医学ppt课件大全荧光化学发光在植物分子生物学的应用

荧光 /化学发光在植物分子生物学的应用 陈海旭 博士 Outline 1、 荧光技术 2、化学发光技术 1、 荧光技术 荧光技术的分类 1) 荧光强度 2) 时间分辨荧光 3) 荧光偏振 4) 荧光共振能量传递 5) 均相时间分辨荧光 1）荧光强度（ FI） S1 inner orbital outer orbital nucleous Excitation Signal Ex Em So Emission Signal FI应用的优势 灵敏度高， 使用方便、安全 可以灵活地利用 各种类型的荧光探针和荧光染料 对目标物质进行特异性标记，大大减少杂质的信号 干扰 可以进行活细胞或活体检测（细胞毒性小） 可以进行多重专一性标记（如蓝色细胞核 /红色线 粒体） FI应用范围 生物大分子的定量分析 核酸、蛋白质 酶活性分析 糖甘酶、蛋白酶、脱氢酶、过氧化物酶 钙流检测 报告基因检测（ GFP） FI应用核酸定量分析 Picogreen荧光染料 可以排除蛋白质等的信号干扰（用 于检测蛋白质样品中的微量核酸） Arabidopsis Chromatin DNA The Plant Cell, 18461858, 2003(15) Tobacco RNA The Plant Cell, 22032217, 2003(15) FI应用糖苷酶活性分析 b-D-glucosidase 4-MUb-D-glucopyranoside b-D-fucosidase 4-MUb-D-fucoside Decreased Glucosidase and Fucosidase Activity in nai1-1 and nai1-2 Arabidopsis Mutants. (Plant Cell, 15361549, 2004-16) FI应用蛋白酶活性分析 Fractionation of Soybean Proteases after Oxidative Stress. (H2O2 treated vs. control) (Plant Cell, 431443, 1999-11) Arginine-specific Protease Z-Gly-Gly-Arg-AMC FI应用的局限性 背景荧光干扰 微孔板的自发荧光 细胞的内源荧光 2）时间分辨荧光（ TRF） Elapsed Time Intensity Excitation AutoFluorescence Fluorescein Emission Europium Emission Long Decay Time . - Measurement - 利用时间特性达到超高灵敏度 Europium ion 镧系元素 镧系元素螯合物 时间分辨荧光素镧系元素螯合物 孵育 (结合 ) 洗涤（去除非结合） 检测 缺点：需洗涤；洗涤强度很难一致，结果重复性差。 FI / TRF应用的局限性（非均相技术） 荧光偏振（ FP） 荧光共振能量转移（ FRET） 均相时间分辨荧光（ HTRF） 均相技术的优势 孵育 (结合 ) 检测 优点：无需洗涤；均一性、重复性好 “Add, Mix, and Read” 3）荧光偏振（ FP） Polarizer Analyzer 偏振光 荧光分子运动 荧光分子静止 100 % 0 % 荧光偏振（ FP） 原理 0 % 荧光偏振是一种测量分子旋转速率的技术 。 P = I | + I |_ I | I |_ 标记的配体 (低偏振值） 目标分子 与标记的配体结合 （高偏振值） FP应用方式偏振值与分子大小的关系 FP应用的优势 均相 (无分离 /洗涤），在溶液中测量 ；可以实时检测 （动力学检测）；快速，容易实现高通量 测量的是比值，结果与荧光基团的绝对浓度无关 FP应用范围 受体配体相互作用 多肽蛋白质结合 蛋白质 核酸结合 酶活性分析 淀粉酶、蛋白酶、磷酸激酶、磷酸酶 fragments Amylase Amylose FP应用淀粉酶活性分析 荧光标记的 Amylose被分解成小片段 (偏振值下降 ) 淀粉酶会促进生物体内淀粉粒的降解，进而产生更多的 能量物质，来响应某些环境刺激或促进种子萌发 。 FP应用的 局限性 使用具有较短寿命的荧光素（如 Fluorescein） 依赖于分子结合造成的分子体积的显著改变 LARGE molecule 4）荧光共振能量传递（ FRET） Binding NO Binding 均相检测（无分离和洗涤步骤） 实时连续地观察活细胞的动态变化 FRET应用的 优势 FRET应用范围 酶活性分析 蛋白酶、磷酸激酶 蛋白质 核酸相互作用 酵母双杂交系统、噬菌体展示系统所筛选克隆的复证 钙流检测、离子通道研究 蛋白质的结构研究 FRET应用钙流检测 以荧光蛋白为基础的 Ca2+ sensor 供体： CFP 受体： YFP Guard cell（ Arabidopsis） 胞浆钙离子动态 (Plant J, 1999-19, p735-747) FRET应用示例钙流检测 FRET应用胞内激酶活性分析 Indicators for protein phosphorylation in living cells 1) 已知蛋白激酶特异性 的底物结构域 2) 磷酸化识别结构域 蛋白质磷酸化是信号转导 过程中的重要标志 FRET应用的 局限性 信噪比经常不佳，通常为 1： 1 -背景主要来自受体被直接激发的信号 供体：镧系元素螯合物 受体： XL665 5） 均相时间分辨荧光（ HTRF） P APC Excitation at 320nm Emission at 665nm Time Intensity HTRF应用 的优势灵敏度更高的 FRET P Y energy transfer APC EuExcitation at 320nm Emission at 665nm Time Intensity 2、化学发光技术 化学发光技术的分类 1) 发光 2)发光共振能量传递 1）发光（ Lum） Substrate Product + Light Enzyme 优势：超高灵敏度 Lum应用范围 钙流检测 基因调控 ATP检测 发光免疫分析 发光应用钙流检测 水母发光蛋白 Aequorin Ca+ Kinetics of the -glucan（ 葡聚糖） elicitor-induced enhancement of the Ca2+cyt in soybean cells. （ Biological Procedures Online 2002- 4/1, p105-118） 发光应用示例钙流检测 发光应用基因调控 pSP-luc+ (转化拟南芥细胞 ) Cultured cells show diurnal rhythms (Arabidopsis) (Plant Cell Physiol, 2004-45/1, p57-67) CCA1的启动子区域 CCA1 在昼夜节律调节起中心作用的转录因子 发光应用示例基因调控 2）发光共振能量传递 （ BRET） Donor = Renilla luciferase (Rluc) Acceptor = YFP BRET应用范围 蛋白组学 : 蛋白 -蛋白相互作用 胞内细胞器间的相互作用 对酵母双杂交结果的验证 受体研究 : 受体的同源和异源二聚体化 受体应答传导途径 孤儿受体的筛选 BRET应用 示例 蛋白质相互作用 发光光谱 （关注 530/480 ratio）COP1的二聚体化 COP1-光形态建成的关键抑制因子 COP1蛋白突变体的二聚体化研究 (PNAS, 2004-101/17, p67986802) BRET应用 示例 蛋白质相互作用 cytoplasmic localization signal (CLS) 技术总结 荧光技术 利用荧光物质进行特异性标记；特异性好 ，灵敏度高；特别适合于细胞研究和分子间相 互作用研究。 发光技术 灵敏度超高，特别适合于基因表达和基因 调控研究。 Tecan多功能酶标