应迅速取出，避免长时间保存在灭菌锅内， 造成过度灭菌； v培养基保存前应标上名称和制备日期（或到期日期）； v琼脂培养基不得在0或0以下存放； v琼脂平板最好现配现用，如置冰箱保存，不超过一周； 二、培养基 4、培养的再融化方式 v水浴加热 v微波炉 注意： v固体培养基灭菌后的再融化只允许一次 v融化的培养基应置于4550的水浴中，不得超过8小时 二、培养基 5、培养基的性能评估 v所有购回的、配制好的培养基均应进行质量控制试验（培养 基适应性检查） v理化指标（P55） v微生物学指标（P55） 三、菌种 1、分类（概念）： 标 准 菌 株由国内或国际菌种保藏机构保藏的 标准储备菌株由标准菌株经一次传代得到的培养物 商业派生菌株 由供应商提供的所有特性与标准菌株 等效的菌株 工 作 菌 株由标准储备菌株以传代得到的培养物 三、菌种 注意： v标准储备菌株、工作菌株都应进行纯度和特性确认 v工作菌株的传代次数不得超过5代（从菌种收藏机 构获得的标准菌株为第0代） v“1代”是指将活的培养物接种到微生物生长的新鲜培 养基中培养。 v实验室必须建立和保存其所有菌种的进出、收集、 贮藏、保存、确认试验及销毁的记录。 三、菌种 标准菌株： v冻干粉（图P63） v甘油冻存管（图P64） 三、菌种 菌种保藏机构： vCMCC 中国医学微生物菌种保藏管理中心 vGIMCC 广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心 vATCC 美国典型菌种保藏中心 例： CMCC （B） 26003 菌种保藏机构 细菌 菌种编号（金黄葡萄球菌） 三、菌种 2、菌种的鉴定 金黄色葡萄菌 CMCC (B) 26003 v甘露醇平板上划线分纯，典型菌落 为黄色圆形突起，表面湿润光滑； v革兰氏染色：阳性，球菌。 v血浆凝固霉酶实验：阳性 三、菌种 铜绿假单胞菌 CMCC (B) 10104 v溴化十六烷基三甲铵琼脂平板上划线分纯，典型菌 落呈扁平，无定形、周边扩散，表面湿灰白色 ，周围有蓝绿色素扩散。 v氧化酶实验：阳性 v绿脓菌素：阳性 v革兰氏染色：阴性，杆菌； 三、菌种 白色念珠菌 CMCC (B) 98001 v沙氏葡萄糖琼脂平板上划线分纯，典型菌落乳白色 ，表面光滑有浓酵母气味。 v革兰氏染色：阳性，菌体大，球菌。 v芽管试验：阳性 三、菌种 3、菌种的保藏 A：甘油冷冻管保藏法 v保藏温度：3080； 保藏菌种有效期：12年 v优点：保存期较长，反复传代导致菌种变异的风险较小； v缺点：操作相对复杂，成本较高。 B：斜面低温保藏法 v保藏温度4左右，保藏时间13个月，但铜绿假单胞菌不 宜用本法保存。 v优点：操作简便，成本低，比较容易掌握； v缺点：保存期比较短，反复传代有引起变异的可能。 保藏温度保藏 有效期 优点缺点 甘油冷冻管 保藏法 -3080 12年 保存期较长， 反复传代导致 菌种变异的风 险较小 操作相对复杂 ， 成本较高 斜面低温 保藏法 4左右 13个月 操作简便， 成本低， 比较容易掌握 保存期比较短 ， 反复传代有引 起变异的可能 ； 铜绿假单胞菌 不宜用本法保 存。 三、菌种 4、菌种的使用和销毁 v过期菌种应及时销毁，销毁时应经12130分钟的 生物灭活处理。 四、微生物限度检查法 1、定义 v微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原 料、辅料受微生物污染程度的方法。 2、检查项目 v定量检查细菌数、霉菌及酵母菌数 v定性检查控制菌（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞 菌、白色念球菌） v检验环境：与无菌检查相同 四、微生物限度检查法 3、检验量 v指一次检验用量；10g或10ml，膜剂为100cm2，贵 重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。 4、供试液的制备 v根据供试品的理化特性与生物特性，采取适宜的方 法制备供试液； v供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不超 过45。 四、微生物限度检查法 制备原则： v简便、快速！ v供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小 时。 四、微生物限度检查法 供试品分类 液体供试品 固体、半固体或黏稠性供试品 需用特殊供试液制备方法的供试品 v非水溶性供试品 v膜剂供试品 v肠溶及结肠制剂供试品 v气雾剂、喷雾剂供试品 v贴膏剂供试品 v具抑菌活性的供试品：培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜过 滤法、中和法 四、微生物限度检查法 5、方法验证 v5.1验证菌株 v大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌 、黑曲霉 v5.2计数方法的验证 v当建立产品的微生物限度检查法时，应进行细菌、霉菌及酵 母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该产品的 细菌、霉菌及酵母菌数的测定。 v若产品的组分或原检验条件发生改变可影响检验结果时，计 数方法应重新验证。 四、微生物限度检查法 试验组试验组 v薄膜过滤法计数时：取规定量的供试液，过滤，冲洗，在最 后一次的冲洗液中加入50100cfu试验菌，过滤，按薄膜过 滤法测定其菌数。 菌液组菌液组 v测定所加的试验菌数（50100cfu） 供试品对照组供试品对照组 v取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数 稀释对照组稀释对照组 v用相应的稀释液替代供试品，加入50100cfu试验菌，按试 验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。 四、微生物限度检查法 验证方法： 验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别 计算试验菌每次试验的回收率不低于70%，若任一 次试验中试验组的菌回收低于70%，应采取适宜的 方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行进行方法 验证。 四、微生物限度检查法 5.3控制菌检查法验证 v当建立药品的微生物限度检查法时，应进行控制菌检查方法 的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的控制菌检查。 v采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌 （10100cfu）应加在最后一次冲洗液中，依法操作。 v若上述试验检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法 进行供试品的该控制菌检查； v若试验组未检出试验菌，应采用相应方法消除供试品的抑菌 活性，并重新进行方法验证。 四、微生物限度检查法 5.4细菌、霉菌及酵母菌检查 v检查方法：平皿法和薄膜过滤法 v按已验证的计数方法进行供试品的细菌、霉菌及酵母菌菌数 检查 四、微生物限度检查法 菌落报告规则： 细菌、酵母菌宜选取平均菌落数小于300cfu； 霉菌宜选取平均菌落小于100cfu的稀释级，作为菌数报告（ 即两位有效数字）的依据。 如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有 菌落，但平均菌落数小于1时，以1乘以最低稀释倍数的值 报告菌数。 四、微生物限度检查法 菌落报告 规则示例 各稀释级（供试液1ml/皿）平均菌落计数 （cfu） 菌数报告数 （cfu/ml.g ） 原液 1：10 （-1） 1：102 （-2） 1：103 （-3） 16482640 24206486400 3不可计4206464000 400.50100 500100 600010 70001 例：菌数报报告规则规则 表1 四、微生物限度检查法 5.4.2薄膜过滤法 滤膜孔径不大于0.45m，直径一般为50mm，若需要用冲洗 液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量不超过100ml，总冲洗量 不得超过1000ml。 v贴膜 菌面朝上于相应的琼脂培养基平板上培养，每种培养 基至少制备一张滤膜。 v阴性对照试验（不得有菌生长） v菌落报告规则 每张滤膜上的菌落数应不超过100cfu，若滤膜 上无菌生长，以1乘以稀释倍数的值报告菌数。 四、微生物限度检查法 5.5控制菌检查 供试品的控制菌检查应按已验证的方法进行，增菌培养基的 实际用量同控制菌检查方法的验证。 v阳性对照试验：加菌量为10100cfu，阳性对照试验应检出 相应的控制菌。 v阴性对照试验：取稀释液10ml代替供试液，阴性对照应无菌 生长。 v按照不同的给药途径，必检的控制菌不同。 四、微生物限度检查法 不同给药途径制剂应检控制菌汇总 药品给药途径应检控制菌说明 局部给药制剂 金黄色葡萄球菌 所有制剂 铜绿假单胞菌 白色念珠菌阴道给药 口服制剂 大肠埃希菌所有品种 大肠菌群含中药原药粉、 沙门菌 含动物组织（提