超声波辅助酶法提取胡桃楸种仁壳多糖的工艺优化

-精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 1 超声波辅助酶法提取胡桃楸种仁壳 多糖的工艺优化 摘要：为确定胡桃楸（Juglans mandshurica）种仁壳多糖超声波辅助酶 法提取工艺条件，在单因素试验基础上， 选取纤维素酶添加量、超声时间、超声 功率为自变量，多糖得率为响应值，采 用响应面法模拟得到二次多项式回归方 程，并确定种仁壳多糖最佳工艺参数为 纤维素酶添加量 0.31%，超声时间 40 min，超声功率 400 W。其中超声功率 对胡桃楸种仁壳多糖得率影响最大，其 次是纤维素酶添加量，影响最小的是超 声时间，回归模型预测的多糖得率理论 值为 1.35%。经验证试验，RSD 为 0.97%， 该回归方程与实际情况拟合较好。 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 2 中国论文网 /8/view-12920538.htm 关键词：胡桃楸（Juglans mandshurica）种仁壳；多糖；提取工艺； 酶法；超声波；响应面 中图分类号：S792.132；TS255.1 文献标识码：A 文章编号： 0439- 8114（2017）07-1315-05 DOI：10.14088/ki.issn0439- 8114.2017.07.030 Optimization of Ultrasonic-assisted Enzyme Extraction of Polysaccharide from Juglans mandshurica Seed Shell by Response Surface Methodology WANG Qiu-yang，SHA Di，XU Hong-yan （College of Agricultural，Yanbian University， Yanji 133002，Jilin，China） Abstract：To optimize ultrasonic- assisted enzyme extraction of polysaccharide from seed shell of Juglans mandshurica，single factor test were -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 3 carried out. Based on this，enzyme amount，ultrasonic time and ultrasonic power were selected as variables. And a mathematical model was obtained according to response surface methodology. Results showed that the following optimum parameters：enzyme amount 0.31%，ultrasonic time 40 min，ultrasonic power 400 W. The effect of ultrasonic power on the extraction yield of polysaccharides was primary，effect of enzyme amount was secondary，and effect of ultrasonic time was last. The predicted value of extraction yield of polysaccharide was 1.35%. After confirmatory test，the relative standard deviation was 0.97%. The regression equation was fitting better with actual situation. Key words：Juglans mandshurica seed shell； polysaccharide；extraction technology； enzyme；ultrasonic-assisted -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 4 extraction；response surface methodology 胡桃楸（Juglans mandshurica） 又名核桃楸、山核桃、楸洌 为胡桃 科胡桃属落叶乔木，在东北分布广阔1， 是珍贵的用材树种，也是重要的药源植 物，其叶、树皮、根及果实均可入药2。 胡桃楸与水曲柳、黄菠萝并称“东北三 大硬阔”3，是国家级保护植物4。研 究证实，胡桃楸具有抗氧化、抗肿瘤、 镇痛、抗炎和杀菌等作用5。胡桃楸种 子是林业副产品，其种仁（俗称山核桃 仁）营养价值很高，早已成为人们的食 疗佳品，成为研究和关注的热点6，7。 在种仁生产过程中，产生大量的种仁壳 废弃物，研究显示，胡桃楸种仁壳中含 有氨基酸、多糖、皂甙、黄酮、挥发油、 强心甙、香豆素类等8多种化学成分。 目前，对胡桃楸种子的研究主要集中在 种仁的营养成分和在食品加工中的应用 方面9 ，10 ，关于种仁壳的研究较少 11-14，而有关种仁壳多糖的相关研究 鲜见报道。 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 5 多糖（Polysaccharides，PS）又 称多聚糖，是由 10 个以上的单糖分子 通过糖苷键聚合而成，是一类大分子化 合物15。多糖广泛存在于动物细胞膜、 高等植物和微生物细胞壁中，从量上讲， 是碳水化合物在自然界中存在的主要形 式16。多糖是中草药的主要活性成分 之一，受到生物医学和功能性食品领域 的广泛关注17 ，研究发现其具有免疫 调节、抗菌、抗炎、抗病毒等生物功能 18，具有高效、低毒的特点，并已得 到广泛应用19-21 。 本研究以加工胡桃楸种仁产生的 废弃物种仁壳为原料，采用响应面法优 化超声波辅助酶法提取种仁壳多糖的条 件，旨在为种仁壳多糖的深入研究提供 理论依据，可提高长白山胡桃楸种子的 附加值，促进其综合开发利用。 1 材料与方法 1.1 材料、试剂与仪器 胡桃楸种子：由吉林省和龙市林 业局提供。 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 6 无水葡萄糖、5%苯酚溶液、浓 硫酸，均为分析纯。 UV-1800 型紫外可见分光光度计，上海美谱达仪 器有限公司；KQ-500DE 型数控超声波 清洗器，昆山市超声仪器有限公司； BSA124S-CW 型电子天平，赛多利斯科 学仪器有限公司。 1.2 方法 1.2.1 提取工艺 胡桃楸种仁壳 粉碎过 60 目筛80%乙醇回流提取 抽滤粉末晾干加去离子水酶解 超声波提取离心收集上清液浓 缩醇沉离心收集沉淀丙酮、乙 醚洗涤去离子水定容测多糖含量。 1.2.2 标准曲线的绘制 按 Xu 等 22采用苯酚 -硫酸法，精确称取 105 真空干燥至恒重的无水葡萄糖 24.0 mg，去离子水 100 mL 定容，得到浓度 为 0.24 mg/mL 的多糖溶液。精确移取 0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL 多糖溶液于比色管中，再分别加 2.8、2.7、2.6、2.5、2.4、2.3、2.2 mL -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 7 去离子水，然后依次加入 1.0 mL 5%苯 酚溶液、5.0 mL 浓硫酸，混匀，40 水浴 15 min，然后冷水冷却 10 min，去 离子水作空白，于 490 nm 波长测定吸 光度，以吸光度（y）对葡萄糖浓度 （x）作回归处理。得到标准曲线回归 方程为 y=0.009 7x+0.006 6，R2=0.994 7。 1.2.3 多糖含量的测定 按张帅等 23方法计算多糖得率，按照以下公式： 多糖得率=C/1 000nV/m100% 式中，C 为按标准曲线计算的多 糖质量浓度（mg/mL） ，n 为稀释倍数， V 为液体体积（mL） ，m 为原料干质量 （g） 。 1.2.4 单因素试验 以多糖得率为 指标，以纤维素酶添加量、料液比、超 声温度、超声时间、超声功率为因素， 进行胡桃楸种仁壳多糖提取的单因素试 验。 1.2.5 响应面优化试验设计 根据 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 8 Box-Behnken 中心组合试验设计原理， 采用三因素三水平响应面法，以纤维素 酶添加量、超声时间、超声功率 3 个因 素为自变量，以多糖得率为响应值，采 用最小二乘法拟合二次多项方程表达响 应值，试验因素和水平见表 1。 1.2.6 验证试验 按照响应面优化 的最佳工艺条件，提取胡桃楸种仁壳多 糖，进行 3 次试验，考察响应面优化工 艺条件的可行性。 1.3 统计分析 采用 Minitab15 软件进行试验方 案设计与统计分析。 2 结果与分析 2.1 单因素试验结果 2.1.1 纤维素酶添加量对胡桃楸 种仁壳多糖得率的影响 取胡桃楸种仁 壳粉 5 g，按 120 加入去离子水 （gmL，下同） ，调 pH 为 4.5，分别 加入 0.1%、 0.2%、 0.3%、0.4%、0.5%、0.6%的 纤维素酶酶解，40 超声提取 30 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 9 min，超声功率 300 W，考察纤维素酶 添加量对多糖得率的影响，结果见图 1。由图 1 可知，随着纤维素酶添加量 的增多，多糖得率逐渐增加，当添加量 为 0.3%时，多糖得率最大，之后开始 下降。这可能是纤维素酶添加量过大， 底物完全反应后，过量的纤维素酶进一 步分解糖苷键而导致得率下降，故选择 0.3%为纤维素酶最佳添加量。 2.1.2 料液比对胡桃楸种仁壳多 糖得率的影响 取胡桃楸种仁壳粉 5 g， 按料液比 110、120、130、140、150 、160 加入去离子水，调 pH 为 4.5， 加 0.3%的纤维素酶酶解，40 超声提 取 30 min，超声功率 300 W，考察不同 料液比对多糖得率的影响，结果见图 2。由图 2 可知，随着料液比的增加， 多糖得率逐渐增加，料液比小于 140 时，增加幅度较大，之后呈缓慢 增长的趋势。故选择 140 为最佳提取 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 10 料液比。 2.1.3 超声温度对胡桃楸种仁壳 多糖得率的影响 取胡桃楸种仁壳粉 5 g，按料液比 140，调 pH 为 4.5，加 0.3%的纤维素酶酶解，分别在 40、50、60、70、80 条件下，超声功 率 300 W，超声提取 30 min，考察超声 温度对多糖得率的影响，结果见图 3。 如图 3 所示，随着超声温度的升高，多 糖得率不断增大，在 50 时，多糖得 率达到最大，之后又开始下降，主要是 由于纤维素酶要在适合的温度下才能发 挥酶解作用，温度过高抑制了纤维素酶 的活性，从而导致多糖得率的下降。因 此，确定最佳超声温度为 50 。 2.1.4 超声时间对胡桃楸种仁壳 多糖得率的影响 取胡桃楸种仁壳粉 5 g，料液比 140，调 pH 为 4.5，加 0.3%的 纤维素酶酶解，50 条件下，超声功率 300 W，分别超声提取 10、20、30、40、50、60 min，考察超 声时间对多糖得率的影响，结果见图 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 11 4。由图 4 可知，随着提取时间的延长， 多糖得率逐渐增加，当超声时间为 40 min 时，多糖得率最大，之后随着时间 延长，多糖得率呈下降趋势，可能是由 于长时间超声作用使部分多糖被超声波 的剪切力降解以及非糖类杂质溶出过多， 影响多糖得率。因此，确定最佳超声时 间为 40 min。 2.1.5 超声功率对胡桃楸种仁壳 多糖得率的影响 胡桃楸种仁壳粉 5 g， 料液比 140，调 pH 为 4.5，加 0.3% 的纤维素酶酶解，50 条件下，分别在 250、300、350、400、450、500 W 的 超声功率下，超声提取 40 min，考察超 声时间对多糖得率的影响，结果见图 5。由图 5 可知，随着超声功率的增大， 多糖得率逐渐增加，当超声功率达到 400 W 时，多糖得率最大，再增大功率 则多糖得率呈下降趋势，可能是由于超 声波的机械作用过大，导致多糖结构被 破坏而影响多糖得率。因此，确定最佳 超声功率为 400 W。 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 12 2.2 响应面法优化胡桃楸种仁壳 多糖提取工艺 2.2.1 响应面试验结果 根据响应 面法中的 Box-Behnken 试验原理，按表 2 进行试验，对试验结果进行二次多项 式逐步回归拟合，得到回归模型 Y=1.283 33+0.051 25X1-0.036 25X2+0.100 00X3-0.064 17X12-0.214 17X22-0.116 67X32+0.010 00X1X2+0.032 50X1X3+0.047 50X2X3。 2.2.2 模型的显著性 检验 模型的可靠性可以从方差分析及 相关系数来考察，结果见表 3 和表 4。 由表 3 可知，一次项 X3 对多糖得率影 响显著（P0.05 ） 。 由表 4 可知，模型的相关系数 R2=0.921 1，对种仁壳多糖提取所建立 的二次多项模型回归项 P 值为 0.027， 具有显著性（P0.05 ） 。因此，该模型拟 合度较好，可以用此模型对胡桃楸种仁 壳多糖提取进行分析和预测。 图 6图 8 分别为纤维素酶添加 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 13 量、超声时间、超声功率 3 个因素影响 胡桃楸种仁壳多糖得率的响应面和等值 线。 综合分