台盼蓝排斥试验和ldh

台盼蓝排斥试验和 LDH 试验表明，没有明显的毒性作用在 浓度水平（0 0.5 毫克/毫升）使用的研究。这些 的调查结果提高的可能性，可能代表了一种新的 PFD 为预防术后的治疗剂。 PFD 是一种抗炎和抗纤维化剂， 展品范围内许多类型的细胞的抑制作用 浓度 0.2 至 2 毫克 /毫升，没有或很少的毒性作用 TGF-（转化生长因子-）信号通路在调控干细胞活性和器官形成中发挥着重要的作用，当 TGF- 信 号通路各成员活性未激活时，体内会自发性发生多种癌症，这表明 TGF- 定向调节干细胞对癌症形成也 具有不可或缺的功能。 TGF- 超家族包含接近 30 个生长和分化因子，其中有 TGF- s，活化素(activin)， inhibins 和骨形态发生蛋白 (BMPs) 。下游的跨膜 TGF- 受体是 多个 SMAD 蛋白，这些蛋白是 TGF- 超家族信号传递的重要调控分子，并在不同层面上受多种多样精确的调控。 TGF- 与 TGF-II 型受体（ TGF-RII）结合后，再激活募集 TGF- I 型受体（ TGF- RI）组合后形 成二聚体形式的受体复合物。TGF- RII 磷酸化 TGF- RI 的甘氨酸-丝氨酸富集区域（GS 序列）并活 化 TGF- RI 的丝氨酸/苏氨酸活性。活化的 TGF- RI 反过来又磷酸化受体相关 smad 蛋白。脊椎动物 中目前发现的 smad 蛋白至少有 9 种，分别是(a)受体调节的 Smads （R-Smads ）： Smad 1, Smad 2, Smad 3, Smad 5, and Smad 8; (b)共调节 Smads: Smad 4 and Smad 10;（c）抑制性 Smads(I-Smads): Smad 6 and Smad 7。Smad 2,和 Smad 3 参与 TGF- 和活化素信号通路，而 Smad 1、Smad 5 和 Smad 8 调节 BMP 信号通路。R-Smads 和 Smad 4 主要位于细胞质中，它们的活性主要受衔接蛋白调节， 如 Smad 锚定受体激活蛋白（SARA）和 ELF。Smad 2 和 Smad 3 直接被 TGF- RI 磷酸化, 使得构象 发生改变从而从受体复合物中释放出来。Smad 4 蛋白的 MH2 结构域识别 R-Smads C 端的磷酸丝氨酸从 而形成异质二聚体复合物（R-Smad/C-Smad）。这些复合物转运至细胞核，核内 Smad 蛋白与同源 DNA 结合，吸附力较低，但在转录共激活因子的作用下可增强亲和性。Smad 3 和 Smad 4 结合于称为 SBE 的 DNA 序列，而 Smad 2 通过与 Smad 4 的相互作用与 DNA 复合物反应。Smad 蛋白在细胞质和细胞核 间进行依赖性磷酸化的穿梭对于 TGF- 信号的动态调控具重要意义。 本信号转导涉及的信号分子主要包括： Shc， GRB2， SARA， Smad1， Smad2，Smad3，Smad4，Smad5，Smad6，Smad7，Smad8， SOS， Ras，RhoA ，Rac，Cdc42 ， Erk1，Erk2， mDia，MLC ，ROCK，LIMK，PAK，c- Abl， Cofilin，Par6，PKC ，PI3K ，Akt，mTOR ，P38 ，P70，S6K，PP2A ，TAK1，MLK3，MEKK1，MKK3 ，MKK4，MKK6，JNK，Smurf1， Smurf2，CBP， TF 等 PFD 对 SRA01/04 细胞增殖的抑制作用 细胞 PFD 显示对 HLECs 增殖其抑制作用 （图 1）。细胞增殖减弱在 0.3 毫克/毫升 24 小时与对照组（P =0.044）相比，后组。 效果更明显的为 0.5mg / ml 组在 24，48， 和 72 小时（P，0.05）。增殖几乎完全 抑制用 1 毫克/毫升的 PFD 在所有的时间点（P，0.01）。该测定法在 0.2 重复通过精炼的浓度，0.25， 0.3，0.4 0.5 和 0.6 毫克/毫升在三个独立的实验。24 小时后治疗，抑制开始在 0.25 毫克/毫升和 达到在 0.5 毫克/毫升的最大效果。百分之五十抑制浓度 PFD 对 HLECs 增殖（IC 50）为 0.47。根据方差 的重复测量分析，还有就是 PFD 浓度之间显著互动和持续时间（P，0.01）。鉴于这些结果，下面的进行 实验与使用 0.25 和 0.5 毫克/毫升 PFD24 小时的观察。SRA01 的/ 04 细胞的细胞活力治疗后 PFD 在台盼蓝排除试验，经过 24 小时的治疗用 PFD，活细胞的百分比分别为 97.0664.3,93.7561.6，93.8562.9，而对于控制 95.1664.8,0.3，0.5，和 1 毫克/毫升的 PFD 组， 分别为（图 2）。那里 是组间差异无统计学差异显著（P.0.05）。在 LDH 测定中，24 小时后，“治疗具有 PFD，所述 细胞介导的裂解的比例分别为 13.2265.3， 14.4263.9，而对于控制 18.1863.3，0.25 和 为 0.5mg / ml 的 PFD 基和细胞介导的百分比 裂解后 48 小时的人 16.1763.1，14.5161.9，和 为控制 20.3761.6，0.25 和 0.5 毫克/毫升的 PFD 基。 PFD 对 SRA01/04 细胞无毒性显著影响 （P.0.05）（图 3）。 PFD 抑制的 TGF-B2 诱导成纤维细胞表型 在 SRA01/04 细胞 Epithlial - 间质转化 经过 24 小时的治疗，12.5 纳克/毫升 TGF-B2 时，TGFb2- 在 SRA01/04 细胞诱导的形态学改变 检测。所述细胞被拉长，并开始为纺锤状 形状。诱导由 TGF-B2 的形态学改变 明显地抑制通过共治疗用 0.5 毫克/毫升的 PFD24 小时。有在 SRA01/04 没有明显的形态变化 24 小时处理，用 0.5 毫克后细胞/ ml 的 PFD 只。 （图 4）。免疫细胞荧光表明，TGF-2 显著上调间充质表型标记 纤维连接蛋白（FN）在 SRA01/04 细胞与对照组相比。 及 FN 被显著下调后 24 小时 用 0.5 毫克/毫升的 PFD 治疗在不存在或存在 12.5 纳克/毫升 TGF-2。 （图 5）。 PFD 对 TGF-B2 引起的迁移抑制作用 SRA01 的/ 04 细胞 HLEC 的迁移后显著减少 24 小时后（图 6）中处理的 PFD（0.25 和 0.5 毫克/毫升）的 没有或 12.5 纳克/ ml 的 TGF-B2 存在。在没有 TGF-B2，迁移率分别为 84.9，63.1，51.0，63.4， 和用于控制 14.963.4，为 0.25 和 0.5 毫克/毫升基， 分别。在 TGF-B2 处理组，在迁移率 分别为 91.3，62.8，60.9，63.2和 26.1，为 62.7 控制，分别为 0.25 和 0.5 毫克/毫升基，（P，0.05 群体之间）。PFD 对 TGF-B2 和 Smad 蛋白基因表达的影响在 SRA01/04 细胞蛋白 一个显著下调 TGF-B2，SMAD3 和 SMAD4 的 mRNA 的 HLECs 示于 PFD 的治疗组（P，0.01） 与对照（图 7）相比较。 TGF-b2 的表达式，SMAD3 和 SMAD4 蛋白在抑制显著 0.25 浓度（P，0.05）和 0.5 毫克/毫升（P，0.01）通过免疫印迹分析（图 8）的控制。其效果是剂量依赖性。我们扫描的 TGF- B2，SMAD3 表达和 SMAD4 蛋白 HLECs 还通过免疫荧光法根据共聚焦显微镜（图 9）。这些蛋白质可以是检 测表达内的细胞，几乎在细胞质根据免疫荧光测定。治疗后的 0.25 和 0.5 毫克/毫升的 PFD24 小时后， TGF-B2，SMAD3 和 SMAD4 蛋白免疫细胞化学染色 HLECs 非常微弱根据共焦显微镜。PFD 对 TGF-B2 诱导表达 的抑制作用 Smad 蛋白的蛋白质对 TGF-b2 的存在下，PFD 降低 TGF-B2-诱导 Smad2 和 Smad3 蛋白在显著表 达的 0.5 毫克/毫升（P，0.05）与对照组相比浓度组由免疫印迹分析。的抑制作用可能是检测到，但没有 在 0.25 毫克/毫升统计学显著 PFD 组。 （图 10）。PFD 抑制的 TGF-B2 引起的核转 Smad 蛋白在不存在的 TGF-B2，核 SMAD2/ 3 染色的和 SMAD4 蛋白 HLECs 是通过免疫荧光非常微弱检测。刺激由 12.5 纳克/ ml 的 TGF-B2 后 24 小时， 共聚焦下可检测的 Smad 核易位显微镜：核 SMAD4 的 1.染色增强，而对 SMAD4 在细胞质被削弱; 2.SMAD2/3 的蛋白被组装在核膜和其中的一些 进入细胞核。对 TGF-b2 的存在下，晶核 SMAD2/ 3 和细胞核 SMAD4 减少在 0.25 和 0.5 毫克/毫升的 PFD 的 用激光共聚焦下的对照组相比，治疗组 显微镜用倍率为 1000，并且抑制效果 为 0.5mg/ ml 的 PFD 更强（图 11）。因此， 根据我们的免疫细胞化学，PFD 可能结果 阻断的 Smad2/3 的 TGF-B2 诱导核易位 和 SMAD4 在 HLECs。 讨论 这是首次有研究显示在 PFD 的抑制作用 TGF-B2 引起的增殖，迁移和 epithlial 间充质 HLEC（SRA01/04 细胞）的过渡中，关键的细胞是 参与 PCO 的发展。效果似乎遵循 以剂量依赖性的方式。台盼蓝排斥试验和 LDH 实验表明，在无显著毒性作用 在这项研究中使用的浓度水平（0-0.5 毫克/毫升）。这些 研究结果提出了 PFD 可能代表一种新的可能性 治疗剂用于预防 PCO 的。 PFD 是抗炎和抗纤维化剂和它 表现出的范围内的宿主细胞类型上的抑制作用 浓度为 0.2 至 2.0 毫克/毫升，没有或很少的毒性作用 TGFB2 和的 Smad 蛋白 SRA01/04 细胞图 9.表达处理后，用吡非尼酮通过免疫组化 根据共聚焦显微镜检测。 TGFB2（A）中，SMAD3（B）和 SMAD4（C）在细胞质中（红色）和细胞核（蓝色） 的 HLECs 被染色 0.25（A2，B2，C2），和 0.5 毫克/毫升（A3，B3，C3）的吡非尼酮，分别处理后免疫细胞化学。 （A0，B0，C0）对应 阴性对照。放大倍数，6400。 DOI：10.1371/ journal.pone.0056837.g009 吡非尼酮与人类晶状体上皮细胞线体外。PFD 显著抑制肝星状细胞增殖 细胞（含有 0.19 毫克/毫升的最大效果）23，大鼠肾 成纤维细胞（0.2 毫克/毫升）24，子宫肌层和平滑肌瘤细胞 （1.0 毫克/毫升）25。 PFD 也对眼部的抑制作用 细胞。我们以前的研究表明，PFD 抑制细胞增殖， HTFS 体外的迁移和胶原蛋白收缩 浓度范围从 0.15 至 0.3mg/ ml 的无毒性作用 19,20。金 H 等。报告说，PFD（1.9 毫克/毫升）也 抑制眼眶成纤维细胞的生长，从患者获得 与甲状腺相关眼病（TAO）26。财 等。证明 PFD 的抑制作用（0.25 至 0.5 毫克/毫升） 关于在人视网膜色素上皮细胞株的 TGF-B 介导的纤维形成 ARPE-1927。在目前的研究中，我们还发现，该 PFD 对增殖最大抑制浓度， HLECs 迁移为 0.5mg/ ml 和没有引起毒性作用。 我们所使用的无限细胞系（SRA01/04）中的转 含有 SV40 的从 T 抗原的质粒载体 DNA HLECs 在 1998 年原代培养22，它已被广泛 在体外用于研究白内障的潜在机制 形成。 TGF-B2 信号起着 PCO 发展的关键作用 后发性白内障手术。 TGF-B2 可以激活其下的流 SMAD 途径和调解跨分化的调节 和基质收缩，并最终向 PCO 的形成28。我们组和其他研究有 以前曾表明，PFD 可以下调的表达 TGF-BS 在 HTFS 和其他许多人的细胞（如 HLECs， 肝星状细胞和肾成纤维细胞）19,23,24,29。财 等。已经阐明了 TGF- 的信号传导途径作为目标 的 PFD 和 PFD 的抑制作用抑制 TGF-b 信号 通过阻止积极的 Smad2/3 复合物的核积累 而不是在视网膜色素上皮细胞的磷酸化的 Smad2/3 的27。在 目前的研究中，我们提供了新的证据表明，PFD 展出了其 抑制作用通过抑制 TGF-B-Smad 信号通路： PFD 抑制 TGF-B2 的蛋白和基因表达，压下 Smad 蛋白的蛋白质的 TGF-B2-诱导表达，并且还 防止 Smad 蛋白核积累和转移 蛋白质 HLECs。因为我们知道，旁边 SMAD2/ 3/4 核 易位，TGF-B 受体诱导的反应介导的 通过众多的信号传导途径，如 TGF- 的诱导 ERK 活化和酪氨酸磷酸化，TGF- 的诱导 JNK / p38 的活化和 P13K/ Akt 途径，诱导各种 不同的反应30。并有之间的交叉对话 TGF-B/ Smad 蛋白和其他细胞信号通道31。再论 研究来研究其他分子 med