抗氧化测定和细胞衰老相关

一、中药中的抗氧化成分 1. 黄酮类 黄酮类化合物的抗氧化作用主要通过直接捕捉和清除氧自由基来实现，另 外其抗氧化活性也与调节和提高体内抗氧化酶活性相关。其抗氧化作用与3,7位 羟基密切相关，其化学性质主要是具有还原性和捕获自由基的特性；能与多种 金属离子发生络合或静电作用；能与蛋白质结合；具有两亲结构和诸多衍生化 反应活性。其中淫羊霍、黄芬、桔皮、雪莲等提取物中分离的黄酮类物质均具 有较强的清除自由基能力。 2.酚类 植物多酚以大量的酚羟基作为氢供体，对多种活性氧具有清除作用，对于 氧化酶存在的系统不但可以清除 .OH 和脂质自由基，还能抑制 NO 和 O2.-反应形 成过氧亚硝酸的氧化活性。 茶多酚与自由基反应形成比较稳定的半醌自由基，且部分可进一步演化成 无毒的聚合物。茶多酚还可激活 SOD/CAT/GSH-Px 的活性，起到抗氧化，防衰老 的功效。具有很强的抗氧化能力。 白藜芦醇（Resveratrol，RES ）是一种含有芪类结构的非黄酮类多酚化合物， 具有较弱的抗氧化能力。Sgambato 等的研究表明白藜芦醇可通过上调活性氧 （ROS ）清除剂和第二阶段酶的表达发挥抗氧化性能，其中第二阶段酶包含超 氧化物歧化酶，过氧化氢酶，谷胱甘肽过氧化物酶，谷胱甘肽还原酶，硒磷酸 合成酶 2，硫氧还蛋白还原酶和 NAD（P）H：醌氧化还原酶 1。Robb 等发现 RES 长期作用可诱导线粒体 MnSOD 的表达和活性。 3.皂苷类 皂苷类物质对氧自由基本身影响较少，大多能提高体内 SOD CAT(过氧化氢 酶)等抗氧化酶的活性，从而增强机体抗氧化系统功能。皂苷类的抗氧化活性较 弱。人参皂苷可显著抑制由乙醇所引起的小鼠肝脏内脂质过氧化反应、抑制脂 褐素的形成和堆积。 抗氧化性皂苷包括五科皂苷:人参、西洋参、党参、竹节参、三七等 此外，Vc 是活细胞氧化还原的催化剂，参与体内多种代谢，具有促进体内 多种激素合成的作用。Vc 具有很强的还原性，捕获自由基的能力极高。 富含生物碱类、蛋白质和酶类以及微量元素的一些中草药也有抗氧化作用. 石斛的抗氧化作用于其富含微量元素硒有关,硒作为抗氧化酶GSH-Px的活性结构 组成部分，通过该酶催化过氧化氢或过氧化脂质的生成及破坏作用，保护细胞 膜和DNA。 总结：抗氧化性强的物质有Vc和茶多酚；VE和白藜芦醇抗氧化性较弱。 目前研究较多的中草药抗氧化物： 绿茶中的茶多酚、葡萄中的白藜芦醇、姜黄中的姜黄素、蜂胶中的咖啡酸苯乙 酯等 姜黄素是一种新型的抗氧化剂，可阻止丙酮痊/赖氨酸诱导的氧化应激和DNA损 害，并且可抑制丙酮醛诱导的人单核细胞凋亡和活性氧的产生。 Priyadarsini等证实，姜黄素分子结构中的酚羟基在姜黄素的抗氧化活性中起 决定性的作用。姜黄素及结构类似物通过抗过氧化脂质达到保护生物膜的作用。 不仅如此，姜黄素还能抑制自由基介导的脂质过氧化反应，使其主要氧化副产 物42羟基壬烯酸-氧化应激诱导剂生成减少，减轻线粒体的氧化还原反应及呼吸 功能损害，增加还原型谷胱甘肽含量，减少活性氧产生并抑制蛋白质羟化，从 而减轻氧化应激反应及细胞损伤。 抗氧化作用机理： 1自由基吸收剂：如酚类抗氧化剂，维生素 E，类胡萝卜素。 2氧清除剂：如类胡萝卜素及其衍生物、抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、异抗 坏血酸和异抗坏血酸钠等。 3金属离子螯合剂：枸橼酸、EDTA和磷酸衍生物。 二、抗氧化活性的评价方法 体外评价方法: 主要通过测定样品抑制脂类物质氧化的能力和对自由基的清除能力来评价待 测物的抗氧化活性。常用的测定方法有:DPPH、TRAP 、TOSC等。 DPPH(2,2-diphenyt-l-picrylhydrazyl radical scavenging capacity)方 法的原理是，DPPH是一种稳定的自由基，其乙醇溶液显紫色，抗氧化物质可 使其还原，从而颜色变浅，根据吸光度的变化可测得抗氧化剂的活性。通过计 算DPPH自由基剩余一半时所需抗氧化剂的浓度(EC 50)以及时间(TEC 50)反应抗氧 化物的活性。DPPH法快速、简单，仅需要一台紫外分光光度计就可以测定，但 DPPH方法存在的不足是，当被测物与DPPH紫外吸收有重叠时，将会影响测定结 果，比如类胡萝卜素。此外，由于空间位阻决定反应的倾向，小分子化合物由 于更易接近自由基而拥有相对较高的抗氧化能力。此外该方法线性范围也相对 较窄，而且所有还原剂都能够对DPPH起作用，因此结果并不能完全代表抗氧化 能力。此方法在中草药抗氧化剂筛选中得到广泛应用。 TRAP(total peroxyl radical-trapping antioxidant parameter assay) 方法的原理是，抗氧化剂干扰由AAPH或ABAP产生的自由基与目标探针之间的反 应，目标探针已使用的有R-藻红蛋白荧光物质，ABTS吸光度，耗氧量，最后以 抗氧化剂滞后反应时间来比较抗氧化能力的大小，结果用Trolox当量来表示。 TRAP法可用于测量非酶抗氧化物质，比如谷胱甘肽，维生素C，维生素E，-胡 萝素。不足之处是反应终点各异，各个实验室缺乏可比性，而且它假定每一种 抗氧化剂滞后时间与其抗氧化能力是成比例的，而并非每一种抗氧化剂都能成 比例。 TOSC(total oxyradical scavenging capacity)，即总氧自由基清除能力 检测法,原理是，ABAP产生的自由基与KMBA(-keto-methiolbutyric acid) 作用可氧化产生乙烯，抗氧化剂的存在可与KMBA竞争结合自由基，从而减少乙 烯的产量，最后通过乙烯的减少程度来衡量抗氧化能力的强弱。TOSC方法简便， 灵敏，能够定量分析其抗氧化能力，然而它需要使用气相色谱仪器，也不适合 高通量筛选，并且和TRAP法相似，抗氧化物质的浓度与其乙烯的抑制程度没有 呈现很好的线性关系，因而很难对样品进行合理的比较。 动物试验法 动物实验中主要通过测量血液中脂质过氧化物(LPO)和SOD 活性及含量来评 价其抗氧化活性。 三、细胞衰老 细胞衰老 (cellular senescence) 是指细胞生理功能的衰减，包括增殖能力下 降、细胞周期停滞、对有丝分裂原不敏感、衰老相关基因和蛋白表达增加，并 伴有形态学的衰老改变，且渐趋于死亡的现象。主要有两个原因导致细胞衰老， 其中由于端粒 DNA 缩短导致的衰老称为复制性衰老 (replicative senescence,RS) ，由不同应激原譬如 DNA 损伤、染色质破坏、氧化应激损伤、癌基因激活等 引起的衰老称为应激诱导的衰老 (stress-induced senescence,SIS)。 1.细胞衰老的表现 细胞形态结构上，由于细胞内水分减少,细胞萎缩,体积缩小。细胞核体积增 大，染色体固缩，溶酶体数目增加，体积增大，内质网排列无序。细胞内色素 颗粒沉积增多.细胞膜通透性改变,运输功能降低。 化学成分上，DNA 复制与转录受到抑制，但也有个别基因会异常激活，端 粒 DNA 丢失，线粒体 DNA 特异性缺失，DNA 氧化、断裂、缺失和交联，甲 基化程度降低。mRNA 和 tRNA 含量降低。不饱和脂肪酸被氧化，引起膜脂之 间或与脂蛋白之间交联，膜的流动性降低。蛋白质合成下降，细胞内蛋白质发 生糖基化、氨甲酰化、脱氨基等修饰反应，导致蛋白质稳定性、抗原性，可消 化性下降，自由基使蛋白质肽断裂，交联而变性。氨基酸由左旋变为右旋。酶 分子的活性中心被氧化，金属离子 Ca2+、Zn 2+、Mg 2+、Fe 2+等丢失，酶分子的 二级结构，溶解度，等电点发生改变，总的效应是酶失活。 生理功能上，细胞的增殖能力下降，细胞活力减弱。 2. 细胞衰老的表征及检测方法 可以通过形态学观察、衰老标志性物质检测及细胞增殖能力检测来评价细胞 衰老。其中，衰老标志性物质检测包括端粒长度和端粒酶活性测定，ROS 水平 检测，SA- 半乳糖苷酶活性测定，以及与衰老相关通路中重要蛋白表达的测 定。 1）端粒长度和端粒酶活性 端粒是真核生物线性染色体末端重复 DNA 序列和蛋白质结合形成的复合结 构，端粒缩短被认为是触发细胞衰老的分子钟，可作为细胞衰老的标记。端粒 长度由端粒酶维持，衰老细胞端粒缩短，端粒酶活性下降。 端粒长度检测：荧光原位杂交定量法(Q-FISH),试剂盒 Q-FIsH 即采用荧光标记的核酸探针在变性后与已变性的经固定的细胞或染 色体中DNA、RNA(玻片上的标本)在复性时进行碱基互补杂交，继而通过检测荧 光杂交信号，对特异DNA 或RNA 序列在染色体或DNA上进行定位、定性、相对定 量的检测和分析。 由于特定端粒的荧光信号强度与该端粒重复序列的长度直接相关，因此Q- FISH可用于测定特定染色体上的端粒长度，并将测得的每个端粒荧光信号强度 值转化为相对端粒长度(RTL：某一特定端粒的信号强度占所在细胞中所有端粒 信号强度之和的比例，以千分数表示)，以便对端粒长度进行标准化描述并对染 色体与染色体之间、细胞与细胞之间、样本与样本之间的端粒长度进行比较。 虽然不同个体同一染色体上的端粒绝对长度不同，但同一染色体上的端粒长度 占其所在细胞端粒总长度的比例是一定的，即不同个体同一染色体的相对端粒 长度值应该是一定的，因此用某一染色体的相对端粒长度值来估计此染色体的 端粒长度，并与其他染色体进行比较，进一步比较46条染色体端粒长度之间的 差异。 端粒酶活性检测：TRAP-ELISA法,试剂盒 分离纯化的造血干细胞，通过端粒重复序列扩增法(TRAP)循环扩增端粒重 复序列，产物经 ELISA 检测，判定端粒酶功能活性。 1. ROS 含量测定 自由基和 ROS 在衰老的细胞和组织内累积，可采用 DCFH-DA 试剂盒测定 细胞中活性氧含量。 2） SA- 半乳糖苷酶活性：细胞衰老 -半乳糖苷酶染色试剂盒 -半乳糖苷酶是一类重要的糖苷水解酶，可催化 -半乳糖苷键发生水解。 且 SA-半乳糖苷酶仅在衰老细胞中表达，在正常细胞、静止期细胞和永久性 细胞或肿瘤细胞中不含 SA-半乳糖苷酶。细胞衰老 -半乳糖苷酶染色试剂盒，以 5-溴-4-