免疫学概论-第5章-抗原和抗体的制备与应用

1、第五章 抗原和抗体的制备与应用,第一节 天然抗原的制备 第二节 人工抗原的制备 第三节 多克隆抗体的制备 第四节 抗体的纯化和鉴定 第五节 单克隆抗体的制备,第一节 天然抗原的制备,一、颗粒天然抗原的制备 二、可溶性抗原的制备,一、颗粒天然抗原的制备,1.细菌抗原 2.血红细胞抗原和组织细胞粗抗原的制备,1.细菌抗原(多用液体或固体培养物集菌后处理) 1)H抗原(鞭毛抗原，蛋白质） : 用有毒力的菌株，菌液用0.30.5甲醛处理 2)O抗原（菌体抗原，细胞壁多糖抗原）: 需要100加温2 2.5h后应用。 3)Vi抗原（伤寒沙门菌的表面抗原，糖脂）：应在杀菌后再加0.51氯化钙溶液。 有些细胞

2、膜成分，如组织细胞膜、血细胞膜经打碎后亦可制成颗粒抗原。颗粒抗原悬液呈乳浊状，多采用静脉内免疫法，较少使用佐剂作皮内注射。,细菌菌体抗原的制备流程图,液体培养或 斜面培养富集菌体 37 24h,100水浴 22.5h 杀菌,无菌试验,NS稀释成810亿/ml,O菌体抗原,返回,4)菌苗,用细菌体制成的生物制品 a.活菌苗： 制备关键: 获得减毒或无毒菌株，但应保持免疫原性。 优点; 一般只需接种一次，且需量较小，但引起的 免疫效果好，能维持较长时间。 缺点: 活菌苗需维持其活力，菌苗的保存需一定的冷藏条 件，且有效期短。 实例：预防结核病的卡介苗、鼠疫活菌苗等。 b.死菌苗,b.死菌苗,制备关

3、键：用化学或物理方法将病原菌杀死后仍可保持免疫原性 特点: 病原菌已被杀死，不能繁殖，用量较大，接种后可能出现局部肿痛或发热等全身反应; 大多需多次接种。 实例：霍乱、伤寒、副伤寒甲、乙混合菌苗、百日咳菌苗等。,2.血红细胞抗原和组织细胞粗抗原的制备 绵羊红细胞抗原的制备 组织和细胞粗抗原的制备,绵羊红细胞的制备流程图,摇动 15-20min,4,可保存3周,取适量,NS洗涤3次 2000r/min 10min,NS稀释至 25%,抗凝血剂天然抗凝剂（肝素） Ca+2鳌合剂（柠檬酸钠，氟化钾）,有溶血现象应弃去,2）组织和细胞粗抗原的制备 处理好的组织用生理盐水洗去血迹及污染物。 将洗净的组织

4、剪成小块，进行粉碎。 组织匀浆后通过20003000r/min离心10min后分成两个部分 沉淀物含有大量的组织细胞和碎片-组织和细胞粗抗原； 上清液作为提取可溶性抗原的材料，提取前还要通过10002000r/min2030min的高速离心，以除去微小的细胞碎片，此时上清液应澄清,来源: 组织和细胞，其成分比较复杂 1.组织和细胞成分混合抗原制备 2.蛋白质抗原制备 3.核酸抗原制备 4.类脂多糖抗原制备 5.免疫球蛋白片段制备,二、可溶性抗原制备及鉴定,可溶性抗原:蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶类、 补体、脂多糖、细菌外毒素和核酸,二、可溶性抗原制备及鉴定,1.组织和细胞成分混合抗原制备程序,上

5、清液 澄清,所用材料必须是新鲜或低温保存的,去除包膜或结缔组织,脏器进行灌洗,洗去血迹 及污物,NS内含0.5gL NaN2,冷浴中组织剪碎,装入捣碎机简内高速 粉碎制成组织匀浆液,3000rmin10min,取上清液,去除细胞碎片 及微小组织,离心,蛋白质抗原制备,蛋白质是良好的抗原，要制备特异性高 的抗血清通常需要纯化。可采用： 1.超速离心法 2.选择性沉淀法 3.凝胶层析法 4.离子交换层析法 5.亲合层析法,2.蛋白质抗原制备（自学）,原理:利用各颗粒在梯度液中沉降速度不同， 使具有不同沉降速度的颗粒,处于不同密度 的梯度层内，达到彼此分离的目的。,1)超速离心法,特点：用超速离心或

6、梯度密度离心法纯化抗 原，极难将某一抗原成分分离出来。,应用：用于少部分大分子抗原和一些比较轻 的抗原物质的分离，如IgM、C1q、甲状腺球 蛋白、载脂蛋白A、B等。,2、选择性沉淀法,原理：根据各蛋白质理化特性的差异，采用 各种沉淀剂或改变某些条件促使蛋白质抗原 成分沉淀，从而达到纯化的目的。,2)、选择性沉淀法,常用方法：盐析沉淀法（不同盐浓度则溶解 度不同）；常用3350饱和度的硫酸胺。,特点：简单方便，纯度不高，粗提球蛋白。,应用：在大量制备中先用此法粗提，再纯化。,3凝胶层析法（凝胶过滤法）,原理：凝胶具有三维空间多孔网状结构的物质， 经适当溶液平衡后，装入层析柱。当含有各种 分子大

7、小不一的混合物加在凝胶床面时，大分 子物质不能进入凝胶颗粒的网孔结构内，在凝 胶颗粒之间的空隙中很快地通过凝胶床，短时 间内被洗脱出来；而分子较小的物质则进入凝 胶网孔结构内，反复受到阻滞，洗脱较慢。分 成大、中、小三种类型。,3)凝胶层析法（凝胶过滤法）,原理：利用带离子基团的纤维素或凝胶，吸附交换带相反电荷的蛋白质抗原。各种蛋白质的等电点不同，所带电荷不同，与纤维素结合的能力有差别。当梯度洗脱时，逐步增加流动相的离子强度，使加入的离子与蛋白质竞争纤维素上的电荷位 置，从而使血清中的蛋白质分成球蛋白、球蛋白、球蛋白和清蛋白等几个部分而被洗脱下来，达到分离纯化的目的。,4)离子交换层析法,5亲

8、和层析法（亲和色谱）,原理：依据抗原抗体的生物学活性进行分离和提纯的技术。将纯化的抗IgG附着于惰性的固相基质上，制成免疫吸附层析柱。当样品流过此柱时，待分离的IgG可选择性地与免疫吸附剂上的特异性配体(抗IgG)结合；当改变洗脱条件可重新解离，将待分离的Ig洗脱下来，达到纯化的目的。 优点：提取纯度高、抗原抗体不失活性。,5)亲和层析法（亲和色谱）,核酸抗原制备,大分子的核酸具有免疫原性。 提取核酸的主要步骤：,3.核酸抗原制备自学,破碎细胞,核酸从细胞中游离出来,酸沉淀核酸,除去蛋白质,乙醇,酚和氯仿,类脂多糖抗原制备,苯酚法提取LPS：,干燥菌体或湿菌体,水中 混匀,激烈搅匀 加热5mi

9、n,冰水 急冷,降至10以下,离心,上层的水层(含LPS) 下层的酚层 菌体残渣于底部,吸取 水层,透析 除酚,加热,超速离心,浓缩,LPS 在上层沉淀的透明胶状部内,绞出,悬于水中,离心,得纯化LPS,4.类脂多糖抗原制备自学,同温的苯酚,免疫球蛋白片段制备,1酶裂解法 酶对免疫球蛋白的水解有极好 的专一性，不同的酶可将免疫球蛋白裂解 为不同的片段。,5.免疫球蛋白片段制备,2氧化法和还原法 是将免疫球蛋白轻、重 链分开的两种常用方法。,3. 还可用强变性剂或利用改变pH将免疫球蛋 白亚单位分开。,酶水解免疫球蛋白示意图,Fc段，用以制备抗重链血清,F(ab)2，常作为抗体试剂用于试验,木瓜

10、蛋白酶 （papain),胰蛋白酶 (pepsin),胃蛋白酶 (pepsin),1. 氧化法：优点是切开后，肽链不能重新 形成二硫键、便于肽链纯化； 缺点是色氨酸侧链容易被破坏,氧化法和还原法,2. 还原法：将二硫键还原成巯基。但极不 稳定，易重新形成二硫键，必须及时用 碘乙酸或碘化酰胺进行羧甲基化,三、半抗原免疫原的制备,1.半抗原：低分子量的化学物质。例如多糖、 多肽、甾族激素、脂肪胺、类脂质、核苷、 某些药物(包括抗生素）及其他化学物品等。,第二节、人工抗原的制备,2.载体：蛋白质类 多肽聚合物 大分子聚合物,3.半抗原-载体连接方法:,载体类型,1.蛋白质：人血清白蛋白、牛血清白蛋白

11、、兔 血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白等。,载体类型,2.多肽聚合物：人工合成的，常见的有多聚赖 氨酸，其分子量大（可达十几万到几十万)， 这种多聚物和半抗原结合后，可刺激免疫动 物产生高效价、高亲和力的抗体。,3.大聚合物：羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮 等，可与半抗原结合，加入弗氏完全佐剂亦 可诱发动物产生抗体。,通过电荷和微孔吸附手段,半抗原-载体连接方法1,碳化二亚胺法：,R-NH=CH-R,半抗原载体蛋白质,搅拌12h,室温24h,透析除去未反应的半抗原,人工免疫原,半抗原载体连接方法1,混合,带游离的羧基或氨基的半抗原与载体连接,混合,半抗原-载体连接方法2,戊二醛法:,半抗原-NH2,载

12、体蛋白-NH2,半抗原-N=CH-(CH2)3-CH=NH-载体蛋白,OHC-(CH2)3-CHO,*戊二醛是常用的带有两个活性基团的双功能联接剂,半抗原载体连接方法2,与载体和半抗原的氨基相连接,半抗原-载体连接方法3,氯甲酸异丁脂法：,半抗原-COOH,载体蛋白-NH2,Cl-COO-CH2CH(CH3)2,半抗原-COO-COO-CH2CH(CH3)2,半抗原-CO-NH-载体蛋白,半抗原载体连接方法3,简便，用于类固醇抗原制备,HO-CH2CH(CH3)2,半抗原-载体连接方法4,琥珀酸酐法：用于不含羧基衍生物半抗原制备,半抗原-CH2OH,CH2-CO CH2-CO,带羧基的半抗原琥

13、珀酸衍生物,半抗原-CH2-OOC-CH2-CH2-COOH,返回,吡啶,再经氯甲酸异丁脂法或碳化 二亚胺法制备载体半抗原,半抗原载体连接方法4,第三节 多克隆抗体的制备,1.概念 2.多克隆抗体的特点 3.多克隆抗体的制备流程,一、 概念1.克隆：无性繁殖细胞系，由单一个祖先细胞分裂繁殖而形成的一簇细胞纯系。在这个家族的所有成员中，如无突变发生，其基因是完全相同的。2.多克隆抗体:用一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫动物，可刺激机体多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同抗体。所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物，即多克隆抗体。,二 、多克隆抗体的特点,特点: 不均一性 (抗体的异质性

14、), 由外源性和内源 性因素引起的 1) 外源性: 抗原分子结构复杂, 具有多种抗原 决 定簇, 每种决定簇引起一种相应抗体的 产生. 反映了机体对抗原物质的精细结 构的识别能力. 2) 内源性: 免疫球蛋白的血清型(回顾),免疫蛋白为大分子蛋白质，具备抗原的各种性质，对异种、同种异体，甚至宿主自身都是良好的抗原，且是一个抗原复合体，带有多种抗原决定簇。Ig分子的这种异质性反映了抗体形成细胞的遗传性差异，代表抗体分子在不同水平上的遗传变异性；通常可用血清学方法检测出来，并据此将Ig及其肽链（H和L链）分成不同的血清学类型。 同种型 同种异型 独特型,免疫球蛋白的血清型:,三、多克隆抗体的制备流

15、程,1.免疫动物的选择 2.免疫的方法 3.动物采血法 4.免疫血清的分离与保存,一、免疫动物选择,能作免疫接种用的动物主要是哺乳类和禽类。 兔、绵羊、豚鼠、鸡、山羊和马。,一、免疫动物选择,1.抗原与免疫动物种属差异越远越好；,2.动物必须适龄、健壮、无感染的正常动物、 体重合乎要求；,3.不同动物种类对同一免疫原有不同的免疫 应答；,4.按需要量选择大小不同的动物。,二、免疫方法,4.免疫方案 全量免疫法：弗氏佐剂抗原多次注射 微量免疫法：卡介苗7天弗氏佐剂1月 抗原 混合免疫法：综合皮下、淋巴结和静脉,二、免疫方法,1.免疫原的注射剂量,2.免疫途径：免疫反应产生速度依次为静脉 腹腔肌肉

16、皮下皮内淋巴结足掌 3. 免疫时间间隔：首次和第二次之间10-20天为宜，第二次以后 7-10天。免疫次数3-5次。,三、动物采血法,1.颈动脉放血法：最常用的方法-常用于家兔的全采血 2.心脏采血法：要求操作熟练-常用于家兔和豚鼠的采血。 3.静脉采血法：颈静脉采血常用于绵羊；耳静脉采血常用于 家兔；尾静脉采血常用于小白鼠和大白鼠。,1.4保存：可保存36个月 2.低温保存：-20-40，可保存23年 3.冰冻干燥保存：可保存35年,三、动物采血法,四、免疫血清的分离和保存,第四节 抗体的纯化和鉴定,1.抗体特异性的纯化 2.特异性IgG类抗体的纯化 3.特异性抗体的鉴定,一、抗体特异性的纯

17、化,1.亲合层析法：将交叉抗原交联到Sepharose 4B上，装柱后，将预吸收的抗体通过亲合层 析柱，杂抗体吸附在柱上，流出液则是特异 性抗体。,一、抗体特异性的纯化,2.吸附法：利用不含特异性抗原的抗原液，直 接加到免疫血清中，抗原则与抗体结合，上 清液则为无杂抗体的单价特异性抗体。,二、特异性IgG类抗体的纯化,1.盐吸沉淀法：经硫酸铵盐吸提取球蛋白 3次，基本为IgG类抗体，但不纯。,二、特异性IgG类抗体的纯化,2.A蛋白亲和层析：SPA与IgG的Fc段有很强的 特异性的亲和力，细菌表面不同位点独立地 与抗体结合，一个A蛋白至少可以结合二个 IgG分子。适合纯化细胞培养上清中的McA

18、b。,3.其它：凝胶过滤、离子交换层析等,5.单抗的优缺点,第五节 单克隆抗体的制备,1975年分子生物学家G.J.F.keler和C. Milstein在细胞杂交技术的基础上，创建立杂交瘤技术，把体外培养和大量增殖的小鼠骨髓瘤细胞与经抗原免疫后的小鼠脾细胞融合，成为杂交细胞系，既具有瘤细胞易于在体外无限增殖的特性，又具有抗体形成细胞的合成和分泌特异性抗体的特点。将这种杂交瘤作单个细胞培养，可形成单细胞系，即单克隆。利用培养或小鼠腹腔接种的方法，便能得到大量的、高滴度的、非常均一的抗体,单克隆抗体:由一个识别一种抗原表位的B细胞克隆产生的同源抗体。高度均一、特异性强、效价高,少或无交叉反应性。

19、,Niels K. Jerne,G. Kohler,C. Milstein,单克隆抗体,高度均质性的特异性抗体，由一个识别单一抗原表位的B细胞克隆所分泌。一般来自杂交瘤细胞,杂交瘤技术的基本原理,单克隆抗体制备步骤,1.致敏淋巴细胞的准备 2.骨髓瘤细胞的准备 3.饲养层细胞的准备 4.细胞融合 5.选择性培养 6.特异性抗体的检测 7.杂交瘤细胞的克隆化 8杂交瘤的冻存和复苏 9单克隆抗体的大量制取 10单克隆抗体的纯化,步骤1 致敏淋巴细胞的准备,完全抗原：病毒、细菌、真菌等微生物和蛋白质等分子量大于5000Da生物物质 半抗原：多糖、药物、激素、肽类等分子量小于5000 Da 物质 半抗

20、原需与BSA、OA等载体交联后成完全抗原才能刺激动物产生可应用的高效价的抗体,步骤1 致敏淋巴细胞的准备,动物选择：品系、年龄、性别、健康状态 抗原免疫：方式体内、体外 剂量0.5-100g 次数视抗原而定 间隔视抗原而定 佐剂视抗原而定 收集时间：末次加强免疫（iV或iP）后72-96h,BALB/C小鼠,选择体重1820g BALB/C 雌性小鼠，用制备抗原免疫。,步骤2 骨髓瘤细胞的准备,常用骨髓瘤细胞系：SP20、NS1、P3.653 融合时骨髓瘤细胞的选择： a.处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95 b.细胞株保持HGPRT 缺陷状态（次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移）,步骤3

21、 饲养层细胞的准备,常用饲养细胞：小鼠腹腔巨噬细胞，小鼠脾细胞，小鼠或大鼠胸腺细胞等。 饲养细胞主要作用：可能在培养液中释放某种生长刺激因子；满足新生细胞对细胞密度的依赖性；减少聚苯乙烯培养板孔对新生细胞的毒性等,步骤4 细胞融合,步骤5 选择性培养,HAT选择培养原理 随机融合后的细胞类型,选择性培养原理：,核苷酸主要合成途径,核苷酸补救合成途径,氨基碟呤 （A）,次黄嘌呤（H）,胸腺嘧啶核苷（T）,核苷酸,DNA,步骤6 特异性抗体的检测,对检测方法的要求： 灵敏度高 特异性强 简便快速 常用检测方法：ELISA,阳性孔的检测,步骤7. 杂交瘤细胞的克隆化,目的：建立单一细胞克隆 方法：有限稀释法，显微操作法，软琼脂培养法 克隆建立的标准：连续两次以上100%阳性孔,有限稀释法,计数,0.5-2/孔,步骤8杂交瘤细胞的冻存与复苏,冻存：慢冻，分步冻存， 室温-20-70液氮 复苏：