医学课件抗肿瘤药物评价技术

抗肿瘤药物评价技术 南京凯基生物科技发展公司 联系电话025-52880812 抗肿瘤药物药效学指导原则 细胞毒类抗肿瘤药物非临床研究 技术指导原则 化学药物一般药理学研究技术指导原则 中药、天然药物一般药理学研究技术指导原则 指导原则 体内抗肿瘤试验必须选用三种以上肿瘤模型，其中至 少一种为人癌裸小鼠移植模型或其它人癌小鼠模型。 试验结果三种模型均为有效，再重复一次也为有效 体外实验选用10-15株人癌细胞株 ，至少重复一次 2 3 抗肿瘤药物药效学研究的要求 体内、体外实验方法相结合；以体内实验为主1 南京凯基生物科技发展公司 联系电话025-52880812 体外抗肿瘤活性试验 对候选化合物进行初步筛选 了解候选化合物的抗瘤谱 为随后进行的体内抗肿瘤试验提供参考 试验试验 目 的 体外抗肿瘤活性试验 试验试验 方法 选用10-15株人癌细胞株 试验还应考察受试物对耐药肿瘤细胞系和正常人源细胞的作用和影 响 使用MTT还原法、磺酰罗丹明B(SRB)染色法 药物与细胞共培养时间一般为48-72 小时，贴壁细胞需先贴壁24 小时后再给药。 试验应设阴性、阳性、溶媒对照组，阳性对照用一定浓度的标准抗 肿瘤药。 试验至少应重复一次 四氮唑盐还原法 体外抗肿瘤活性试验 试验原理：试验原理：四氮唑四氮唑MTT,3-(4,5-dimethylibiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-MTT,3-(4,5-dimethylibiazol-2-yl)-2,5-diphenyl- tetrazolium bromidetetrazolium bromide是一种能接受氢原子的染料。活细胞线粒体中与是一种能接受氢原子的染料。活细胞线粒体中与NADPNADP 相关的脱氢酶在细胞内可将黄色的相关的脱氢酶在细胞内可将黄色的MTTMTT转化成不溶性的蓝紫色的甲转化成不溶性的蓝紫色的甲 月替月替 ( (formazanformazan) )，而死的细胞则无此功能。用二甲基亚讽，而死的细胞则无此功能。用二甲基亚讽(DMSO)(DMSO)溶解甲溶解甲 月替月替 后后 ，在一定波长下用酶标仪测定光密度值，即可定量测出细胞的存活率。，在一定波长下用酶标仪测定光密度值，即可定量测出细胞的存活率。 方法要点：受试样品处理细胞结束后，加入方法要点：受试样品处理细胞结束后，加入5mg/ml MTT5mg/ml MTT液液2020微升微升/ /孔，继续孔，继续 培养四小时。再加三联液并培养过夜。在酶标仪上于培养四小时。再加三联液并培养过夜。在酶标仪上于490nm490nm波长处检测波长处检测ODOD 值。值。 观测指标观测指标 直接指标为直接指标为9696孔板上各被测孔的孔板上各被测孔的ODOD值；然后按公式（对照组值；然后按公式（对照组ODOD 值值- -治疗组治疗组ODOD值）值）/ /对照组对照组ODOD值值100%100%计算出相应的细胞生长抑制率；剧情计算出相应的细胞生长抑制率；剧情 况可进一步采用况可进一步采用LogitLogit法计算法计算50%50%生长抑制浓度生长抑制浓度IC50IC50值。值。 磺酰罗丹明染色法 体外抗肿瘤活性试验 试验原理试验原理：SRB(sulforhodamineSRB(sulforhodamine 是一种蛋白质结合染料，粉红色，可溶于是一种蛋白质结合染料，粉红色，可溶于 水。水。 SRBSRB可与生物大分子中的碱性氨基酸结合。其在可与生物大分子中的碱性氨基酸结合。其在515 nm515 nm波长的波长的ODOD读数读数 与细胞数呈良好的线性关系。故可用作细胞数的定量。与细胞数呈良好的线性关系。故可用作细胞数的定量。MTTMTT法的一个缺点是法的一个缺点是 ODOD值可随放置时间而变，而值可随放置时间而变，而SRBSRB法无此现象。因此更适用于进行大规模的法无此现象。因此更适用于进行大规模的 试验。试验。 方法要点方法要点： 用用10%10%冷三氯乙酸与冷三氯乙酸与4 4固定已经受试样品处理的细胞固定已经受试样品处理的细胞1h1h，洗涤，洗涤 ，干燥；加入，干燥；加入4mg/ml SRB4mg/ml SRB液液100100微升微升/ /孔孔 染色染色15min15min，1%1%冰醋酸洗涤，干燥冰醋酸洗涤，干燥 ；最后加入；最后加入150150微升微升/ /孔孔 的的TrisTris溶液，在酶标仪上与溶液，在酶标仪上与515nm515nm波长处检测波长处检测ODOD值值 。 观测指标观测指标 同同MTTMTT法。另外，法。另外，NCINCI目前采用以下指标评价化合物的体外抗肿目前采用以下指标评价化合物的体外抗肿 瘤活性。测定的瘤活性。测定的ODOD值包括对照组、加药组及加药时的细胞的值包括对照组、加药组及加药时的细胞的ODOD值值C C、T T、 和和T0T0。据此计算：。据此计算： 生长抑制率（生长抑制率（%）= =（T TT0T0）/ /（CT0CT0）100% 100% ； 按生长抑制率按生长抑制率 或细胞死亡率对样品浓度绘出量效关系曲线图，并求出或细胞死亡率对样品浓度绘出量效关系曲线图，并求出IC50IC50 染料排斥法 体外抗肿瘤活性试验 试验原理试验原理：活细胞有排斥某些染料如伊红、台盼蓝、苯胺黑等的能力，而死：活细胞有排斥某些染料如伊红、台盼蓝、苯胺黑等的能力，而死 细胞由于膜完整性的破坏，可被着色。因此培养的肿瘤细胞中加入这些染料细胞由于膜完整性的破坏，可被着色。因此培养的肿瘤细胞中加入这些染料 ，一定时间后，对着色和未着色的细胞进行计数，即可算出被杀死的细胞比，一定时间后，对着色和未着色的细胞进行计数，即可算出被杀死的细胞比 例。例。 方法要点方法要点：向一定容积的待检细胞悬液加入定量的某种染液，最常用的是：向一定容积的待检细胞悬液加入定量的某种染液，最常用的是 0.4%0.4%台盼蓝液，混匀，室温染色台盼蓝液，混匀，室温染色5-15min5-15min，将已染色的细胞悬液滴加至血细，将已染色的细胞悬液滴加至血细 胞计数板，直接在光镜下计数活细胞数和细胞总数。胞计数板，直接在光镜下计数活细胞数和细胞总数。 观测指标观测指标：按（未染色细胞数：按（未染色细胞数/ /细胞总数）细胞总数）X100%X100%计算活细胞率，对照组活计算活细胞率，对照组活 细胞率应在细胞率应在90%90%以上。根据活细胞率计算受试样品的半数致死剂量（以上。根据活细胞率计算受试样品的半数致死剂量（LD50LD50 ）作为药物抗肿瘤活性的指标。）作为药物抗肿瘤活性的指标。 阿拉马蓝法 体外抗肿瘤活性试验 试验原理试验原理：非荧光性蓝色底物阿拉马蓝可被活细胞中的线粒体内：非荧光性蓝色底物阿拉马蓝可被活细胞中的线粒体内 的的NADPHNADPH相关的脱氢酶类还原为强荧光性粉红色底物，采用微相关的脱氢酶类还原为强荧光性粉红色底物，采用微 培养板自动读数仪在激发与发射波长分别为培养板自动读数仪在激发与发射波长分别为530nm530nm和和590nm590nm处读处读 取荧光强度值，与活细胞数呈良好的线性关系。取荧光强度值，与活细胞数呈良好的线性关系。 方法要点方法要点：细胞经受试样品处理后，加入：细胞经受试样品处理后，加入10-20ul10-20ul阿拉马蓝染液，阿拉马蓝染液， 继续培养一定时间，用微培养板自动读数仪在激发与发射波长分继续培养一定时间，用微培养板自动读数仪在激发与发射波长分 别为别为530nm530nm和和590nm590nm处读取荧光强度值。处读取荧光强度值。 观测指标观测指标：根据荧光强度可以计算细胞生长抑制率，适当时可进：根据荧光强度可以计算细胞生长抑制率，适当时可进 一步计算一步计算IC50IC50值。值。 集落形成法 体外抗肿瘤活性试验 试验原理试验原理：克隆原细胞具有持续增殖能力，当单个细胞分裂：克隆原细胞具有持续增殖能力，当单个细胞分裂6 6代或代或6 6代以上时代以上时 ，其后代所组成的群体，其后代所组成的群体( (集落集落) )便含便含5050个以上细胞。通过集落计数可对克隆原个以上细胞。通过集落计数可对克隆原 细胞作定量分析。它反映了单个细胞的增殖潜力，故能较灵敏地测定抗癌药细胞作定量分析。它反映了单个细胞的增殖潜力，故能较灵敏地测定抗癌药 的活性，日前被认为是一种较理想的检测方法。的活性，日前被认为是一种较理想的检测方法。 方法要点方法要点：将浓度为：将浓度为500500个细胞个细胞/ml/ml的对数生长期细胞悬液的对数生长期细胞悬液2ml2ml种至种至35ml35ml的培的培 养皿，并加受试样品适量，培养养皿，并加受试样品适量，培养7d7d或更长时间，姬姆萨染色，解剖显微镜下或更长时间，姬姆萨染色，解剖显微镜下 计数含计数含5050细胞以上的集落。细胞以上的集落。 观测指标观测指标：根据集落数计算集落形成率，对照组集落形成率不应低于：根据集落数计算集落形成率，对照组集落形成率不应低于40%40%， 再计算用药组的集落形成抑制率，根据情况可进一步采用再计算用药组的集落形成抑制率，根据情况可进一步采用LogitLogit法计算受试样法计算受试样 品的品的IC50IC50值。值。 集落形成率集落形成率= =集落数集落数/ /细胞接种数细胞接种数X100%X100% 集落形成抑制率集落形成抑制率= =（1-1-用药组集落形成率）用药组集落形成率）/ /对照组集落形成率对照组集落形成率X100%X100% 生长曲线测定法 体外抗肿瘤活性试验 试验原理试验原理：在最适条件下，肿瘤细胞在培养液中呈指数生长，如取细胞数的：在最适条件下，肿瘤细胞在培养液中呈指数生长，如取细胞数的 对数与培养时间作图可得一条直线，故称此时为对数生长期。随着细胞密度对数与培养时间作图可得一条直线，故称此时为对数生长期。随着细胞密度 不断增高，由于代谢产物的积聚及营养物的消耗，细胞生长逐渐减慢以致停不断增高，由于代谢产物的积聚及营养物的消耗，细胞生长逐渐减慢以致停 止，此时称高坪期或稳定期。因此药物对细胞生长的影响可通过生长曲线反止，此时称高坪期或稳定期。因此药物对细胞生长的影响可通过生长曲线反 映出来映出来 。 方法要点方法要点： 将浓度为将浓度为1000010000个细胞个细胞/ml/ml的对数生长期细胞悬液按每瓶的对数生长期细胞悬液按每瓶5ml5ml种至种至 25ml25ml的培养瓶，或按每孔的培养瓶，或按每孔100100微升种至微升种至9696孔板，并加受试样品适量，培养后孔板，并加受试样品适量，培养后 分别于即刻和分别于即刻和1 1、2 2、3 3、4 4、5 5、6 6、7d7d进行检测。前者可采用台盼蓝染色计进行检测。前者可采用台盼蓝染色计 数活细胞，后者可采用数活细胞，后者可采用MTTMTT法或法或SRBSRB法读取法读取ODOD值，并据此进行作图与计算值，并据此进行作图与计算 。 观测指标观测指标 1 1、倍增时间、倍增时间(TD),(TD),将实际生在曲线进行直线回归求出将实际生在曲线进行直线回归求出0 0和和t t时刻的时刻的 理论细胞数理论细胞数N0N0和和N tN t，据此计算：，据此计算：TD=0.301t/TD=0.301t/（log N tlog N0log N tlog N0）；）；2 2 增殖细增殖细 胞杀伤率（胞杀伤率（%）=( N0=( N0N0N0)/ N0100%)/ N0100%；3 3 细胞生长饱和密度（细胞生长饱和密度（N sN s），代），代 表高坪期每毫升细胞数的均数。表高坪期每毫升细胞数的均数。 体外抗肿瘤活性试验 白血病（6株）：CCRF-CEM、HL-60、K562、MOLT-4、RPMI-8226、SR 肺癌（9株）：A549、EKVX、HOP-62、HOP-92、NCI-H23、NCI-H226、NCI-H322、 MNCI-H460、NCI-H522 乳腺癌：BT-549、HS578T、MCF-7、MCF-7/ADR、MDA-MB-231、ATCC、 MDA-MB-435、MDA-N、T-47D 卵巢癌：IGROV1、OVCAR-3、OVCAR-4、OVCAR-5、OVCAR-8、SK-OV-3 肾癌：786-0、A498、ACHN、CAKI-1、RXF-393、SN12C、TK-10、UO-31 前列腺癌：DU-145、PC-3 中枢神经系统肿瘤：SF-268 、SF-295 、SF-539、 SFB-19 、SFB-75、U251 黑色素瘤：M14、MALME-3M、SK-MEL-2、SK-MEL-5、SK-MEL-28、UACC-62、 UACC-257、LOCIMV 美国NCI抗肿瘤药物体外筛选使用的60种人类细胞 体外抗肿瘤活性试验 瘤谱细胞株结合我国 实际情况 呼吸系统、消化系统 、血液系统、妇科肿 瘤 选用人正常细胞株 初步确定受试样品对 正常组织和肿瘤组织 的选择性 选用耐药细胞株 考察受试样品的抗耐 药作用 国内 体外 筛选 的细 胞株 选择 选用人血管内皮细胞 株进行同步考察 细胞株有相当一部分 是国内自己建株 胃癌、肝癌 体外初筛经典三株细胞 A549 HepG-2 HCT-116 兼顾选择使用动物（小鼠）肿瘤与人的肿瘤细胞； 筛选实验以快速生长的细胞为主； 兼顾选择使用贴壁生长细胞与悬浮生长细胞 样品初筛时应该注意三点 体外抗肿瘤活性试验 对于化学合成物或天然产物的提对于化学合成物或天然产物的提 取物初筛时可以选择取物初筛时可以选择100100、1010、 1 1 g/mLg/mL三个浓度进行初步筛选三个浓度进行初步筛选 测定测定IC50IC50时，至少应该设置时，至少应该设置5 5个个 浓度，浓度间隔可采用等比间隔浓度，浓度间隔可采用等比间隔 ，例如：，例如：1 1、2 2、4 4、8 8、1616或或 0.010.01、0.10.1、1 1、1010、100100。 美国美国NCINCI现用的浓度为现用的浓度为10-410-4、1010 -5-5、10-610-6、10-710-7、10-8mol/L10-8mol/L。 凯基现用的浓度为1、2、4、8 、16、32、64、128、256、 药物与细胞共培养时间一 般为48-72 小时，贴壁细胞 需先贴壁24 小时后再给药 。 样品与细胞作用时间样品与细胞作用时间待筛样品的浓度 待筛样品的浓度 体外抗肿瘤活性试验 评价标准 以同一样品不同浓度对肿瘤细胞抑制率作图可得到剂量效应 曲线采用Logit法计算半数有效浓度(IC50值或EC50值) 合成化合物或植物提取纯品的IC5010 gm1或植物粗提 物的IC5020 gm1时，则判断样品在体外对肿瘤细胞有 杀伤作用。 体外试验至少重复一次 体外抗肿瘤活性试验 体外筛选其他方法：MTS法、刃天青法 以线粒体为作用靶点的受试物不宜采用四氮唑盐还原法 溶媒对照组与阴性对照组比较，OD值应在5%，且无统计学差异 应考虑到受试物在水溶液中的稳定性，比如环磷酰胺在水溶液中的半衰 期为3h 脂溶性的受试物常用DMSO助溶，但DMSO终浓度不低于0.1% 测出的OD值有事会出现假阴性（加MTT等染色剂时更换培养基） 注意事项 体内抗肿瘤活性试验 举举例 HepG-2 72h GroupMeanSDInhibitive Rate Negative Control 0.9550.010 Positive Control 0.9520.0100.29% Solvent Control 0.1650.00782.74% 化合物XXX IC50=22.588uM 100M0.0510.00594.66% 80M0.1010.00989.47% 60M0.1520.00884.08% 40M0.2850.00470.16% 20M0.6620.01330.72% 10M0.7660.02019.81% 5M0.8470.01111.31% 2.5M0.9180.0103.92% 1.25M0.9400.0101.59% 表 化合物XXX对人肝癌细胞HepG-2体外增殖的影响 体外抗肿瘤活性试验 优点优点 操作简单操作简单 用药量少用药量少 取材可直接用于人体肿瘤取材可直接用于人体肿瘤 得出结果快速得出结果快速 缺点缺点 细胞毒性易显阳性，有毒物质也常常显阳性，故细胞毒性易显阳性，有毒物质也常常显阳性，故 假阳性率高假阳性率高 非直接对肿瘤细胞作用的药物显示假阴性非直接对肿瘤细胞作用的药物显示假阴性 体外细胞并不能完全代表体内肿瘤的恶性细胞体外细胞并不能完全代表体内肿瘤的恶性细胞 体内抗肿瘤试验结果是评价候选化合物有效性的最重要指标 体内抗肿瘤试验必须选用三种以上肿瘤模型，其中至少一种为 人癌裸小鼠移植模型或其它人癌小鼠模型。试验结果三种模型 均为有效，再重复一次也为有效，评定该化合物对这些实验性 肿瘤具有治疗作用。 通常情况下，以人癌异体移植模型试验结果来评价细胞毒类抗 肿瘤药物的有效性。 体内抗肿瘤活性试验 体内抗肿瘤活性试验 小鼠肿瘤模型 大鼠肿瘤模型 人源异种移植肿瘤模型 自发性肿瘤自发性肿瘤 诱发的肿瘤诱发的肿瘤 移植性肿瘤移植性肿瘤 （a a）皮下肿瘤模型）皮下肿瘤模型 （b b）腹水瘤模型）腹水瘤模型 （c c）原位接种模型）原位接种模型 动物模型 实验动实验动 物 体内抗肿瘤活性试验 动物要求健康，符合等级动物要求，三证 裸鼠：SPF级，小鼠：清洁级、SPF级 实验动物质量合格证 实验动物生产许可证 实验动物使用许可证 雌雄均可，但同一批实验中动物性别必须相同 妇科肿瘤使用雌性小鼠、前列腺癌等使用雄性小鼠 小鼠鼠龄为5-6周，体重为18-22克 裸鼠6周龄以后，会产生体液免疫、NK细胞、B淋巴细胞免疫，成瘤率会下降 同批动物体重相差不超过20% 评价同一物质的活性时，不同批次的实验必须采用同一品系的小鼠 体内抗肿瘤活性试验 肿肿瘤瘤株 用体外试验敏感细胞株进行体内抗人癌裸小鼠移植瘤试验。 模 型建立和使用应注意： (1) 移植瘤一般由相应的细胞株移植而建立，对细胞株和移植瘤 的化疗敏感性应予了解。 (2) 移植瘤复苏后一般应传2-3代后再用于体内抗肿瘤试验。 (3) 对模型生长情况应全面了解，尤其是生长快的模型 (4) 为了保持移植瘤的生物学特性和遗传特性，复苏后移植瘤体 内传代应少于 15-20代 呼吸系统肿瘤 小鼠肺癌 Lewis 妇科肿瘤 小鼠乳腺癌 4T1 人肺癌 NCI-H460小鼠宫颈癌 U14 人肺腺癌 A549人乳腺癌 MDA-MB-435 消化系统肿瘤 小鼠胃癌 MFC人乳腺癌 MDA-MB-231 人胃癌 BGC-803人乳腺癌 MX-1 人胃癌 HGC-27人乳腺癌 BCaP-37 人低分化胃癌 BGC-823人宫颈癌 SiHa 人低分化胃癌 MGC-803人宫颈癌 Hela 人低分化胃癌 MKN-45人卵巢癌 A2780 人中分化胃癌 SGC-7901人卵巢癌 SK-OV-3 人高分化胃癌 MKN-28 生殖系统肿瘤 人肾癌 Ketr-3 小鼠肝癌 H22人膀胱癌 EJ 人肝癌 QGY-7701人膀胱癌 T24 人肝癌 SMMC-7721人前列腺癌 PC-3 人肝癌 Bel-7402人前列腺癌 PC-3M 人肝细胞性肝癌 IM3 白血病 人白血病 HL-60 人肝癌 HepG-2人白血病 K562 人结肠癌 Ls-174-T人耐阿霉素白血病 K562/Adr 人结肠癌 CL187 皮肤肿瘤 小鼠黑色素瘤 B16F1 人结肠癌 HCT-116小鼠黑色素瘤 B16F10 人结肠癌 SW1116小鼠黑色素瘤 B16BL6 人结肠癌 HT-29人黑色素瘤 A375 人胰腺癌 BxPC-3人黑色素瘤 M14 头颈部肿瘤 人喉表皮癌 Hep-2 其它肿瘤 小鼠肉瘤 S180 人舌鳞癌 Tca-113小鼠艾氏腹水瘤 EAC 体内抗肿瘤活性试验 小鼠肿瘤模型 优点：潜伏期短、移植瘤成活率高、生长均匀、无自发缓解、试验 周期短、费用低 缺点：动物肿瘤在生物学和遗传学上与临床不一致，在药物敏感性 方面与人体肿瘤 不一致 仅可用于候选化合物的初步筛选 常用小鼠肿瘤H22、S180、Lewis 人癌裸鼠异种移植肿瘤模型 优点：实验结果与临床较符合、可用于研究获得性药物抗性 缺点：饲养条件要求高、接种成活率低、移植瘤个体差异大、部分模型 很难构建、生存时间不适合作为试验终点 人癌裸鼠皮下移植瘤操作简单、易于观察与结果判定，但皮下移植瘤缺 乏肿瘤最典型的特性-转移，是现在评价抗肿瘤药物活性的主要模型 体内抗肿瘤活性试验 体内抗肿瘤活性试验 溶于水的药物，用生理盐水或蒸馏水配制；如用酸、碱溶解者，可先用 小量酸(0.1-0.5N HCl)或碱(NaHCO3、Na2CO3、NaOH)溶解，调节pH 在4.5-9.0的范围内。用乙醇、丙二醇、吐温80、DMSO助溶的药物，或 用吐温60、吐温80、2-3%淀粉、0.5%羧甲基纤维素制成混悬液的药物， 可腹腔注射或口服，但必须设相同浓度的溶剂对照组。用注射用花生油 配制的溶液或乳剂可口服、皮下或肌肉注射 药物配制 体内抗肿瘤活性试验 试验设模型对照组、阳性对照组、治疗组。 治疗组设高、中、低三个剂量组。小鼠肿瘤和腹水瘤接种 后次日将动物随机分组，裸鼠移植瘤用游标卡尺测量移植 瘤直径，待肿瘤生长至100300mm3后将动物随机分组 。 动物数普通小鼠每组10只，裸鼠6只。 组别设置 试验设计 体内抗肿瘤活性试验 治疗组设高、中、低剂量治疗组，一般按4:2:1设置 如何确定试验剂量 临床等效剂量（根据体表面积换算） 根据半数致死量（1/10-1/20预摸）或者高剂量使用最大耐受量或 LD10的剂量 根据文献估计剂量 剂量设置 试验设计 体内抗肿瘤活性试验 模型对照组给予相应的溶剂； 阳性对照药选用对该动物敏感的、临床应用的抗肿瘤药物（阳性组 必须作出阳性结果，否则有理由怀疑筛选方法和指标的可信度） 如受试物为一抗癌药物的衍生物或类似物时，必须选用该抗癌药物 作为阳性对照药 原型剂对照 阳性对照药选择原则 疗效确切与被试物质化学结构类似；与被试物 质有类似的作用机理 对照组设置 试验设计 体内抗肿瘤活性试验 分组当日开始给药，根据不同药物的代谢动力学和毒性反应等确定 给药方案。 给药途径应与推荐临床用药的途径相同。 给药次数较多，或被试物质溶解性较差，静脉给药有困难时，可考 虑使用腹腔给药，但在评价药效时要注意这两种给药