第四章-萃取分离法

1、第四章 萃取分离法,第一节 溶剂萃取法,溶剂萃取法(solvent extraction) 广义的萃取包括： 液-固萃取 液-液萃取,液-液萃取：指用一种溶剂将物质从另一种溶剂（如发酵液）中提取出来的方法。,溶剂萃取法优点： 可连续化，速度快，周期短； 对热敏物质破坏少； 多级萃取时，溶质浓缩倍数大、纯化度高。 缺点： 有机溶剂使用量大，对设备和安全要求高，需要各项防火防爆等措施。,溶剂萃取的操作流程,一、基本概念,1.萃取与反萃取 萃取料液与萃取剂接触后，料液中的溶质向萃取剂转移的过程。 料液 溶质 萃取剂 萃取液 萃余液 反萃取萃取液与反萃取剂相接触，使某种被萃入有机相的溶质转入水相的过程

2、，可看作是萃取的逆过程。 再生有机相 反萃液,能斯特分配定律：在一定温度、压力下，某一溶质在互不相溶的两种溶剂间分配时，达到平衡后，在两相中的活度（或浓度）之比为一常数。即：,2.分配定律,K 称为分配系数,应用分配定律时，须符合下列条件： 稀溶液； 溶质对溶剂的互溶度没有影响； 溶质在两相中是同一分子形式。,分配比(distribution ratio)：以各种化学形式进行分配的不同溶质总浓度的比值。,3、萃取因素,萃取因素（萃取比）：被萃取溶质进入萃取相的总量与该溶质在萃余相中总量之比。通常以E表示。,V l V 2：萃取相和萃余相的体积； M 1 M 2：溶质在萃取相和萃余相中的平衡浓度

3、。,4、萃取率（percentage extraction）,5、分离因素(separation factor),分离因素 ：在同一萃取体系内两种溶质在同样条件下分配系数的比值。,二、溶剂萃取法的基本原理,溶剂萃取的目的：设法使一种溶于液相的物质转移至另一液相。 影响弱电解质分配系数的因素： 热力学常数 表观分配系数,可以适度改变pH，将抗生素自水相转入有机相，或从有机相再转入水相，这样反复萃取，进行浓缩和提纯。,三、萃取方法和理论收率的计算,1、单级萃取,萃取因素E为 VF料液体积；Vs萃取剂的体积；C1溶质在萃取液的浓度；C2溶质在萃余相的浓度；K表观分配系数； m浓缩倍数,萃余率： 理论

4、收率：,例：洁霉素在20和pH10.0时表观分配系数（正丁醇/水） K=18。用等量的正丁醇萃取料液中的洁霉素，计算可得理论收率 若改用1/3体积正丁醇萃取， 理论收率：,2、多级错流萃取,萃余率： 理论收率：,红霉素在pH 9.8时的分配系数（醋酸丁酯/水） 为44.5，若用1/2体积的醋酸丁酯进行单级萃 取，则：理论收率 若用1/2体积的醋酸丁酯进行二级错流萃取，则 理论收率,3、多级逆流萃取,n级萃取后，萃余率为： 理论收率为,青霉素在0和pH2.5时的分配系数（醋酸丁酯/水）为35，若用1/4体积的醋酸丁酯进行二级逆流萃取， 则： n2，理论收率,若改为二级错流萃取，第一级用1/8体积

5、的醋酸丁酯，第二级用1/8体积的醋酸丁酯，总溶剂量也为1/4体积，则 ：,一、乳化和破乳化 二、pH的影响 三、温度和萃取时间的影响 四、盐析作用的影响 五、溶剂种类、用量及萃取方式,第二节 影响溶剂萃取的因素,1）乳状液的形成和稳定条件 乳浊液是一种液体分散在另一种互不相溶的液体中所构成的分散体系。,分散相（内相） 分散介质（外相） 不连续相 连续相 W/O型乳浊液 O/W乳浊液,检测：稀释法、染料法、电导法,一、乳化和破乳化,2）影响乳状液类型的因素,1、相体积的影响 水体积: V74%(O/W) V26%(W/O) 2、乳化剂分子空间构型的影响,截面积小的一头指向分散相，截面积大的一头指

6、向分散介质,3、界面张力的影响 高界面张力这侧（凹面）的液体易形成内相。 4、容器壁性质的影响 亲水性强的容器易得OW型乳状液，亲油性强的容器易形成WO型乳状液,3）乳状液的破坏,1、加入表面活性剂 （改变界面表面张力） 2、离心（碰撞聚集） 3、加电解质（NaCl、(NH4)2SO4） 4、加热 5、吸附法破乳（CaCO3、 Na2CO3吸附水) 6、高压电破乳（高压静电场） 7、稀释法 8、其他（超滤、反应萃取）,4）常用的去乳化剂,1、阳离子表面活性剂 （1）十二烷基三甲基溴化铵（1231） CH3(CH2)10CH2(CH3)3N+Br 带正电，中和蛋白负电荷，破坏W/O （2）溴代十

7、五烷吡啶（PPB） 破坏W/O,表面活性高、氢链短或具分支结构,2、阴离子表面活性剂 如亚油酸钠、石油磺酸钠、 十二烷基磺酸钠（亲水，破坏W/O) 3、其他破乳剂 溴代四烷基吡啶、硫酸铝 （p141）,二、pH的影响,1、影响弱酸或弱碱性药物的分配系数（收率） 2、影响药物的稳定性 游离状态（转入有机相）成盐状态（转入水相） 醋酸丁酯提取苄基青霉素 pH4.4 青霉素从醋酸丁酯相转移到水相（反萃取）,三、温度和萃取时间的影响高温下物质不稳定高温时溶剂间互溶度增大，萃取效果下降,四、盐析作用的影响 由于盐析剂与水分子结合，降低了药物在水中的溶解度，使其易转入有机相； 盐析剂降低有机溶剂在水中的溶

8、解度； 盐析剂增大萃余相密度，有助于分相。 用量过多，杂质也多,五、溶剂种类、用量及萃取方式,分配系数愈大愈好， 未知则依据“相似相溶”原则 分离因素大于1 料液与萃取溶剂的互溶度愈小愈好 毒性低 化学稳定性，腐蚀性，沸点，挥发性，价格，来源，回收。,低毒性：乙醇、丙醇、丁醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯 中等毒性：甲苯、甲醇、环己烷 强毒性：苯、三氯甲烷、二氧六环、四氯化碳等 工业常用溶剂：乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸戊醋和丁醇等。,正丁醇萃取洁霉素（溶剂用量与萃取方式）：,第三节 萃取过程和溶剂回收,一、混合 1、搅拌罐 2、管式混合器,滞流、湍流,3、喷嘴式混和器,4、气流搅拌混和罐,二、液-液两相分

9、离,离心机： 1.碟片式离心机 2.管式离心机,三、离心萃取机,-Laval ABE-216离心萃取机,倾析式离心机：可同时分离重液、轻液、固相,四、溶液回收,恒沸混合物：当某两种或三种液体以一定比例混合，可组成具有固定沸点的混合物，将这种混合物加热至沸腾时，在气液平衡体系中，气相组成和液相组成一样，故不能使用分馏法将其分离出来，只能得到按一定比例组成的混合物。,1、单组分溶剂 简单蒸馏（除去不挥发性杂质） 2、低浓度溶剂 精馏 3、与水部分互溶并形成恒沸混和物的溶剂 先简单蒸馏，再精馏 4、完全互溶的混和溶剂并不形成恒沸混和物 精馏或简单蒸馏后GC测定比例再次使用,第四节 双水相萃取,有机溶

10、剂萃取的不足： 1）蛋白质一般亲水性强，不溶于有机溶剂 ； 2）蛋白质在有机溶剂相中易变性失活。,溶液的分相不一定完全依赖于有机溶剂，在一定条件下，水相也可以形成两相(即双水相系统)甚至多相。,双水相萃取技术(two-aqueous phase extraction，ATPE)，又称水溶液两相分配技术：指不同的高分子溶液相互混合可产生两相或多相系统，利用物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异来进行萃取的方法，称为双水相萃取法。,发展历史,ATPE 技术始于 20 世纪 60 年代，1956 年瑞典伦德大学的 Albertsson 发现双水相体系。 1979年德国国家生物技术中心（GBF）的 K

11、ula 等人将双水相萃取分离技术应用于生物产品分离。 国内自 20 世纪 80 年代起也开展了 ATPE 技术研究。,一、双水相的形成,双水相形成原理： 由于高聚物之间的不相溶性，即高聚物分子的空间阻碍作用，相互无法渗透，不能形成均一相。,聚合物的不相溶性(incompatibility)：,当两种高分子聚合物之间存在相互排斥作用时，由于相对分子质量较大，分子间的相互排斥作用与混合过程的熵增加相比占主导地位，一种聚合物分子的周围将聚集同种分子而排斥异种分子，当达到平衡时，即形成分别富含不同聚合物的两相。这种含有聚合物分子的溶液发生分相的现象称为聚合物的不相容性。,常用的双水相系统,双水相萃取过

12、程,ATBE的特点：,1、条件温和，保留产物的活性； 2、分相时间短 3、容易放大，操作可连续化； 4、纯化倍数高，收率高 5、成本低 6、无有机溶剂残留问题,二、双水相萃取的基本概念,1）相图 两相区、均相区、双节线、系线、临界点,均相区,2）分配系数,分配系数K与溶质的浓度和相体积比无关： （主要取决于相系统性质、被萃取物表面性质、温度等）,影响分配系数的因素： 粒子大小、疏水性、表面电荷、粒子或大分子的构象等。,双水相萃取有较好的选择性,三、影响双水相萃取的因素,1）成相高聚物的分子量 当聚合物的分子量降低时，蛋白质易分配于富含该聚合物的相。,主要由被分配物质的分子量决定，对大分子物质影

13、响较大,2）成相聚合物浓度界面张力 成相高聚物浓度增加，两相界面张力也相应增加。,3）电化学分配盐类的影响 盐对带电大分子的分配影响很大。相间电位造成的静电力能影响蛋白质等带电大分子和带电细胞粒子在两相中的分配。,盐离子在两相中有不同的分配，因而在两相间形成电位差。由于各相要保持电中性，因此对于带电荷的蛋白质等物质的萃取来说，盐的存在就会使系统的电荷状态改变，从而对分配产生显著影响。 盐的种类对双水相萃取也有一定的影响。因此变换盐的种类和添加其他种类的盐有助于提高选择性。 在不同的双水相体系中盐的作用也不相同。在 PEG/磷酸盐 /水中加入氯化钠可以使万古霉素的分配系数由 4提高到 120 ,

14、而在 PEG/DeX/水体系中只从 1.55提高到 5。,4）疏水效应 成相高聚物的末端偶联上疏水性基团后，疏水效应会更加明显。,5）温度 间接影响相的高聚物组成，临界点附近时对分配系数才具有较明显的作用。,5）温度的影响,6）pH a）pH会影响蛋白质中可以离解基团的离解度，因而改变蛋白质所带电荷和分配系数。 b）影响磷酸盐的离解程度，,7）其他 Dextran、FiColl、淀粉、纤维素等高聚物具有光学活性,它们应该可以辨别分子的D、L型。 一种蛋白质对D或L型能选择性地结合而富集于一相中，可将此用于手性分配。,可应用于蛋白质、酶、核酸、人生长激素、干扰素的分离纯化。 操作简便、经济省时、

15、易于放大。 传统离心、沉淀等液-固分离转化为液-液分离。,四、 双水相萃取的应用,1） 双水相萃取法常用于胞内酶提取和精制。,双水相系统可用于细胞碎片以及酶的进一步精制。,在两水相系统中进行转化翻译功能，如酶促反应，可以把产物移入另一相中，消除产物抑制，因而提高了产率。这实际上是一种反应和分离耦合的过程，有时也称为萃取生物转化；如果发生的是一种发酵过程，则也称为萃取发酵，因而此时也可以把双水相系统称为双水相反应器。,2. 双水相反应器,enzyme,enzyme,enzyme,enzyme,enzyme,Enzymetic reaction,substrate,product,enzyme,e

16、nzyme,enzyme,Enzymetic reaction with ATBE,substrate,product,五、双水相萃取技术的发展,1）廉价双水相体系的开发 变性淀粉代替Dextran 2）双水相亲和分配 在高聚物上连接亲和配基 3）液体离子交换剂 在高聚物上连接离子交换基团,第五节 反胶束萃取纯化,反胶团(Reversed Micelles)是两性表面活性剂在非极性有机溶剂中亲水性基团自发地向内聚集而成的，内含微小水滴的，空间尺度仅为纳米级的集合型胶体。是一种自我组织和排列而成的，并具热力学稳定的有序构造。,反胶束内溶解的水称为微水相或水池,反胶束萃取,反胶团的微小界面和微小水

17、相具有两个特异性功能： (1)具有分子识别并允许选择性透过的半透膜的功能； (2)在疏水性环境中能使亲水性大分子如蛋白质等保持活性。,反胶团萃取的优点,(1)有很高的萃取率和反萃取率并具有选择性； (2)分离、浓缩可同时进行，过程简便； (3)能解决蛋白质(如胞内酶)在非细胞环境中迅速失 活的问题； (4)由于构成反胶团的表面活性剂往往具有细胞破壁功效，因而可直接从完整细胞中提取具有活性的蛋白质和酶； (5)反胶团萃取技术的成本低，溶剂可反复使用等。,构成反胶团的表面活性剂种类： 阴离子表面活性剂 AOT (丁二酸乙基己基酯-磺酸钠 ) 阳离子表面活性剂 季铵盐 非极性表面活性剂 Triton

18、,分离蛋白质使用最多的是阴离子型表面活性剂AOT,三、反胶束萃取过程,四、反胶束萃取的影响因素,1、表面活性剂 2、水相pH值 3、温度 4、盐离子的种类和浓度 5、蛋白质的分子量和浓度 6、亲和反胶束萃取,表面活性剂的类型 选用有利于增强蛋白质与反胶团间的静电作用和增加反胶团大小的表面活性剂。 通过在单一表面活性剂中加入另一种助表面活性剂的方法来改善萃取性能。 表面活性剂的浓度 小于表面活性剂临界值时,增大浓度可可增加反胶团的数量，从而增大对蛋白质的溶解能力。提高蛋白质的萃取率 ,大于临界值时 ,则无明显影响。,1、表面活性剂,pH对萃取的影响主要体现在改变蛋白质的表面电荷上。 在 pH小于蛋白质的等电点(PI)时 ,蛋白质表面带正电荷 ;大于等电点时 ,蛋白质带负电荷。