实验4叶绿素的提取、理化性质和含量测定.ppt

1、实验中的注意事项： 1、实验的取材 2、操作及观察 3、实验数据的处理 4、实验结果的分析：分清错误和误差 5、思考题 6、实验报告,实验四 叶绿素的提取、理化性质和含量测定 （p130136）,一、叶绿素的提取 二、叶绿素的理化性质 三、叶绿素含量的测定,1. 实验目的,1）掌握叶绿素的提取及其含量测定的方法 2）了解叶绿素的理化性质,2. 实验原理,2.1 用含水的有机溶剂提取叶绿素 2.2 叶绿素的物理性质 吸收光谱 荧光现象 2.3 叶绿素的化学性质 取代反应 皂化反应,2.1 用含水的有机溶剂提取叶绿素,亲水的卟啉环的“头部”: 镁原子居于卟啉环的中央，带正电性，与其相联的氮原子则偏

2、向于带负电性，因而卟啉具有极性，是亲水的，可以与蛋白质结合。 亲脂的叶绿醇的“尾巴”: 叶醇是由四个异戊二烯单位组成的双萜，是一个亲脂的脂肪链，它决定了叶绿素的脂溶性。,2.2 叶绿素的物理性质,2.2.1 吸收光谱 2.2.2 荧光现象 2.2.3 含量测定,2.2.1 叶绿素的吸收光谱,2.2.2 荧光现象,透射光下,反射光下,叶绿体吸收光后，激发了捕光色素蛋白复合体（LHC），LHC将其能量传递到PSII或PSI。其间所吸收的光能有所损失，大约3%-9%的所吸收的光能被重新发射出来，其波长较长,也即叶绿素荧光 。,叶绿素溶液在透射光下呈绿色，在反射光下呈红色的现象。,分子吸收的光能有一部

3、分消耗于分子内部的振动上，发射的荧光的波长总是比被吸收光的波长要长,叶绿素吸收红光后处于第一单线态，叶绿素分子要从第一单线态返回基态所发射的光称为荧光。,2.2.3 含量测定,叶绿素a、b在红光区的最大吸收峰分别位于663 nm 和645 nm； 叶绿素a、b在652 nm处有相同的比吸收系数（34.5），测OD652求出叶绿素a、b总量。 故叶绿素浓度 COD652 / 34.5 ( mg/ml ) 叶绿素的含量（mg/g）= 叶绿素的浓度提取液体积稀释倍数/样品鲜重,2.3 叶绿素的化学性质,2.3.1 叶绿素的结构 2.3.2 取代反应 2.3.3 皂化反应,2.3.1 叶绿素的结构,叶

4、绿素a与b很相似，不同之处仅在于Chla第二个吡咯环上的一个甲基(-CH3)被醛基(-CHO)所取代即Chlb。,2.3.2 取代反应,2.3.2.1 稀酸 去镁 铜代 2.3.2.2 浓酸 去镁 水解,卟啉环中的Mg处于不稳定的状态，可被H+、Cu2+ 、Zn2+等离子取代。,2.3.2.1 稀酸 叶绿素溶液与稀酸(如:草酸)作用，H+取代Mg后的产物为褐色的去镁叶绿素； 去镁叶绿素与Cu2+ 或Zn2+作用， Cu2+ 等离子取代后的产物为深绿色的铜代叶绿素等； 2.3.2.2 浓酸 叶绿素溶液与浓酸(如:盐酸)作用，除了代换Mg外，可使去镁叶绿素迅速分解出叶绿醇，并形成褐绿色的去镁叶绿酸

5、。,叶绿素去镁叶绿素铜代叶绿素（稳定而不易降解，常用醋酸铜处理来保存绿色植物标本）,2.3.3 皂化反应,叶绿酸是二羧酸，其中一个羧基被甲醇酯化，另一个被叶绿醇酯化。叶绿素是叶绿酸的酯，能发生皂化反应。 叶绿素与碱皂化形成的叶绿素盐能溶于水，极性增大。,皂化分层,叶绿素的盐形成以后，因分子极性增大，易溶于稀酒精溶液中，不能进入苯层； 而类胡萝卜素在苯中的溶解度大于在醇溶液中 一部分苯分散在水中形成乳胶体，出现一层乳白色的溶液 低温下发生皂化反应的叶绿体色素溶液，易乳化而出现白色絮状物，溶液浑浊，且不分层。,3 材料、试剂与配备,1 材料 菠菜叶片 2 仪器设备 研钵，漏斗，剪刀，试管，试管夹，

6、容量瓶(25ml,50ml)，分光光度计，水浴锅等 3 试剂 95%乙醇，苯，浓盐酸，36%乙酸， CuSO4， MgCO3，石英砂,4 实验步骤,4.1 叶绿素的提取 4.2 叶绿素的物理性质 透射光颜色 反射光颜色 4.3 叶绿素含量的测定 4.4 叶绿素的化学性质 取代反应 皂化反应,4.1 叶绿素的提取,1. 新鲜菠菜叶片，去掉中脉后的样品称重( 约2-3g,记录样品重量)； 2. 剪碎入研钵中，加少量石英砂和碳酸镁粉及2-3 ml的95%乙醇，研磨匀浆，再加乙醇混匀； 3. 过滤到25 ml容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣，最后连同残渣一起过滤（ 直至滤纸和残渣中无绿色为止）

7、最后用乙醇定容至25ml(后称原液)，摇匀。,4.2 叶绿素的荧光,取3 ml叶绿素提取原液，观察其透射光、反射光下的颜色；,4.3 叶绿素含量的测定,取5 ml叶绿素提取原液移入至50 ml容量瓶， 95%乙醇定容(稀释液) 以95%乙醇作为空白对照，测OD652 叶绿素浓度: COD652 / 34.5 ( mg/ml ) 叶绿素的含量（mg/g）= 叶绿素的浓度提取液体积稀释倍数/样品鲜重,4.4 叶绿素的化学性质,4.4.1 取代反应 4.4.1.1 稀酸： 取3 ml叶绿素原液，一滴滴加入醋酸(先快后慢)，观察并记录颜色变化； 向上述加醋酸后发生颜色变化的溶液中加少量CuAc颗粒，6

8、5水浴加热，观察并记录其颜色变化。 4.4.1.2 浓酸 取3 ml叶绿素溶液，一滴滴缓慢加入浓盐酸，观察并记录颜色变化。 4.4.2 皂化反应 取3 ml叶绿素提取原液，加1 ml 20% NaOH-甲醇溶液，摇匀， 65水浴5 min； 取出冷却后，先加3 ml苯，后加3 ml水（沿壁慢慢加入），轻轻摇匀，静置观察其分层现象。,5 结果记录与数据处理,表1 叶绿素的理化性质,5.1 实验现象记录与分析,5.2 叶绿素含量计算与分析,叶绿素浓度: COD652 / 34.5 ( mg/ml ) 叶绿素的含量（mg / g）=叶绿素的浓度提取液体积稀释倍数/样品鲜重 以样品重为3g为例: = C （2550 / 5）/3 = OD652 / （34.53） （2550 / 5）,6 注意事项,操作应在弱光下进行 ？ 研磨时间尽可能短，以不超过2分钟为宜 分光光度计的正确使用(更换波长后要调0) 皂化反应最后做 在低温下发生皂化反应的叶绿体色素溶液，易乳化而出现白絮状物，溶液浑浊，