白介素与酶联免疫吸附法

细胞因子 白细胞介素白细胞介素 -多能的细胞因子 一、细胞因子及分类一、细胞因子及分类 细胞因子：是由细胞分泌的具有介导和调节免疫、炎症和造血过程的小分子蛋白物质。 分类：白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子、生长因子、趋化因子 二、二、白细胞介素白细胞介素（interleukin ,IL） 在 1979 年第二届国际淋巴因子专题讨论会上，将来自单核-巨噬细胞、T 淋巴细胞所 分泌的某些非特异性发挥免疫调节和在炎症反应中起作用的因子称为白细胞介素 （interleukin，IL） 。并以阿拉伯数字排列，如 IL-1、IL-2、IL-3。许多 IL 不仅介导白细胞 相互作用，还参与其它细胞的相互作用，如造血干细胞、血管内皮细胞、纤维母细胞、神 经细胞、成骨和破骨细胞等的相互作用。 白细胞介素，简称白介素，是指在白细胞或免疫细胞间相互作用的淋巴因子。白细胞 介素在传递信息，激活与调节免疫细胞，介导 T、B 细胞活化、增殖与分化及在炎症反应 中起重要作用。 （一）IL-1(又称淋巴细胞刺激因子) 1、细胞来源： IL-1 主要是由活化的单核和 （或 ）巨噬细胞合成与分泌，另外有树突细胞、郎格罕 氏细胞、上皮细胞、成纤维细胞、神经胶质细胞等，是最具多效性的细胞因子之一，几乎 对所有体内细胞产生作用1。 2、存在形式： 白介素 1(IL-1)族由两种促效剂(IL-1a 和 IL-1)和一种拮杭剂(IL-1 受体桔杭剂)组成2。 其中 IL-1 主要存在于细胞内，IL-1 主要存在于体液中，故 IL-1 的生物学作用主要由 IL-1 介导 3、主要生物学功能： IL-1 在体内的靶细胞范围也很广泛，不仅有淋巴细胞，还有嗜中性粒细胞、成纤维细 胞以及肝、胰、骨、软骨等器官的细胞，这一特点也是其生物学作用广泛的原因。其主要 生物学作用有 ：（1）介导炎性反应 。IL-l 除自身能引起炎性反应外，还可诱导其他炎 性细胞因子如 IL-6、IL-8、趋化因子、黏附分子和组织重建酶等合成，进而加重炎性反应， 另外，IL-1 还能诱导 COX 基因转录，引起前列腺素分泌增加 ，介导炎性反应。 （2）免 疫调节作用。 （3）诱导急性时相蛋白，参与急性期反应。 （4）参与恶液质的形成，致负氮 平衡效应。 （5）诱导成纤维细胞增殖 4、相关疾病： （1）眼底病变 （1）糖尿病视网膜病变（2）增 殖 性 玻 璃 体 视 网 膜 病 变（3）不伴有 PVR 的单纯性视网膜脱离（4）视网膜退行性病变 （2）肥胖与 2 型糖尿病联系的主要原因 白介素-1 是机体的重要细胞因子，白介素-1 可通过促进胰岛 细胞的一氧化氮生成 和细胞凋亡而引起 细胞选择性的破坏,诱导胰岛素抵抗3。 （3）炎症反应 IL 1 是一种致炎因子又是引起类风湿关节炎(RA)贫血的因素,可能参与了 RA 及 RA 伴慢性疾病性贫血(ACD)的发病过程4。而 IL-1 是一种前炎症因子，它和 IL-6 等细胞因 子在诱导结肠黏膜炎症中有重要作用，并参与炎症的持续和放大5 （4）肿瘤 IL-1、IL-1 二者在肿瘤中发挥不同的作用，天然的膜结合型 IL-1 能够像粘附分子 一样增效肿瘤细胞与携带 IL-1R 的免疫效应细胞之间的相互作用，通过激发机体免疫细胞 对肿瘤的杀伤而抑制肿瘤发生。而 IL-1 则通过促进肿瘤血管生成及诱导宿主的免疫抑制 而增强肿瘤的侵袭性，研究发现表达 IL-1 的肿瘤细胞具有更强的侵袭与转移特性，并且 能够产生由未成熟 CD11b + /Gr-1 + 髓样细胞介导的 T 细胞免疫抑制6。 （5）白介素 -1 及白介素 -1 对体外培养的黑素细胞增殖及黑素生成都有抑制作用7 （二）IL-2(又称 T 细胞生长因子，TCGF) 1、细胞来源： 活化的（CD4+和 CD8+）T 细胞 2、作用方式： 以自分泌和旁分泌方式发挥效应。 3、主要的生物学功能： 白介素-2 是一种淋巴因子，可使细胞毒性 T 细胞、自然杀伤细胞和淋巴分泌抗体和干 扰素，具有抗病毒、抗肿瘤和增强机体免疫功能等作用8。 （1）活化 T 细胞，促进细胞因 子产生；（2） 、刺激 NK 细胞增殖，增强 NK 杀伤活性及产生细胞因子，诱导 LAK 细胞产 生；（3） 、促进 B 细胞增殖和分泌抗体；（4） 、激活巨噬细胞。 4、相关疾病 （1）用于肾细胞癌、黑色素瘤、乳腺癌、膀胱癌、肝癌、直肠癌9、淋巴癌、肺癌等恶性 肿癌的治疗，用于恶性胸腔积液10的控制。也可用于淋巴因子激活的杀伤细胞的培养； （2）用于手术、化疗及放疗后的癌症患者的治疗，可加强机体免疫功能； （3）各种自身免疫病的治疗，如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、干燥综合症等； （4）对某些病毒性、杆菌性、胸内寄生菌感染性疾病，如乙型肝炎、麻风病、肺结核、白 色念珠菌感染等具有一定的治疗作用. （三）IL-6 1、细胞来源： IL-6 是由巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞等产生的一种多功能细胞因子6。 2、生物学功能： IL-6 能够促进 T、B 细胞的增殖与分化，诱导巨噬细胞及巨核细胞分化，活化破骨 细胞，且与炎症反应及自身免疫性疾病等相关11 3、相关疾病： 文献显示 IL-6 与多种疾病相关，如： （1）脑血管疾病 （1）血清 IL-6 升高的程度与脑梗塞体积的大小和神经功能受损程度密切相关,显示 IL-6 在急性脑梗塞的诊断和预后中可能起重要作用,（2）早期的 IL-6 血浆浓度与严重的脑 损伤及脑损伤后肺炎有关（3）有研究结果提示血浆 IL-6 基线水平的提高与认知能力递减 有关12-13 IL-6 可参与心脑血管疾病的产生。IL-6 还可增加低密度脂蛋白(LDL)受体的表达， 进而刺激巨噬细胞摄取 LDL,加速动脉粥样硬化14。 （2）在心脏方面 IL-6 可能在促进心室重构方面起了一定的作用；IL-6 在预测无症状性左心功能不全 方面可能有一定的价值15。在冠心病的发病机制上 IL-6 扮演着一个重要的角色。 （3）肿瘤方面 许多研究显示 IL-6 对肿瘤细胞生长的调节呈双重作用，对某些肿瘤细胞生长起促进作 用，而对某些肿瘤细胞的生长则起抑制作用16,如 IL-6 参与了胃癌的发病机制，对肿瘤生 长起促进作用17， ；而 IL-6 对恶性黑色素瘤细胞、人乳腺癌、白血病、淋巴瘤及某些肾癌 细胞株有剂量依赖性生长抑制作用16。 （4）其他方面 抑郁症患者中求助因子与白介素-6 的血清水平成正相关18 手足口病是一种由病毒引发的炎症反应，IL-6 是重要的炎性介质和免疫调节因子，具 有抗病毒的功能19。IL-6 在炎症的发病中起重要的作用,并可用来监测疾病活动和治疗效果20。 （四）其他白细胞介素 白介素的种类很多，现在已经发现有 30 多种，对其的报道也很多。如 IL-4、IL- 8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-22、IL-29、IL-32、IL-33 等。与肿瘤相 关的有 IL-1、IL-6、IL-12、IL-23、IL-27、IL-32 等。 三、酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay ，ELISA) ELISA 即酶联免疫吸附试验，是一种常用的固相酶免疫测定方法。 （一）基本原理 它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应， 用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。 具体的说： （1）使抗原（或抗体）结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性； （2）使抗原（或抗体）与某种酶联结成酶标抗原（或抗体） ，而且此酶标抗原（或抗体） 既保留其免疫活性，又保留其酶活性； （3）测定时将受检标本（抗体或抗原）和酶标抗原（或抗体）按不同步骤与固相载体表面 的抗原或抗体进行反应，再用洗涤方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其它物质分 开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检的抗体或抗原量成一定比例；再加入酶反 应底物后，底物被酶催化后变为有色产物，根据其颜色反应的深浅进行定性或定量分析， 以了解被测标本中抗体或抗原含量 ELISA 可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂： （1）固相的抗原或抗体，即“免疫吸附剂“； （2）酶标记的抗原或抗体，称为“结合物“； （3）酶作用的底物。 二、分类 （一）双位点夹心法 1、双抗体夹心法，属于非竞争结合测定。它是检测抗原最常用的 ELISA，适用于检 测分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原，而不能用于小分子半抗原的检测。 工作原理是：利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子 上两个抗原决定簇结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物。由于反应系统中固相 抗体和酶标抗体的量相对于待测抗原是过量的,因此复合物的形成量与待测抗原的含量成正 比(在方法可检测范围内)。测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物质量(OD 值)，即可确定待测抗原含量。 若固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原 分子上两个不同的抗原决定簇结合，则属于双位点夹心法。 图 1 双抗体夹心法测抗原 2、双抗原夹心法 若采用固相载体上的抗原和酶标抗原分别与样品中被检测抗体分子 结合，则是双抗原夹心法。双抗原夹心法，属于非竞争结合测定。它是检测抗体的 ELISA。 工作原理是：利用连接于固相载体上的抗原和酶标抗原分别与样品中被检测抗体分子 上两个抗原结合位点结合，形成固相抗原-抗体-酶标抗原免疫复合物。由于反应系统中固 相抗原和酶标抗原的量相对于待测抗体是过量的,因此复合物的形成量与待测抗体的含量成 正比(在方法可检测范围内)。测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物质量(OD 值)，即可确定待测抗体含量。若采用固相载体上的抗原和酶标抗原分别与样品中被检测抗 体分子结合，则是双抗原夹心法。 双抗原夹心法 - 操作步骤： 将特异性抗原包被固相载体。孵育一定时间，使形成固相抗原，洗涤除去未结合的 抗原和杂质。 加待检标本，孵育，使标本中的抗体与固相载体上的抗原充分反应，形成固相抗原 抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。 加酶标抗原，孵育，使形成固相抗原-待测抗体-酶标抗原夹心复合物。洗涤除去未 结合酶标抗原。 加底物显色。固相上的酶催化底物产生有色产物,通过比色,测标本中抗体的量。 （二）竞争法 竞争法 ELISA 可用于抗原和半抗原的定量测定，也可对抗体进行检测， 其原理是标本中的抗原（抗体）和一定量的酶标抗原（抗体）竞争与固相抗体（抗原） 结合。标本中抗原（抗体）含量愈多，结合在固相上的酶标抗原（抗体）愈少，最后的显 色也愈浅。小分子激素、药物等 ELISA 测定多用此法。 方法和特点 酶标记抗原（抗体）与样品或标准体中的非标记抗原（抗体）具有相同的与固相抗 体 （抗原）结合的能力 反应体系中，固相抗体（抗原）和酶标抗原（抗体）是固定限量，且前者的结合位 点少于酶标记与非标记抗原（抗体）的量之和 免疫反应后，结合于固相载体上复合物中被测定的酶标抗原（抗体）的量（酶活性） 与样品或标准品中非标记抗原（抗体）的浓度成反比 图 2 竞争法测抗原示意图 （三）间接法 间接法 此法是测定抗体最常用的方法,属非竞争结合试验。 基本原理是将抗原连接到固相载体上，样品中待测抗体与之结合成固相抗原-受检抗体 复合物，再用酶标二抗(针对受检抗体的抗体，如羊抗人 IgG 抗体)与固相免疫复合物中的 抗体结合，形成固相抗原-受检抗体-酶标二抗复合物，测定加底物后的显色程度，确定待 测抗体含量。 图 3 间接法测抗体 图 4 间接法测抗体操作步骤 （四）捕获法 捕获法（亦称反向间接法）ELISA，主要用于血清中某种抗体亚型成分（如 IgM）的 测定。以目前最常用的 IgM 测定为例，因血清中针对某种抗原的特异性 IgM 和 IgG 同时 存在，则后者可干扰 IgM 的测定。 工作原理：先将针对 IgM 的第二抗体（如羊抗人 IgM 链抗体）连接于固相载体， 用以结合（“捕获”）样品中所有 IgM（特异或非特异） ，洗涤出去 IgG 等无关物质，然后 加入特异抗原与待检 IgM 结合；再加入抗原特异的酶标抗体，最后形成固相二抗- IgM-抗 原-酶标抗体复合物，加酶底物作用显色后，即可对样品中待检 IgM 是否存在及其含量进 行测定。 图 6 捕获法测 IgM （三） 影响因素 1、 固相载体：可溶性抗原或抗体吸附于固相载体而成为不溶形式，这是进行酶标记 测定的基本条件。在 ELISA 中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反应板及塑料管。由于 微量反应板所用试剂量少，操作方便，适合于大规模应用。 2、 抗原：在 ELISA 中，包被于固相载体表面的抗原或抗体的来源和制备方法对试验 结果都有影响。包被所用的抗原必须是可溶性的，而且要求是优质和稳定的制剂，纯度和 免疫原性要高。如果不纯，由于抗原中所含杂质就会竞争固相载体上的有限位置，降低敏 感性和特异性。此外还应考虑到制备包被抗原不应破坏其免疫学活性。 3、 试验样品：血清、血浆或其他体液，均可作为 ELISA 的试验样品（标本） 。但应注 意分离血清时，血液要求放置室温中凝固收缩，不宜置冰箱（4）凝固，否则会使大部分 IgM 和少量 IgG 丧失活性。 4、 抗体：制备酶结合物的抗体最好要提纯。被标记的抗体要求效价及亲和力都要高， 因为纯化抗体可增加反应的特异性。但在大多数情况下，用抗血清中的全球蛋白成份与酶 结合所制成的结合物亦可应用，而且相当稳定。 5、结合物：在 ELISA 中，用酶标记的抗体或抗原统称为结合物，此为进行 ELISA 检 测的关键试剂。常规使用 ELISA 法的主要问题是能够简便地制备酶结合物，而此种制备好 的酶结合物要求稳定，具有很高的酶活性，抗原或抗体的特异性，产量高及成本低。 酶的选择： （1）酶制品的纯度及活力高，催化效力也高，放大倍数大（即一个酶分子能催化几十几百 个底物分子发生反应的酶） 。 （2）酶及制备好的酶结合物在检测或贮存中能保持稳定。 （3）酶制剂易得、价廉. （4）既要适用于标记抗原，又适用于标记抗体，标记后不影响抗原或抗体的免疫学特性， 也不降低酶的活性。 （5）酶的反应产物稳定，检测时简便、快速。在定量测定中产物必须是可溶性的。 （6）要有安全、价廉、易得的底物。 最常用的两种为：碱性磷酸酶（Alkaline Phospatase,简称 AP，分子量为 5105） ，辣 根过氧化物酶（Horse Radish Peroxidase,简称 HRP,分子量为 4104） 结合： 要将 HRP 与抗体球蛋白结合起来，不能用强烈的方法，因为强烈的方法会使酶和抗体 失去活性。故只能用温和的方法把酶和抗体结合起来。因此，必须使用结合剂。理想的结 合剂应具备下列条件：（1）不影响酶及抗体活性， （2）不产生干扰物质， （3）抗体和酶结 合后应有较高的产量， （4）不出现非特异性反应,(5)结合程序简便， （6）来源易、价廉。目 前常用的有戊二醛和过碘酸钠二种。 6、底物：各种酶都有对底物的特异性，所以使用不同种类的酶要求有不同的底物。一旦 酶结合物已经确定（如 AP 或 HRP） ，那么可供选择底物的范围是很有限的。应按下列几个 条件进行选择。 （1）底物在未被酶催化以前应该是无色的，而经酶催化后有明显的颜色变化，这样可使结 果分辨清楚； （2）所显色泽易干洗脱； （3）显色后的产物要求稳定，在作定量测定时所产生的有色物质应该是可溶性的； （4）价廉，易得而且无毒。 因此，对 AP 酶结合物来讲，一般均用硝基苯磷酸盐，显色后呈桔黄色，色泽稳定； 对 HRP 酶结合物来说，主要通过酶的催化作用使过氧化氢还原。同时使另一个底物氧化产 生色变，目前大多数使用邻苯二胺（Ortho-Pheny lene-diamine，简称 OPD） ，稳定、敏感， 其降解产物呈桔红色，可溶。 1 朱明琼,综述,邝国平. 白介素-1 与眼底病变J. 现代医药卫生,2013,29(2). 2 DinarGllo CA et al. 白介素 1 在疾病中的作用J. 国外医学创伤与外科基木问题分 册, 1993,14(3):141-144. 3 王 露，张 微. 血清白介素-1 水平与 2 型糖尿病及肥胖的相关性分析J. 中国医学工 程,2011,19(7). 4 余丽君. 类风湿关节炎伴慢性疾病性贫血患者血清白介素 1 和促红细胞生成素水平及其 意义J.Chinese General Practice,2012,15(7B):2265-2267 5 刘启泉,杜艳茹,杨卓杰等. 兰茵凤扬化浊解毒方对溃疡性结肠炎患者血浆白介素-1 及血 清中 TNF-a 的影响J.中成药, 2011,33(4). 6 高 昆 张连峰. 白细胞介素与肿瘤研究进展J. 中国免疫学杂志,2012, 28 (5). 7 林新瑜,王 芳,林鸿刚等. 白介素-1 对培养人表皮黑素细胞增殖及黑素合成的影响研究J. 中国美容医学,2012,21(6). 8 肖 啸,杨继生,李松彪等.白介素-2 对临床意义的研究J. 山东畜牧兽医,2008,5(29):45-46. 9 陈强.白介素-2 在结直肠癌生物治疗中的应用J. 外科理论与实践,2006,11(1). 10 陈世灵，周宏宇. 白介素-2 在肿瘤治疗中的应用J. 中国医药导报,2010,7(24). 11 Kishimoto T.Interleukin-6: discovery of a pleiotropic cytokineJ Arthritis Res Ther，2006; 8( Suppl 2) : S2 12 Weaver JD ,Huang MH.Interleukin-6and risk of cognitive decline :MacArthur studies of successful agingJ.Neurology,2002,13:59(3):371-378 13 慕澜,魏连波,李学. 白介素 6 的研究进展J. 深圳中西