农业科学桦褐孔菌培养条件的研究

桦褐孔菌培养条件的研究胡亚鹏 1，郭胜利 2，杨淑慎 3（1、陕西众兴高科生物科技有限公司, 2、润盈生物（杨凌）有限公司，3、西北农林科技大学生命学院，陕西 杨凌 712100）摘要：对桦褐孔菌菌丝生长的营养需求及发酵条件进行了初步研究，结果表明，固体培养采用 PDA 培养基为最佳配方；发酵试验确定最佳碳源为葡萄糖，最佳氮源为玉米浆，合适的碳氮源配比为葡萄糖 2%，玉米浆 1%。同时对发酵瓶接种方法和接种量进行对比试验，确定菌悬液接种法效果好，适宜接种量为 2%。这些结果将为桦褐孔菌进一步研究提供科学依据。关键词：桦褐孔菌；固体培养；碳源；氮源；碳氮比；接种量Research of the Fermentation Conditions for Fuscoporia obliquus (Pers:Fr.) AoshimaHu Ya-peng1，Guo Sheng-li 2，Yang Shu-shen 3（1、Shannxi Zhongxing Gaoke Biotechnology Co.,Ltd. 2、Growing Bio （YangLing ） Co., Ltd, 3、Northwest A&F University, Yangling Shaanxi 712100）Abstract：Studied the nutritional needs and fermentation conditions of Fuscoporia obliquus (Pers:Fr.) Aoshima. The result show：for solid fermentation， the best recipe is PDA medium；for liquid fermentation，the best carbon source is glucose，the best nitrogen source is corn syrup，and the best ratio of them is 2% glucose and 1% corn syrup. According the contrast experiment in transfer method and seeds volumes，its found that the result is good to transfer seeds with 2% seeds by the method of suspension transfer. These results provide some basis for further researches in Fuscoporia obliquus (Pers:Fr.) Aoshima.Keyword： Fuscoporia obliqua (Pers:Fr.) Aoshima； solid fermentation；carbon source；nitrogen source； the ratio of carbon and nitrogen； transfer volumes桦褐孔菌（学名 Fuscoporia obliqua (Pers:Fr.) Aoshima）又名斜纤孔菌（Inonotus obliquus） 、蔷甘菌，在国内的商品名为白桦茸桦褐孔菌，是一种应用前景广泛的珍贵药用真菌是一种应用前景广泛的珍贵药用真菌。l6 一 l7 世纪以来，东欧、俄罗斯、波兰、芬兰等民间广泛利用桦褐孔菌来防治各种疑难杂症，如各种癌症(胃癌、肝癌、肠癌、各种消化器官癌症)、心脏病、糖尿病 1。桦褐孔菌生长环境特殊，主要生长在白桦、银桦、榆树、赤杨的树皮下或活立木的树皮下或砍伐后树木的枯干上 2。由于自然资源十分有限，人工栽培困难，本文采用摇瓶发酵技术，通过对桦褐孔菌生长所需的培养基、发酵碳氮源配比、接种方法及接种量的探索和优化，成功获得了桦褐孔菌菌丝体，为其量产提供了新的途径。1 材料与方法1.1 供试菌株桦褐孔菌（Fuscoporia obliqua (Pers:Fr.) Aoshima）由中国科学院微生物研究所提供。1.2 培养基1.2.1 平板和斜面培养基：PDA (葡萄糖)：马铃薯 20g，葡萄糖 2g，琼脂粉 2g；PSA (蔗糖 )：马铃薯 20g，蔗糖 2g，琼脂粉 2g；麸皮培养基：麸皮 5g，葡萄糖 1g，蛋白胨 0.2g，MgSO 47H2O 0.075g，K 2HPO4 0.1g，琼脂粉 2g，VB 1 0.3mg。1.2.2 种子培养基：葡萄糖 2g，玉米浆 1g，MgSO 47H2O 0.05g，KH 2PO4 0.1g，K 2HPO4 0.1g，VB 10.3mg，pH 6.56.7。1.2.3 发酵培养基：分别以玉米粉，葡萄糖，蔗糖为碳源，以麸皮，黄豆饼粉，玉米浆，蛋白胨酵母膏为氮源，(碳氮比 21) 交叉组合，添加 MgSO47H2O 0.05g，KH 2PO4 0.1g，K 2HPO4 0.1g，VB 10.3mg， pH 6.56.7。1.3 仪器与设备LRH-250A 生化培养箱；HZQ-F160A 型高低温恒温震荡培养箱；KWC旋转摇瓶机；WS70-1 型红外线快速干燥器；D2F-1 型真空干燥箱；80-2 型FUHUA 低速台式大容量离心机；Scout 电子天平；OLYMPUS CX-41 生物显微镜；MDF-VD086S 超低温冰箱；XK96-A 快速混匀器； METTLER 320 pH 计；BSW-1360 型超净工作台等。1.4 培养条件试验方法1.4.1 固体培养基试验分别选用 PDA (葡萄糖)培养基：马铃薯 20g，葡萄糖 2g，琼脂粉 2g；PSA (蔗糖)培养基：马铃薯 20g，蔗糖 2g，琼脂粉 2g；麸皮培养基：麸皮 5g，葡萄糖 1g，蛋白胨 0.2g，MgSO 47H2O 0.075g，K 2HPO4 0.1g，琼脂粉2g，VB 10.3mg，接种至平板和斜面 26恒温培养，比较生长情况。1.4.2 发酵培养基碳氮源组合试验分别以玉米粉，葡萄糖，蔗糖为碳源，以麸皮，黄豆饼粉，玉米浆为氮源 3，(碳氮比 21) 交叉组合，添加 MgSO47H2O 0.05g，KH 2PO4 0.1g，K 2HPO4 0.1g，VB 10.3mg， PH 6.56.7 组成发酵配方，接种摇瓶 28，100rpm 培养 20天，过滤菌体，测定菌体干重，选择最佳碳氮源。1.4.3 发酵培养基碳氮配比试验分别以玉米粉，葡萄糖，为碳源，以黄豆饼粉，玉米浆，蛋白胨酵母膏为氮源，设计不同碳氮比和碳氮源浓度梯度组成发酵配方，接种摇瓶 28，100rpm 培养 20 天，过滤，测定菌体干重，进一步验证最佳碳氮源并确定最佳碳氮配比。1.4.4 接种方法的比较分别将菌种用以下三种方法接种发酵培养基 28，100rpm，摇瓶培养 20天，过滤，测定菌体干重，比较接种方法。方法一：挖块法，在平皿菌落上挖取 1.00.5cm2 菌体接种发酵培养基。方法二：菌悬液法，菌悬液接种是将经平板培养好的菌种加生理盐水打碎后直接接入发酵培养基内培养。方法三：菌丝球接种，先将打碎后的菌悬液接入种子培养基内，培养成大小均匀的菌丝球后，再将菌丝球按不同数量接入发酵培养基内培养。1.4.5 接种量比较取平皿菌体盛入装有无菌水的三角瓶用混匀器打散制成菌悬液，以梯度剂量接种发酵培养基摇瓶培养测定菌体干重，选取最佳接种量。2 结果与分析2.1 固体培养基试验的对比接种固体培养基培养 15 天，记录生长情况如下表 1，依表可知 PDA( 葡萄糖)是适合菌丝生长的固体培养基。表 1 不同固体培养基的比较（26）培养基 斜面菌 平皿菌PDA(葡萄糖) 菌丝生长最快。菌落巨大洁白，菌丝丰茂。菌落直径7.26cmPSA (蔗糖 ) 生长缓慢。菌丝底部发黑，菌丝稀少。菌落直径6.62cm麸皮 萌发较早，菌落形态有异。 菌落大小中等。菌落直径 6.66cm2.2 发酵瓶培养基碳氮源组合试验下表 2 是发酵瓶培养后得到的碳氮源试验结果，其中序号为1，2，3，5，8 的培养基最终的发酵液夹杂玉米粉或黄豆饼粉残渣，很难过滤，因此其干重不是纯菌丝体，而 2 号培养基最终干重虽然是最多的，但由于含有玉米粉和黄豆饼粉残渣，菌丝球明显没有 6 号培养基多，所以没有将 2 号培养基定为最佳。结合菌丝镜检结果（见图 1、图 2） ，选择 6 号组合为最佳碳、氮源组合。从结果看对于碳源，葡萄糖和蔗糖比较，葡萄糖利于桦褐孔菌液体菌丝的生长。对于氮源，玉米浆和黄豆饼粉比麸皮更利于桦褐孔菌液体菌丝的生长，本试验结果与杏鲍菇培养基不同，麸皮利于杏鲍菇菌丝的生长 4，但对桦褐孔菌菌丝液体培养的影响不明显。确定最佳碳源：葡萄糖；最佳氮源：玉米浆。表 2 发酵瓶培养基不同碳氮源的比较（ 28，100rpm, 20 天）序号 碳源 氮源 发酵液终 pH 总干重 g1 玉米粉 麸皮 6.60 1.792 玉米粉 黄豆饼粉 6.45 2.963 玉米粉 玉米浆 7.29 1.55 4 葡萄糖 麸皮 5.94 1.02 5 葡萄糖 黄豆饼粉 5.96 1.26 6 葡萄糖 玉米浆 6.15 2.77 7 蔗糖 麸皮 6.65 0.24 8 蔗糖 黄豆饼粉 6.58 0.75 9 蔗糖 玉米浆 7.06 0.29 图 1（2 号培养基） 图 2（6 号培养基）2.3 发酵瓶培养基碳氮比试验发酵瓶培养基碳氮比试验结果如下表 3，依表可知最佳碳氮源配比：葡萄糖 2.00%，玉米浆 1.00%。表 3 发酵瓶培养基不同碳氮源配比的比较（28，100rpm ，20 天）碳源 氮源 碳源浓度 氮源浓度 碳氮质 量比 发酵液 终 pH干重（g）平均干重（g/100ml）玉米粉 黄豆饼粉 1.00% 0.50% 2:1 6.45 2.53 0.42 玉米粉 黄豆饼粉 2.00% 1.00% 2:1 7.30 2.72 0.45 玉米粉 黄豆饼粉 3.00% 0.10% 30:1 6.41 2.40 0.40 葡萄糖 玉米浆 1.00% 0.50% 2:1 5.94 3.44 0.57 葡萄糖 玉米浆 2.00% 1.00% 2:1 5.72 4.39 0.73 葡萄糖 玉米浆 3.00% 0.10% 30:1 5.09 2.16 0.36 蛋白胨葡萄糖酵母膏1.00% 0.50% 2:1 6.87 1.81 0.30 蛋白胨葡萄糖酵母膏2.00% 1.00% 2:1 6.57 2.16 0.36 蛋白胨葡萄糖酵母膏3.00% 0.10% 30:1 5.72 1.76 0.29 注：蛋白胨酵母膏为 322.4 接种方法的比较2.4.1 挖块法与菌悬液法比较对挖块法和菌悬液法对比结果如下表 4 所示，依表可以看出可以看出两种接种方法均能产生少量菌丝球，挖块法接种产生的菌丝球数量相对较少，但球体较大（见图 3） ；而用菌悬液接种产生的菌丝球数量较多，且大小相对均匀（见图 4） 。就菌丝球的数量和大小看，菌悬液接种更适合菌丝生长。表 4 接种方法的比较（28，100rpm，20 天）接种方法 接种量 发酵液终 pH 总干重 （g） 平均干重（g/100mL）挖块法 1.00.5cm2 平皿菌落/ 100mL 6.12 2.00 0.22菌悬液 1 mL/100mL 6.22 0.45 0.09图 3（挖块法） 图 4（悬液法）2.4.2 菌悬液接种与菌丝球接种的比较将经平板培养好的菌种加生理盐水打碎后制成菌悬液接入发酵培养基内培养，待培养成大小均匀的菌丝球后，将菌丝球按不同数量接入发酵培养基内培养（菌丝球法） ，同时以菌悬液接种培养进行比较，由实验发现接种菌丝球多少对最终菌丝量影响较小（见表 5） ，但是接入的菌丝球会在发酵培养基内形成较大的菌丝团，容易造成菌团中心缺氧 5。用菌悬液直接接入发酵培养基形成的菌丝球小而均匀，且得到的菌体较多，因此，菌悬液接种更适合发酵瓶中菌丝生长。表 5 菌丝球接种方法的比较（28，100rpm，20 天）接种方法 接种量 发酵终 pH 瓶数(个) 总干重 （g） 平均干重（g/100ml）菌悬液 2 mL/100ml 6.09 4 2.43 0.607菌丝球 5 个菌丝球/100ml 6.45 4 2.18 0.547菌丝球 10 个菌丝球/100ml 6.35 4 2.22 0.555菌丝球 15 个菌丝球/100ml 6.43 4 2.37 0.5922.5 接种量的比较 用菌悬液法从 0.54.0ml 进行了梯度接种量试验，结果如下表 6 所示，依表可得出最佳接种量：一半平皿菌丝加 60mL 生理盐水制菌悬液，接种2.0mL/100mL 培养基（见图 5、图 6） 。表 6 接种量对菌丝干重的影响（ 28，100rpm ，20 天）接种量(ml/100ml)发酵液终pH瓶数（个）总干重(g)平均干重(g/100ml)0.5 6.34 6 2.46 0.411.0 6.45 6 3.55 0.59