3 酶的分离纯化-2.ppt

1、第六节 层析分离,是利用混合物中各组分的物理化学性质（分子大小和形状、分子极性、吸附力、分子亲和力和分配系数等）的不同，使各组分在两相中的分布程度不同而达到分离。 层析分离中一个相是固定的,称为固定相; 另一个相是流动的,称为流动相; 各组分移动速度步同,使不同组分分纯化; 层析分离设备简单,操作容易;,层析分离,层析柱,表4-5 层析分离方法,层析法的另分类,按两相所处的状态分类： 流动相有两种状态： *液体作为流动相 *气体作为流动相 固定相也有两种状态： *固体吸附剂作为固定相 *以吸附在固体上的液体作为固定相 按两相所处的状态分为： 液相层析 液-固层析 液-液层析 气相层析 气-固层

2、析 气-液层析,一、吸附层析 二、分配层析 三、离子交换层析 四、凝胶层析 五、亲和层析 六、层析聚焦 附1：层析操作 附2:高效液相色谱HPLC,生产上常用的层析分离方法,一、吸附层析,一个相中的物质在两相界面上密集现象称为吸附； 利用固定相的固体吸附剂表面对不同组分吸附力的大小及洗脱液对它的溶解作用（解吸作用）的差异进行分离。 吸附产生原因：固体表面分子与固体内部分子受的作用力不同；主要是范德华力。 特点：适合分离不同种类的化合物(醇类和芳香烃）。 不同物质吸附力、解析力不同，移动距离不同，而分离。,吸附层析法:利用吸附剂对不同物质的吸附力不同，而使混合液中各组分分离。（液-固色谱法，LS

3、C）,、吸附层析原理,吸附剂是具有大表面积的活性多孔固体，与待分离物质的极性官能团作用。 常用的吸附剂有活性炭、硅石、氧化铝、羟基磷灰石等;常用于酶分离纯化的：硅藻土、氯化铝、磷酸钙、羟基磷灰石、活性碳。 羟基羟基磷灰石（HA）Ca10(PO4)6.(OH)2,可用于分离蛋白质与核酸。 其表面有Ca2+和PO43-两种带电基团；酸性和中性蛋白质可与Ca2+结合；碱性蛋白质可与PO43-结合。HA柱层析最重要的用途之一是分离单链DNA和双链DNA，因为它对双链DNA的亲和力大于单链DNA。,吸附剂,、洗脱方法,（）溶剂洗脱法,洗脱液体积,物质浓度,（）置换洗脱法,洗脱液体积,物质浓度,、吸附剂与

4、洗脱剂的选择,（）吸附剂的选择 极性物易被极性表面吸附； 溶解度大的越难吸附； 吸附剂分无机和有机吸附；用于酶分离纯化的有硅藻土、氧化铝等，在低pH值、低离子强度下对酶有较强吸附作用，提高难度pH，离子强度即可洗脱。 （）洗脱剂的选择 对于极性组分用极性大的溶液； 注意点：洗脱剂不与吸附剂反应、对各组分溶解度大、流动性好，有一定纯度。,二、分配层析,分配层析法（液-液层析法，LLC） 原理：利用混合物在两种不相混溶的液相（固定相和流动相）之间的分配系数的不同而达到分离各组分的目的。固定相液体均匀覆盖于载体表面，流动相流过固定相。,分配系数,分配系数指溶质在两互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶

5、质在两溶剂中浓度比值。 当一种溶质分布在两个互不相溶的溶剂中时，它在固定相和流动相两相内的浓度之比是个常数，称为分配系数。 K=c1/c2 分配系数小的溶质在流动相中的分配的数量多，移动快；分配系数大的溶质在固定相分配的数量多，移动慢。因此可彼此分开。 通常用一种多孔性固体支持物吸着一种溶剂为固定相。 不同溶质有不同分配系数，移动速度不同，从而分离。 特点：液-液层析法适合于分离同系物或同分异构体,分类,（）纸上层析 滤纸为支持物，以滤纸纤维结合水为固定相，有机相为流动相，分配系数不同而分离。 （）薄层层析 固定相支持物铺在支持板上成为薄层，有吸附薄层层析，分配薄层层析。,层析柱分离物质的示意

6、图：,固定相为固体颗粒，装在层析柱内，高5cm，固定相周围充满液体流动相，每厘米柱中液相体积为1cm3。若在柱顶加入1cm3溶剂,其中含32mg样品，同时应有相同体积的溶剂从柱底流出，此时样品处于柱中A位置。若样品的分配系数是1，则它在固相与液相间等量分配。若再有1cm3的溶剂加到柱上，A部分中的溶剂带着16mg的物质向下移动到B，A和B中的物质都将发生再分配，,back,三、离子交换层析,原理:根据离子交换树脂对需要分离的各种离子的亲和力不同而达到分离的目的。 酶是两性物质，当溶液的pH值大于酶的等电点时，酶分子带负电荷，可用阴离子交换剂进行层析分离，反之，用阳离子交换剂。,用于酶分离纯化的

7、常用离子交换剂,离子交换树脂：大孔径离子交换树脂。 离子交换纤维素：DEAE-纤维素，AE-纤维素，CMC（羧甲基纤维素） 离子交换凝胶：DEAE葡聚糖凝胶、DEAE聚丙烯酰胺凝胶等。 离子交换树脂通常是不溶于水的高分子物质，分子中含有可解离的基团.含有酸性可解离基团的称为阳离子交换树脂，可解离出H+，含有碱性可解离基团的称为阴离子交换树脂，可解离出OH-。,何谓离子交换,离子交换是两种以上离子性物质互相交换过程，是一种物质运动，一般指水溶液中通过树脂发生的固-液间离子互换过程；,半透膜作用只是限制NO3-通过，只要把这些阴离子连接在交联聚合物架上，构成固液平衡体系，膜可不要，形式不管！ NO

8、3-换成SO3-即是强酸阳离子交换树脂，胺基（NR3+）接在树脂上是阴离子交换树脂。,圆的通过，方的通不过,离子交换层析的基本原理,+,+,若选择阳离子交换树脂，则带正电荷的物质与H+发生交换而结合在树脂上。若选择阴离子交换树脂，则带负电荷的物质可与OH-发生交换而结合在树脂上。 物质在树脂上结合的牢固程度即亲和力大小有差异，因此选用适当的洗脱液便可将混合物中的组分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的。,+,+,1、离子交换剂的处理与装柱； 2、上柱； 3、冼脱和收集； 4、离子交换剂的再生。,、离子交换层析的主要操作过程,、离子交换剂的选择与处理,是含有若干活性基团的不溶性高分子物质； 引入不溶

9、性母体的活性基团可以是酸性基团，作为阳离子交换剂；也可是碱性基团，作为阴离子交换剂； 平衡常数； （）离子交换剂的选择； （）离子交换剂的处理。,back,四、凝胶层析,概念（排阻层析，分子筛层析）：混合物随流动相流经装有凝胶作为固定相的层析柱时，混合物中各物质因分子大小不同而被分离的技术。 凝胶层析是60年代初发展起来的一种快速而又简便的分离技术。目前它已被生物化学、分子生物学、生物工程学及医药学等有关领域广泛应用。 从广义上说凝胶是一类具有三维空间多孔网状结构的高分子聚合物，如天然物质中的马铃薯淀粉及琼脂糖凝胶，人工合成品的葡聚糖凝胶及带离子交换基团的葡聚糖凝胶等。制成颗粒状，装进凝胶层析

10、柱使用。 设备简单，操作方便（不需经过再生处理可反复使用）。不需要有机溶剂，以及对高分子物质有很高的分离效果，适于不同分子量的各种物质。,凝胶颗粒,McBain(1928)提出； Synge与Tiselins（1950） 在解释凝胶层中的电泳和电渗现象时引用了分子筛的概念。 此后发现在柱层析中也有这种现象，于是许多工作者尝试了一系列适用于生物高分子分离纯化用的分子筛。 1959年Porath与Flodim 将部分水解的葡聚糖凝胶交联，得到了商品名为交联葡聚糖（Sephadex)的分子筛。该分子筛具有许多良好的性能，在蛋白质的分离分析中已被广泛采用。,分子筛概念,凝胶是分子筛的一种,、凝胶层析的

11、基本原理,凝胶颗粒装填到玻璃管中制成层析柱，加入欲分离的混合物，大量蒸镏水或其它稀溶液洗柱; 分子量最大的物质不能进入凝胶网孔而沿凝胶颗 粒间的空隙最先流出柱外。分子量最小的物质因能进入凝胶网孔而受阻滞，流速缓慢，最后流出柱外。 整个过程和过滤相似，故又名凝胶过滤、凝胶渗透过滤、分子筛过滤等。由于物质在分离过程中的阻滞减速现象，有人也称之为阻滞扩散层析、排阻层析等。,原理：凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长移动速度较慢，最

12、后被洗脱出来。,Kd：分配系数，Kd小的物质先流出。 Ve：冼脱体积，表示某一组分从进入导析柱到流出 液中出现该组分高峰时，所需的冼脱液的体积。 Vo：外体积。层析柱内凝胶颗粒之间空隙的体积 Vi：内体积，层析柱内凝胶颗粒内部各微孔体积的总和。,表征式,讨论,Kd=1,Kd=0,0Kd1,Ve=V0,组分足够大,不进入胶粒微孔,最先流出,Ve=V0+Vi,可自由扩散,最后流出,Kd小的先流出,Kd大的后流出,物质相对分子量的测定,凝胶层析冼脱特性与组分的相对分子量成函数关系； 组分冼脱体积与相对分子量（）关系如下：,以Ve对lgM做曲线，可通过测某组分的冼脱体积，查出其相对分子量！ 实际中常驻

13、机构用相对冼脱体积Kav=Ve/Vt对lgM做选择曲线； 每类型化合物有其选择曲线，故可通过凝胶层析测其相对分子量。,LogM=k1-k2Ve,附： 蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关,（Ve为洗脱体积）,先测得几种标准蛋白质的 Ve，并以其分子量对数对 Ve作图得一直线，再测出 待测样品的Ve，查标准曲 线即可确定分子量。,1、交联葡聚糖凝胶：以葡聚糖为单体聚合而成的高分子聚合物。商品名为Sephader，从G-10到G-200共有8种型号。 1) Sephadex G G 后的数字为凝胶吸水值的10倍。 G 反应凝胶的交联程度、膨胀程度和分部范围。 2） SephadeX LH

14、20，是Sephadex G25的羧丙基衍生物，溶于水和亲脂性溶剂，用于分离不溶于水的物质 2、琼脂糖凝胶：商品名为Sepharose（瑞典）Bib-gel ABlo-Rad（美国）Gelarose（丹麦）。 依靠糖链之间的次级键维持网状结构，琼脂糖密度越大，网状结构越密集。 3、聚丙烯酰胺凝胶：商品名为生物胶 PBio-gel P。人工合成的凝胶，以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联而成。交联剂越多，孔隙度越小。 4 、 聚丙乙烯凝胶（Styrogel) 大网孔结构。,、凝胶的选择与处理,、凝胶层析操作过程,加入的酶液量为凝胶床体积的10%左右， 不超过30%； 冼脱液体积为凝胶床体积的1

15、20%左右； 冼脱液与干胶溶涨和装柱平衡用液相同。,五、亲和层析,原理：利用生物分子对之间所具有的专一而又可逆的亲和力使生物分子分离纯化。 可用于亲和层析生物分子对酶-底物、酶-竞争性抑制剂、酶-辅酶。如：抗原和抗体 ； 激素和受体； RNA和其互补的DNA等。,、亲和层析母体和配体,配基(ligand) 作为固定相（成对互配生物分子的任何一方） 的一方； 母体（载体、担体）(matrix) 不溶性，常用琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶等。,机理图,有兩大类力量，构成分子之间的专一性吸引力。一是兩个分子之间，其构形有如积木般的互补，会因为范德华力的关系，产生专一性吸引力;另一則为两分子之间，因为某些基团

16、间产生了二級鍵，所造成的吸引力。,将待纯化物质的特异配体通过适当的化学反应共价的连接到载体上，待纯化的物质可被配体吸附，杂质则不被吸附，通过洗脱杂质即可除去。被结合的物质再用含游离的相应配体溶液把它从柱上洗脱下来。,、亲和层析方法,+,C,C,C,配基,蛋白质,1.配基固相化,2.亲和吸附,固体载体,3.解吸附,（）共价亲和层析 （）疏水层析 （）金属离子亲和层析 （）免疫亲和层析 （）染料亲和层析 （）凝集素亲和层析,亲和层析法,1、Covalent affinity chromatography,生物大分子功能基团与层析剂上配基形成可逆共价键； 例：巯基化合物SH与另一个SH形成二硫键，组

17、成氧化还原体系，是可逆的，故酶分子上巯基与层析剂上巯基形成二硫共价键，然后用L-半胱氨酸、二硫苏糖醇等冼脱。 母体可用BrCN活化，再用二硫基化合物处理得之。 应用例：共价亲和层析用于牛乳巯基氧化酶，青霉素酰化酶纯化。,2、Hydrophobic chromatography,酶蛋白的疏水基团与层析剂上烷基发生疏水结合反应； 疏水亲和通常在高浓度盐液下进行； 冼脱时降低盐浓度，可将疏水吸附的组分冼脱出来； 加入某些表面活性剂，使表面张力降低，有利于蛋白酶冼脱。,3、Metal ion affinity chromatography,螯合剂将金属离子螯合到母体，与某些蛋白酶表面可与金属离子结合的

18、残基亲和而将相关蛋白酶留在柱内； 改变盐浓度或改变pH降低金属离子与蛋白酶间亲和常数或用竞争性试剂置换等方法冼脱。,4、immumity affinity chromatography,又称抗体亲和层析，采用抗体或抗原做配基，还可采用蛋白A（金黄色葡萄糖球菌中分离）、蛋白G（细胞表面蛋白）； 对各种来源的免疫球蛋白的Fc区具高度专一亲和性； 应用例：组织纤维酶原激活剂（t-PA)的分离纯化！,5、dyestuff affinity chromatography,蒽醒化合物、偶氮化合物等有机染料具有NAD+的类似结构，可与需辅酶的多种酶进行亲和！,6、lectin affinity chroma

19、tography,凝集素，来源于拉丁文tolegere,本意为选择，是一 种非免疫来源、对糖及其缀合物可逆专一识别的蛋白质分子,凝集素广泛分布于植物、动物和微生物中 ，最早发现凝集素是在1888年,当时,在蓖麻子中发现了一种蛋白酶细胞凝集因子，在动植物自我保护上有着举足轻重的作用，如免疫学中凝集素补体活化途径。 与多糖、糖蛋白及红细胞、肿瘤细胞上凝集体亲和结合； 应用于糖蛋白的分离纯化，例如：SOD的3种同工酶的分离纯化。,back,六 层析聚焦,将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析特性结合在一起,实现组分分离。 柱内装上多缓冲离子交换剂，多缓冲液流经层析柱时形成稳定pH梯度；酶液和组分移

20、到与其等电点相当的pH位置上。 、交换剂和缓冲液体系 、pH梯度的形成 、层析聚集的操作过程,back,第七节 电泳分离,定义:electrophoresis带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。 电泳现象早在十九世纪初就已发现（1808年俄国物理学家Ress进行了世界上第一次电泳实验）。 但电泳技术的广泛应用，则是在1937年用滤纸作为支持介质成功地进行纸电泳以后，特别是近几十年以来，电泳技术发展很快，各种类型的电泳技术相继诞生，在生物化学、医学、免疫学等领域得到了广泛应用。,原则上按电泳的原理来分，可分为二类： 自由界面电泳：又称移动界面电泳，是指在没有支持介质

21、的溶液中进行的电泳。其装置复杂，价格昂贵，费时费力，不便于推广应用。 区带电泳：是指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。支持介质的作用主要是防止电泳过程中的对流和扩散，以使被分离的成分得到最大分辨率的分离。区带电泳由于采用的介质不同以及技术上的差异，又可分为不同的类型。,电泳的分类,按支持介质种类的不同，区带电泳可分为： 纸电泳：用滤纸作为支持介质，多用于核苷酸的定性定量分析。 醋酸纤维素薄膜电泳：医学上，常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白，其优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电泳分辨率高。 以上二种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子筛效应，主要靠被分离物的电荷多少进行分

22、离。 淀粉凝胶电泳：多用于同工酶分析，凝胶铺厚些，可一层一层剥层分析（一板多测）。天然淀粉经加工处理即可使用，但孔径度可调性差，并且由于其批号之间的质量相差很大，很难得到重复的电泳结果，加之电泳时间长，操作麻烦，分辨率低，实验室中已很少使用。,琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。 聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。其分辨率较高。 聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质 另外根据支持介质形状不同，区带电泳可分为：薄层电泳、 板电泳、柱电泳。 据用途不同，可分为：分析电泳、制备电泳、定量、免疫电泳。,电泳

23、的基本原理,原理:不同的物质，由于其带电性质及颗粒大小和形状不同，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不相同，因此可使它们分离。 在一定pH条件下，每一种分子都具有特定的电荷（种类和数量）、大小和形状，在一定时间内它们在相同电场中泳动速度不同，各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。这就是带电粒子可以用电泳技术进行分离、分析和鉴定的基本原理。,+,-,酸,碱,中,F0,F=0,H+,H+,OH-,迁移原理图,泳动度,若将带净电荷Q的粒子放入电场，则该粒子所受到的电荷引力为： F引=E Q （1） 在溶液中,运动粒子与溶液之间存在阻力F阻 F阻=6rV (2) 当F引=F阻时 EQ=

24、6rV (3) （4） 由上式可以看出,粒子的移动速度(泳动速度V)与电场强度(E) 和粒子所带电荷量(Q)成正比,而与粒子的半径(r)及溶液的粘度 ()成反比。非球形分子（如线状DNA）在电泳过程中受到更大 的阻力，即粒子的泳动速度与粒子形状有关。,带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度.,由（4）可知，带电粒子的泳动速度受电场强度影响，使得同一种带电粒子在不同电场里泳动速度不同，为了便于比较，常用迁移率 u（或称泳动度，指带电粒子在单位电场强度下的泳动速度）代替泳动速度表示粒子的泳动情况。 u = V/E = Q/6r （5） 由上式可以看出，迁移率仅与球形粒子所带电荷数量，粒子大小及溶液粘度

25、有关而与电场强度无关。,由于蛋白质、氨基酸等的电离度随溶液pH变化而不同，所以实际上常使用有效迁移率。有效迁移率U为迁移率u和当时条件下电离度的乘积。 U = u （6） 将（6）式代入（5）式得： U = （7）,.,Q,.,6r,由（7）式可以看出，凡能影响溶液粘度的因素如温度，影响分子带电量Q及解离度的因素如pH的改变，都会对有效迁移率，产生影响。,电泳的基本原理,以上讨论的是在溶液中进行的自由界面电泳的情况; 在用支持介质的区带电泳中，除上述影响因素外，有效迁移率还受电渗（是指在电场中，液体对于固体支持物的相对移动）的影响。 电泳时应避免用高电渗物质作支持介质。 最后要考虑选用离子强度

26、适宜的溶液。离子强度影响粒子的电动电势，溶液的离子强度越高，由于溶液中的离子会分担大部分电流，则粒子的电动电势越小，泳动速度越慢，反之越快。 总之，电泳受粒子本身大小、形状、所带电量、溶液粘度、温度、pH、电渗及离子强度多种因素的影响。,电泳的基本原理,因素总结,（1）电场强度E: 指每厘米的电压降； （2）溶液pH值:决定了颗粒分子所带的净电荷； （3）电渗:溶液对固体支持物的相对泳动； 此外,缓冲液的黏度、温度对颗粒的泳动速度也有影响。,用途（酶工程领域）,酶的纯度鉴定; 酶分子量测定; 酶等电点测定; 小批量酶的分离纯化.,水平电泳仪,垂直电泳槽,四、凝胶电泳,垂直管型盘状电泳； 垂直板

27、型电泳。,定义,以各种具有网状结构的多孔凝胶作为支撑物（通常是聚丙烯酰胺凝胶）的电泳技术。,形状,單面垂直電泳槽,水平板式电泳槽,垂直板式电泳槽,电泳条带,一、聚丙烯酰胺凝胶的制备（操作）,电泳,染色,脱色,定性、定量 （测量电泳迁移率）,制备凝胶,go,电泳图谱,胶膜放入底座,胶膜固定在底座上,加胶,放电梳,制胶完成取出,放入电泳槽中,安裝防护罩,整套安裝完毕准备电泳,制胶图示,Back,按装置不同分垂直管型盘状和垂直板型片状； 按凝胶组成系统不同分：,二、凝胶电泳分类,（1）连续凝胶电泳； （link) （2）不连续凝胶电泳； （link) （3）梯度凝胶电泳； （link) （4）SDS

28、-凝胶电泳； （link),back,采用相同浓度的单体和交联剂，相同pH值和浓度的缓冲液制备成连续均匀的凝胶，然后在同一条件下进行电泳。 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和交联剂甲叉双丙烯酰胺在催化剂作用下聚合而成； 丙烯酰胺单体浓度对凝胶孔径有显著影响,1、连续凝胶电泳,公式,附:聚丙烯酰胺凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好，有弹性，透明，化学性质稳定，对pH和温度变化小，没有吸附和电渗作用小的特点，是一种很好的电泳支持介质。 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺在催化剂作用下合成的。 聚丙烯酰胺凝胶电泳按原理和操作形式的不同，主要有不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳，SDS-

29、聚丙烯酰胺凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳，双向电泳等类型。,一、概述,二、聚丙烯酰胺凝胶的制备,聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种： 1.化学聚合 化学聚合的催化剂通常采用过硫酸铵（ammonium persulfate，Ap），此外还需要加速剂TEMED（N，N，N，N-四甲基乙二胺），它能以自由基的形式存在。微量TEMED的加入，可使过硫酸铵形成自由基： S2O82- 2SO4- 这些自由基的产生可引发丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的聚合、交联反应，形成有一定平均孔径的聚丙烯酰胺。,.,光聚合通常用核黄素为催化剂，核黄素经光照形成无色基，再被痕量氧氧化形成自由基，引发聚合反应。TEMED的

30、存在，可以加速聚合。 上述聚合反应受许多因素的影响： （1）大气氧能淬灭自由基，阻止多聚体链长的增加。在进行化学聚合前，一般用减压抽气的办法除去溶液中溶解的空气。在胶液表面，往往覆盖一层水或溶液，隔绝空气，可加速聚合。 （2）低温、低pH都会减慢聚合反应速度。 （3）有些材料如聚丙烯酸甲酯有机玻璃，一些金属等可抑制聚合反应。,2.光聚合,凝胶的物理性质如机械强度、弹性、透明度和粘着度都取决 于凝胶总浓度（T）和Acr与Bis两者之比。凝胶总浓度（T）和交 联度（C）的计算公式分别为： T= C= 凝胶孔径大小，主要受凝胶浓度的影响。凝胶浓度越大，孔 径越小。凝胶浓度过大，胶硬而脆，易折断。浓度

31、过小，凝胶稀 软，不易操作，也易断裂。当凝胶浓度确定后，交联度为5%时， 凝胶具有最小孔径，超过5%或低于5%时凝胶孔径都要增大。,三、凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系,Acr（g）+Bis（g）,V（ml）,X100%,Acr（g）+Bis（g）,Bis（g）,X100%,在浓度为7.5% 的凝胶中，大多数生物体内的蛋白质能得到 满意的分离效果。因此，把浓度为7.5% 凝胶称为标准胶。对于 一个未知样品，常用7.5%的标准胶或4%-10% 的凝胶梯度来测试， 而后选出适宜的凝胶浓度。 用于研究大分子核酸的凝胶多为2.4%的大孔凝胶，此时凝 胶太软，不易操作，可加入0.5%琼脂糖，或在3%凝胶

32、中加入20% 蔗糖以增加机械强度而又不影响凝胶孔径大小。,back,所使用的凝胶由二或三层不同孔径，不同pH的凝胶层组成; 稀释品在电泳定性中浓缩成层后再进入分离胶分离。提高分率能力; 使净电荷不同或净电荷相同但分子大小形状不同的物质分离.,2、不连续凝胶电泳,样品胶,浓缩胶,分离胶,不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳,系统的不连续性表现在以下几个方面： 1.凝胶由上、下两层凝胶组成，两层凝胶的孔径不同，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。 2.缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液，而分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。 3.在电场中形成不连续的电位梯度。 在这样一