酶动力学课件1财富值.ppt

1、酶促反应动力学(Enzyme Kinetics),反应进行的方向 反应进行的可能性 反应进行的限度 反应进行的速率 反应机制,化学热力学,化学动力学,研究酶促反应的速率以及影响反应速率的各种因素的科学.,影响反应速率因素包括: 酶浓度、底物浓度、pH、温度、 抑制剂、激活剂等。 研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定。,（一）. 酶促反应动力学基础,酶促反应速度一般在规定的反应条件下，用单位时间内底物的消耗量和产物的生成量来表示 反应速度取其初速度，即底物的消耗量很小（一般在5以内）时的反应速度 底物浓度远远大于酶浓度,单位时间底物浓度减少或产物浓度增加量,1. 反应速率及其测定,2.反应分子

2、数和反应级数,反应分子数 (1)单分子反应 A B (2)双分子反应 A+B C+D,V= -dc/dt=kc,V= -dc/dt=kc1c2,速率与反应物浓度的一次方成正比。 二级反应 速率与反应物浓度的2次方（或两种物质的浓度的乘积）成正比。,一级反应,反应级数,零级反应 反应速率与反应物的浓度无关，为常数,速率常数与半衰期成反比，与反应物初浓度无关,对时间作图，为直线，斜率为K,半衰期与初浓度成反比,平衡常数,平衡：可逆反应的正向反应和逆向反应仍在继续进行，但反应速率相等的动态过程。 反应的平衡常数与酶的活性无关，与反应速率的大小无关，而与反应体系的温度、反应物及产物浓度有关。,（二）底

3、物浓度对酶反应速度的影响,1 中间络合物学说,Henri和Wurtz提出,中间产物的证据,中间复合物的直接观察 光谱改变 酶的物理性质改变 分离结晶 酶和底物的共沉降,当底物浓度较低时,反应速度与底物浓度成正比；反应为一级反应。,随着底物浓度的增高,反应速度不再成正比例加速；反应为混合级反应。,当底物浓度高达一定程度,反应速度不再增加，达最大速度；反应为零级反应,酶反应的速度在不停地变，实验上只有初速度的测定才有意义。,2. 单底物酶促反应动力学,（1）.米氏方程的提出 1913年Michaelis和Menten推导了米氏方程,S：底物浓度 V：不同S时的反应速度 Vmax：最大反应速度(ma

4、ximum velocity) m：米氏常数(Michaelis constant),（2）.米氏方程的推导,根据酶反应的中间复合物学说（快速平衡）,()S与E形成中间产物，且整个反应速度取决于 ES P+E () SE,两点假设,根据酶反应的中间复合物学说（快速平衡）,ES的生成速度K1（E - ES）S ES的分解速度K2ES K1（E - ES）S ,酶反应速度V与ES成正比 Vmax K3ES K3E,Briggs认为并不总是K3K2, ESE+P这一步也可能速度很快，这时，E，S和ES将不能处于一个平衡状态。布氏提出稳态理论。,Briggs和Haldane提出稳态平衡理论,酶催化的反

5、应中各成份的变化,稳态理论的假设,游离酶浓度=E-ES ES生成速度=k1（E-ES）S ES分解速度=k2ES+ k3ES 当稳态时： ES生成速度=ES分解速度 k1（E-ES）S= k2ES+ k3ES,稳态米氏方程的推导,快速平衡假说与稳态平衡假说的实质区别,a当SKm时， v=(Vmax/Km) S, 即v 与S成正比 b当SKm时， v Vmax， 即S而v不变 c当SKm时， v=1/2Vmax,(3)米氏方程的讨论,. v- S曲线：近似双曲线 当SKm（ S很小时） 即v 与S成正比 当SKm（ S很大时） v Vmax，酶被底物饱和，v与S无关 当v=1/2Vmax时， S

6、Km（mol/L),A. Km值是酶的特征性常数。与酶的浓度无关，不同的酶，其Km值不同,Km 酶促反应速度为最大反应速度（Vmax)的一 半时的底物浓度。 单位是mol/l。,动力学参数的意义,B.物理意义:酶促反应速度为最大反应速度（Vmax)的一 半时的底物浓度。,D. Km可判断酶的专一性和天然底物。如酶能催化几种不同的底物，对每种底物都 有一个特定的Km值，其中Km值最小的称该酶的最适底物。,C. Km除了与底物类别有关，还与pH、温度有关， 不同的条件下有不同的Km值。,E. Km值近似等于ES的解离常数Ks，可表示酶与底物之间的亲和力： Km越大，亲和力越小，酶的催化活性低； K

7、m越小，亲和力越大，酶的催化活性高,F.根据正逆反应Km的差别及细胞内正逆两相底物的浓度推测酶促反应的正逆方向。 G.根据代谢途径中各个酶的Km及其相应底物浓度判断限速步骤。 H.根据Km值的大小判断分支代谢的流向。,Km可以推断某一代谢物在体内可能的代谢途径:,丙酮酸,乳酸,乙酰CoA,乙醛,乳酸脱氢酶（1.710-5）,丙酮酸脱氢酶（1.310-3）,丙酮酸脱羧酶（1.010-3）,当丙酮酸浓度较低时，代谢走哪条途径决定于 Km最小的酶。,Vmax不是一个常数，它取决于酶的浓度，它是一个酶反应体系的速度的极限值。 Vmax=K3 E K3代表酶被底物饱和时每秒钟每个酶分子转换底物的分子数，

8、称为转换数或催化常数， （ catalytic constant,Kcat）。Kcat值越大，表示酶的催化效率越高。,Vmax和k3(kcat),Kcat/Km,表示酶的实际催化效率,Kcat/Km是E和S反应形成产物的表观二级速率常数，也称为专一性常数。,只有Kcat/Km可以客观地比较不同的酶或同一种酶催化不同底物的催化效率,(4) 作图法测定Km和Vmax,Lineweaver-Burk 双倒数作图法 Hanes-Woolf作图法 Woolf-Augustinson-Hofstee作图法 EisenthalCornish-Bowden作图法,测定Km和V的方法很多，最常用的是 Linew

9、eaverBurk的作图法 双倒数作图法。,Lineweaver-Burk 双倒数作图法,实例,Neurospora crassa 的D-丝氨酸脱水酶催化反应： CH2OH CHNH2 COOH CH3CO COOH+NH3 在实验中测定酶的饱和曲线得到下列数据： s v 10 -5（M） 20分钟生成丙酮酸（M） 0.20 0.150 0.40 0.200 0.85 0.275 1.25 0.315 1.70 0.340 2.00 0.350 8.00 0.360,用这些数据求丝氨酸脱水酶的表观米氏常数。,v Vm 0.3 0.2 Vm 2 0.1,0 1 2 3 4 5 6 7 8 10-

10、6 S,丙酮酸M/20min,Vmax=0.36 1/2Vmax=0.18 Km=3.210-7,解：1、v对S作图法:,S 1/S v 1/v 0.20 5.0 0.150 6.66 0.40 2.5 0.200 5.00 0.85 1.17 0.275 3.64 1.25 0.80 0.315 3.17 1.70 0.58 0.340 2.94 2.00 0.50 0.350 2.86 8.00 0.125 0.360 2.78,解2、1/v 对1/S作图法：,7 6 5 4 3 2 1,-4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5,1/v,1/S,-1/Km=-2.8510 5 Km=

11、3.51 10-6,1/Vm=2.55 ; Vm=0.39,(三）. pH对酶促反应速度的影响,最适pH：酶具有最大催化活性时的环境pH。 典型的酶速度-pH曲线是较窄的钟罩型曲线。,最适pH与底物种类、浓度及缓冲液成分有关。,（四）.温度对酶促反应速度的影响,提高温度，加快反应速度。 温度系数Q10：温度升高10，反应速度与原来的反应速度之比，大多数酶的Q10一般为2。 提高温度，酶变性失活。 在一定范围内，反应速度达到最大时对应的温度称为该酶促反应的最适温度(optimum temperature).,最适温不是酶的特征性常数。,（五）.酶浓度对酶促反应速度的影响,当S E ，反应速度对酶

12、浓度呈正比。 关系式为：V=K3 E 机理：酶浓度增加，ES也增加，反应速度增加。,（六）.激活剂对酶促反应速度的影响,激活剂（activator):凡是能提高酶活性的物质 无机离子的激活作用 金属离子：K+ 、Mg2+ 、Zn2+ 阴离子：Cl-、Br 有机小分子化合物的激活作用 蛋白酶对酶原的激活,（七）.抑制剂对酶活性的影响,六、酶促反应动力学(Enzyme Kinetics),（1）. 抑制程度的表示方法,(2）抑制反应类型 巯基酶抑制剂 *专一性抑制 丝氨酸酶抑制剂 不可逆抑制 非专一性抑制 抑制作用 * 竞争性抑制作用 可逆性抑制 非竞争性抑制作用 反竞争性抑制作用,1.不可逆抑制

13、作用（irreversible inhibition),I 以共价键与E活性中心上的必需基团 结合，从而抑制酶活性。这种I不能用透析、超滤等物理方法除去抑制剂而恢复酶活性. 常见抑制剂丝氨酸酶抑制剂巯基酶抑制剂,如有机磷毒剂二异丙基氟磷酸酯。,这类抑制剂I与酶蛋白以非共价键结合，引起酶活力降低或丧失。可用透析，超滤等物理方法除去抑制剂I而恢复酶活性。 类型： 竞争性抑制(competitive inhibition) 非竞争性抑制(noncompetitive inhibition) 反竞争性抑制( uncompetitive inhibition),2.可逆抑制作用(reversible i

14、nhibition),.竞争性抑制,抑制剂具有与底物类似的结构，竞争酶的活性中心，并与酶形成可逆的EI复合物，阻止底物与酶结合。,1. i与S结构相似； 2. i与S互相竞争与酶活性中心结合； 3. 抑制程度取决于i 和S的相对比例； 4. S，可以减少或去除抑制作用。 （Km， Vmax不变） 5. 排斥性抑制,竞争性抑制的特点,.非竞争性抑制,抑制剂与酶活性中的以外的基团结合，但形成中间的三元复合物ESI不能进一步分解为产物，因此，酶的活性降低。,非竞争性抑制作用特点,1. i与S结构不相似； 2. i与S互不干扰同时与 酶 结合； 3. 抑制程度只取决于i的浓度； 4. S，不能去除抑制

15、作用。 （Km不变， Vmax） 5. 是一种旁若无人式的抑制,.反竞争性抑制,酶只有在与底物结合后， 才能与抑制剂结合。E+SES+I ESI P 常见于多底物的酶促反应中,(3)酶抑制作用的动力学,可逆抑制作用和不可逆抑制作用的鉴别 透析、超滤、凝胶过滤能否除去抑制剂 动力学方法： 酶浓度对反应速度作图，不可逆抑制剂 使直线右移，可逆抑制剂使直线的斜率下降。,Ki为抑制剂常数,即EI的解离平衡常数。为的解离平衡常数,：游离酶的浓度：酶的总浓度,1.竞争性抑制米氏方程的推导,与标准方程的比较,当 I 0时，方程还原成米氏方程。, I 时，,双倒数作图,Eo=E + ES+ EI + EIS,

16、当I0,I,与米氏方程比较,双倒数作图,抑制程度:,抑制程度决定于I ，与底物S无关,与米氏方程比较,双倒数作图,不同类型抑制作用的米氏方程,非竞争性抑制,反竞争性抑制,竞争性抑制,（4）抑制剂,1. 不可逆抑制剂,有机磷化合物 有机汞和有机砷化合物 重金属盐 烷化试剂 氰化物、硫化物和CO 青霉素,非专一性的不可逆抑制剂,与酶活性中心及活性中心外某一类或几类必需基团反应,巯基酶抑制剂,抑制剂：重金属离子：Ag+、Hg2+、As3+等,丝氨酸酶抑制剂,抑制剂：有机磷化合物,丝氨酸酶,2. 可逆抑制剂,可逆抑制剂中最重要和最常见的是竞争性抑制剂 一些竞争性抑制剂与天然代谢物在结构上十分相似，能选择性的抑制病菌或癌细胞在代谢过程中的某些酶，而具有抗菌和抗癌作用。,竞争性抑制剂有：丙二酸、草酰乙酸等,琥珀酸脱氢酶,磺胺类药物的竞争性抑制作用,磺胺药