基因工程与体外表达

第八章 基因工程与体外表达 克隆（clone） 无性繁殖 基因克隆(DNA重组、 DNA克隆、分子克隆): 应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体 DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子（ 复制子、重组体），继而通过转化或转染宿 主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞 ，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子拷 贝，或其表达产物。 基基 因因 重重 组组 示示 意意 图图 基因工程：为实现基因克隆所采用的方法及其 相关的工作。 限制性核酸内切酶切割DNA DNA连接酶生成3- 5磷酸二酯键 DNA聚合酶探针标记 、补平3末端 反转录酶cDNA合成 多聚核苷酸激酶5磷酸化、探针标记 末端转移酶3末端多聚尾 碱性磷酸酶切除末端磷酸基 常用的工具酶： 第一节 基因工程的工具酶 一、限制性核酸内切酶 一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水 解酶 特异核苷酸序列 ： 大多为 46 bp 回文对称（palindrome sequence） 5GAATTC 3 5GGATCC 3 3CTTAAG 5 3CCTAGG 5 1.分类： 根据酶的基因、蛋白质结构、依赖的辅助因子及与 DNA结合和裂解的特异性，限制性内切酶可分为三型， 即型、型、型。 型酶具有限制和修饰作用。要求DNA分 子上有特定的识别顺序，并在此识别位点下游 100至1000bp处切割。 型酶与型酶一样，有限制和修饰作用 。但在识别位点附近切割DNA，但切点难以预 测。 型酶并不兼有甲基化酶的活性。在DNA 分子内部的识别特异位点并切割双链DNA，切 割为点固定、已知，是基因克隆重常用的工具 酶。 Bam H GTC CAG G CCTAG GATCC G + GGATCC CCTAGG Hind GTCGAC CAGCTG GAC CTG + 平端 粘端 来源不同的限制酶，但能识别和切割 同一位点，这些酶称同功异源酶。 GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G + Bam H GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G + Bst 4.同功异源酶： 有些限制性内切酶虽然识别序列不完全 相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端 ，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为 配伍未端(compatible end)。 Bam Bam HHBg Bg l l GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGA G CCTAG GATCC G + + A TCTAG GATCT A 5.同尾酶 二、其他常用的工具修饰酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶大片段 反转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶：去除5端磷酸基团 末端脱氧核苷酰转移酶(TdT)：将dNTP加到DNA 的3-OH上；或进行同聚物加尾。 Taq DNA聚合酶 第二节 基因克隆的载体 为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达 有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。 克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计 的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽 链而特意设计的载体称为表达载体。 （一）质粒 (plasmid)存在于细菌染色体 外的小型环状双链DNA分子 特点 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传 信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。 一、常用的克隆载体 质粒（plasmid） 在细胞内的复制分两种类型 严密控制型 (stringent control) 只在细胞周期的一 定阶段进行复制 在细胞内只含 1个 或几个 松弛控制型 (relaxed control) 在整个细胞周期中 随时都可进行复制 在细胞内一般在20 个以上, 甚至多达 数千个 n克隆载体的的质粒应具备下列特点 分子量小，以容纳较大的外源DNA，有 较高的拷贝数； 具有一个以上的遗传标记物，便于重组体 的筛选和鉴定； 具有多个限制内切酶的单一酶切位点，称 为多克隆位点；便于外源基因插入。 （二）噬菌体(phage) 野生型噬菌体为双链线性DNA分子，两端各带12 个碱基的单链粘性末端。基因组分三个区域：左侧 区（含有包壳的病毒颗粒所需的全部基因）、中间 区（非必需区，但包含与重组有关的基因）、右侧 区（包含所有主要调控组分）。 系替换型载体，外源DNA：9 23kb 常用：EMBL 系列（置换型，适用基因组克隆） gt 系列（插入型，适用cDNA克隆） charon系列 （三） 粘性质粒(cosmid) 粘性质粒(cosmid)：又称粘粒，由DNA的cos区与质 粒构成，双链环状DNA，克隆容量：4050kb。 （四）M13噬菌体 一种大肠杆菌雄性特异丝状噬菌体，全长6.5kb 。复制型M13可用作克隆载体。 最大优点：产生单链DNA 为了便于克隆外源DNA片段，在野生型噬菌 体DNA的基因和基因之间插入一段lacDNA。包 括lac启动基因-操纵基因序列以及编码-半乳糖 苷酶头145个氨基酸的序列，并插入了多克隆位点 序列。 M13mp系列包括M13mp2、M13mp10、M13mp18、 M13mp19等。 （五）病毒载体 人类遗传病和肿瘤的基因治疗研究中，常 用的病毒载体有反转录病毒、 腺病毒、腺相 关病毒、HSV病毒。可将外源基因导入受体细 胞，以达到纠正遗传缺陷或杀死肿瘤细胞的目 的。多数病毒载体已质粒化，病毒载体主要包 括病毒启动子、包装元件、选择性遗传标记， 以及pBR322的复制子。 酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒） 其他 除具有克隆载体的性质外，还带有表达构件转录 和翻译所需的DNA序列。 （一）大肠杆菌表达载体 含复制起始位点、抗性基因、克隆位点，可以导入大 肠杆菌。表达载体中含启动子、核糖体结合位点、克 隆位点、转录终止信号。 1.启动子： trp-lac(tac)启动子：由trp启动子加上lac操纵子 中的操纵基因、SD序列融合而成。 噬菌体PL启动子：一种温度诱导的启动子。 T7噬菌体启动子：表达效率很高的启动子。 二、表达载体 2.核糖体结合位点：SD序列 3.转录终止序列 (二)真核表达载体 真核表达载体至少要含两类序列： 原核质粒的序列，包括在大肠杆菌中起作用的复 制起始序列、能用在细菌中筛选克隆的抗药性基因 标志等，以便插入真核基因后能先在很方便操作的 大肠杆菌系统中筛选获得目的重组DNA克隆、并复制 繁殖得到足够使用的数量。 在真核宿主细胞中表达重组基因所需要的元件， 包括启动子、增强子、转录终止和加poly-A信号序 列、mRNA剪接信号序列、能在宿主细胞中复制或增 殖的序列，能用在宿主细胞中筛选的标志基因、以 及供外源基因插入的单一限制性内切酶识别位点等 。 第三节 基因克隆的基本过程 制备目的基因和相关载体 目的基因与载体的连接 重组DNA导入受体菌 重组体的筛选和鉴定 重组体的扩增、表达和其他研究 一、目的基因的获取 （一）基因组DNA文库 采用限制性内切酶将基因组DNA切成片段，每一 片段都与一个载体分子拼接成重组体DNA，将所有重 组体DNA分子都引入宿主细胞并进行扩增，得到分子 克隆的混合体，这样一个混合体称为基因文库。 （二）cDNA文库 将某一时间某一种类细胞中所有的cDNA的混合 体与载体进行连接，使每一个cDNA分子都与一 个载体分子拼接成重组DNA，将所有重组DNA 分子引入宿主细胞并进行扩增，得到分子克隆的 混合体称为cDNA文库。 （三） PCR扩增特定基因 TA克隆系统由Invitrogen公司发展而来的商业试剂 盒，它用于PCR产物的克隆和测序。其原理是利用 Taq酶能够在PCR产物的3末端加上一个非模板依赖的 A，而T载体是一种带有3T突出端的载体，在连接酶 作用下，可以快速地、一步到位地把PCR产物直接插 入到质粒载体的多克隆位点（MCS）中 。 四、人工化学合成 二、载体的选择与制备 噬菌体和粘性质粒适用于构建基因组文库， pUC系列等质粒适合构建cDNA文库和克隆一些较小的 DNA片段，M13噬菌体则用于克隆一些待测序的DNA片 段。 选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载 体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目的基 因是要表达的，则要选择合适的表达载体。 方式：(1)同一限制酶切位点连接 (2)不同限制酶切位点连接 配伍末端连接 非配伍末端连接 1. 粘性末端连接 三、DNA分子的体外连接 Bam H切割反应 GGATCC CCTAGG T4 DNA连接酶 15C GATCC G G CCTAG + 目的基因用 Bam H切割载体DNA用Bam H切割 重组体载体自连 目的基因自连 同一限制酶切位点连接 不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接 Eco R切割位点Bg l切割位点 + + EcoR+ Bg l 双酶切 Eco R+ Bg l 双酶切 T4 DNA连接酶 15C 重组体 配伍末端的 连接情况和同一 限制酶切位点连 接相似。 2. 平端连接 限制性内切酶切割产生的平端 粘端补齐或切平形成的平端 适用于： 目的基因 载体 限制性内切酶 限制性内切酶 T4 DNA连接酶 15C 重组体 载体自连 目的基因 自连 在末端转移酶(terminal transferase) 的作 用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制 造出粘性末端，再进行粘端连接。 3. 同聚物加尾连接 四、将重组体DNA分子导入宿主细胞 1、转化 指将质粒或其它外源DNA导入感受态的宿主细胞 ，并使其获得新的表型的过程。 2、感染 以噬菌体、粘性质粒和真核细胞病毒为载体 的重组DNA分子，在体外经过包装成具有感染能 力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当细胞， 并在细胞内扩增。 3、转染 指真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而 获得新的表型的过程。 转染方法： 1、磷酸钙共沉淀法 2、电穿孔法 3、DEAE-葡聚糖法 4、脂质体介导基因转染 5、显微注射法 五、目的基因的筛选与鉴定 1、采用遗传学方法筛选特定的重组DNA (1) 抗药性标记选择 (2) 标志补救(marker rescue) (插入失活法) 抗药性标记选择 组氨酸缺陷 型大肠杆菌 无组氨酸 的培养基 酵母咪唑甘油磷 酸脱水酶基因 促进组氨酸合成 DNA 重组体 标志补救 若克隆基因的表 达产物与宿主菌 的营养缺陷互补 ,那么就可以利 用营养突变菌株 进行筛选,这就 是标志补救. 互 补 的 检 测 目 录 2、免疫学方法 利用特异性抗体检测表达产物 鸡的肌球蛋白的克隆和免疫学检测方法 原 位 杂 交 目 录 3、核酸杂交法筛选特定DNA Southern印迹 目 录 4、PCR技术对特定DNA进行直接鉴定 5、利用限制性内切酶酶切图谱鉴定DNA hMLCK重组质粒酶切图谱分析 1未酶切质粒 2. EcoR酶切 3. Hind 酶切 4EcoR/Hind 双酶切 5. 250bpDNA Ladder 第四节 真核细胞的转染 一、转染方法与原理 1、磷酸钙沉淀 2、DEAE葡聚糖介导转染 3、电穿孔 4、脂质体介导转染 5、显微注射 筛选标志 tk- Neor G418 瞬时转染 目的基因不整合进宿主基因组 稳定转染 目的基因整合进宿主基因组 二、转染细胞的筛选 胸苷激酶（tk） TTP（三磷酸胸苷）：从头合成（氨甲喋呤 阻断）；补救合成，需要tk HAT选择（H：次黄嘌呤；A：氨甲喋呤；T： 胸苷） tk+：生长 tk-+ （带tk基因）质粒：生长 （一）TK-细胞突变株筛选转染细胞 （二）药物筛选转染细胞 neor 新霉素：细菌抗生素，干扰原核生物 蛋白质合成 G418：阻断细胞内蛋白质合成，从而 杀伤真核细胞 neo：磷酸转移酶，使G418失活 neo 与目的基因连锁,转染 第五节 基因的改造 基因定点诱变技术 基因定点诱变技术的应用 一、基因定点诱变技术 1. 寡核苷酸介导的定点诱变法：用于删除或置换 DNA片段中的核苷酸。 原理：Klenow片段延伸与单链环状DNA模板配 对的寡核苷酸引物，引物中除有一处与模板的碱 基错配外，其余全部与模板互补，由寡核苷酸错 配处诱发突变，并在体外新合成一个杂合双链 DNA，最后用T4DNA酶连接成双链闭环DNA分 子；转化大肠杆菌细胞，经复制产生野生型和诱 变型两种DNA分子。通过筛选，获得诱变型 DNA分子。 步骤： 将目的基因片段插入M13噬菌体载体 以重组噬菌体制备单链DNA 设计并合成诱变寡核苷酸引物 诱变寡核苷酸引物与靶单链DNA杂交 Klenow片段延伸杂交的寡核苷酸引物 T4DNA酶连接成双链闭环DNA分子 转化宿主菌 筛选含诱变型DNA的重组噬菌体 制备单链DNA，测序验证 2.含U模板法 3. PCR定点诱变法：高效定点诱变技术 原理：除合成所需的5端和3端常规引物（a，d） 外，再合成一对带有诱变位点的互补寡核苷酸引物 （b，c）。分别利用诱变引物b和5端引物a，及诱变 引物c和3端引物d扩增出两个诱变的片段（a/b片段 和c/d片段）。经去除扩增反应的剩余引物后，将扩 增出两个诱变的片