pcr技术的基本原理

定 义 聚 合 酶 链 式 反 应 （ 英 文 全 称 ： Polymerase Chain Reaction） ， 简 称 PCR。 聚 合 酶 链 式 反 应 (PCR)是 体 外 酶 促 合 成 特 异 DNA 片 段 的 一 种 方 法 ,由 高 温 变 性 、 低 温 退 火 （ 复 性 ） 及 适 温 延 伸 等 几 步 反 应 组 成 一 个 周 期 ,循 环 进 行 ,使 目 的 DNA 得 以 迅 速 扩 增 , 具 有 特 异 性 强 、 灵 敏 度 高 、 操 作 简 便 、 省 时 等 特 点 。 它 不 仅 可 用 于 基 因 分 离 、 克 隆 和 核 酸 序 列 分 析 等 基 础 研 究 ,还 可 用 于 疾 病 的 诊 断 或 任 何 有 DNA,RNA 的 地 方 聚 合 酶 链 式 反 应 （ Polymerase Chain Reaction， 简 称 PCR） 又 称 无 细 胞 分 子 克 隆 或 特 异 性 DNA 序 列 体 外 引 物 定 向 酶 促 扩 增 技 术 。 PCR 技术的基本原理 类似于 DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR 由 变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成： 模板 DNA的变性：模板 DNA经加热至 93左右一定时间后，使模板 DNA双链或经 PCR扩增形成的双链 DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； 模板 DNA与引物的退火(复性)：模板 DNA经加热变性成单链后，温度降至 55左右， 引物与模板 DNA单链的互补序列配对结合； 引物的延伸：DNA 模板-引物结合物在 TaqDNA聚合酶的作用下，以 dNTP为反应原 料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半 保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链” ，而且这 种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 24 分钟， 23 小时就能将待扩目 的基因扩增放大几百万倍。(Plateau)。 到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷 贝。 PCR 的反应动力学 PCR的三个反应步骤反复进行，使 DNA扩增量呈指数上升。反应 最的 DNA 扩增量可用 Y(1X)n 计算。Y 代表 DNA片段扩增后的拷贝数，X 表示平(Y)均 每次的扩增效率，n 代表循环次数。平均扩增效率的理论值为 100%，但在实际反应中平均 效率达不到理论值。 反应初期，靶序列 DNA片段的增加呈指数形式，随着 PCR产物的逐渐 积累，被扩增的 DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期， 即出现“停滞 效应” ，这种效应称平台期数、PCR 扩增效率及 DNA聚合酶 PCR的种类和活性及非特异性 产物的竟争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。 PCR 扩增产物 可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限 定在两个引物链 5端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物 所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中， 以两条互补 的 DNA为模板，引物是从 3端开始延伸， 其 5端是固定的，3 端则没有固定的止点，长 短不一，这就是“长产物片段” 。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合 成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结时， 由于新链模板的 5端序列是固定 的， 这就等于这次延伸的片段 3端被固定了止点， 保证了新片段的起点和止点都限定于 引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段” 。不难看出“短产物片段”是按指数倍 数增加， 而“长产物片段”则以算术倍数增加， 几乎可以忽略不计， 这使得 PCR的反应 产物不需要再纯化，就能保证足够纯 DNA片段供分析 电 泳 检 测 时 间 一 般 为 48h 以 内 ， 有 些 最 好 于 当 日 电 泳 检 测 ， 大 于 48h 后 带 型 不 规 则 甚 至 消 失 。 假 阴 性 ， 不 出 现 扩 增 条 带 PCR 反 应 的 关 键 环 节 有 模 板 核 酸 的 制 备 ， 引 物 的 质 量 与 特 异 性 ， 酶 的 质 量 及 ， PCR 循 环 条 件 。 寻 找 原 因 亦 应 针 对 上 述 环 节 进 行 分 析 研 究 。 模 板 ： 模 板 中 含 有 杂 蛋 白 质 ， 模 板 中 含 有 Taq 酶 抑 制 剂 ， 模 板 中 蛋 白 质 没 有 消 化 除 净 ， 特 别 是 染 色 体 中 的 组 蛋 白 ， 在 提 取 制 备 模 板 时 丢 失 过 多 ， 或 吸 入 酚 。 模 板 核 酸 变 性 不 彻 底 。 在 酶 和 引 物 质 量 好 时 ， 不 出 现 扩 增 带 ， 极 有 可 能 是 标 本 的 消 化 处 理 ， 模 板 核 酸 提 取 过 程 出 了 毛 病 ， 因 而 要 配 制 有 效 而 稳 定 的 消 化 处 理 液 ， 其 程 序 亦 应 固 定 不 宜 随 意 更 改 。 酶 失 活 ： 需 更 换 新 酶 ， 或 新 旧 两 种 酶 同 时 使 用 ， 以 分 析 是 否 因 酶 的 活 性 丧 失 或 不 够 而 导 致 假 阴 性 。 需 注 意 的 是 有 时 忘 加 Taq 酶 或 溴 乙 锭 。 引 物 ： 引 物 质 量 、 引 物 的 浓 度 、 两 条 引 物 的 浓 度 是 否 对 称 ， 是 PCR 失 败 或 扩 增 条 带 不 理 想 、 容 易 弥 散 的 常 见 原 因 。 有 些 批 号 的 引 物 合 成 质 量 有 问 题 ， 两 条 引 物 一 条 浓 度 高 ， 一 条 浓 度 低 ， 造 成 低 效 率 的 不 对 称 扩 增 ， 对 策 为 ： 选 定 一 个 好 的 引 物 合 成 单 位 。 引 物 的 浓 度 不 仅 要 看 OD 值 ， 更 要 注 重 引 物 原 液 做 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 ， 一 定 要 有 引 物 条 带 出 现 ， 而 且 两 引 物 带 的 亮 度 应 大 体 一 致 ， 如 一 条 引 物 有 条 带 ， 一 条 引 物 无 条 带 ， 此 时 做 PCR 有 可 能 失 败 ， 应 和 引 物 合 成 单 位 协 商 解 决 。 如 一 条 引 物 亮 度 高 ， 一 条 亮 度 低 ， 在 稀 释 引 物 时 要 平 衡 其 浓 度 。 引 物 应 高 浓 度 小 量 分 装 保 存 ， 防 止 多 次 冻 融 或 长 期 放 冰 箱 冷 藏 部 分 ， 导 致 引 物 变 质 降 解 失 效 。 引 物 设 计 不 合 理 ， 如 引 物 长 度 不 够 ， 引 物 之 间 形 成 二 聚 体 等 。 Mg2+浓 度 ： Mg2+离 子 浓 度 对 PCR 扩 增 效 率 影 响 很 大 ， 浓 度 过 高 可 降 低 PCR 扩 增 的 特 异 性 ， 浓 度 过 低 则 影 响 PCR 扩 增 产 量 甚 至 使 PCR 扩 增 失 败 而 不 出 扩 增 条 带 。 反 应 体 积 的 改 变 ： 通 常 进 行 PCR 扩 增 采 用 的 体 积 为 20ul、 30ul、 50ul。 或 100ul， 应 用 多 大 体 积 进 行 PCR 扩 增 ， 是 根 据 科 研 和 临 床 检 测 不 同 目 的 而 设 定 ， 在 做 小 体 积 如 20ul 后 ， 再 做 大 体 积 时 ， 一 定 要 模 索 条 件 ， 否 则 容 易 失 败 。 PCR 反 应 的 分 类 SOEing-PCR（ 重 叠 PCR） ： 重 叠 区 扩 增 基 因 拼 接 法 ， 是 基 于 普 通 PCR 技 术 衍 生 出 的 一 种 基 因 融 合 和 定 点 突 变 的 有 效 方 法 。 众 所 周 知 ， 由 于 引 物 只 需 要 与 模 板 有 效 结 合 ， 尤 其 是 5端 序 列 不 必 与 模 板 完 全 配 对 ， 因 此 扩 增 引 物 的 5端 可 以 添 加 一 种 甚 至 是 两 种 酶 切 位 点 ， 以 便 于 后 期 克 隆 。 SOEing 法 正 是 利 用 这 一 特 点 ， 向 两 个 独 立 基 因 掺 入 一 段 新 的 序 列 以 达 到 两 个 基 因 出 现 一 个 重 叠 区 的 目 的 ， 3端 的 结 合 使 基 因 融 合 或 定 点 突 变 得 以 实 现 。 RT-PCR（ 逆 转 录 PCR） ： RT-PCR 为 反 转 录 RCR（ reverse transcription PCR） 和 实 时 PCR（ real time PCR） 共