RNA提取_RT-PCR技术专题.ppt

1、TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD,核酸纯化系统,“从RNA提取到荧光定量PCR”解决方案,市场部 蒋彦波 2008年4月 武汉,RNA相关知识及提取原理 RNA提取流程 特殊组织RNA的提取 RNA的评价、鉴定与保护 TIANGEN公司RNA提取产品选择指南,AAAAAA,细胞中RNA的种类和含量,RNA提取的基本方法裂解原理不同,异硫氰酸胍/苯酚法,细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放 释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离,胍盐/-巯基乙醇法,盐酸胍裂解样本，

2、抑制RNase的活性 -巯基乙醇变性蛋白,沉淀法 介质吸附,RNA提取的基本方法吸附方法不同,RNA相关知识及提取方法原理 RNA提取流程 特殊组织RNA的提取 RNA的评价、鉴定与保护 TIANGEN公司RNA提取产品选择指南,样品前处理实验材料的选择,选择新鲜血液，不得超过4小时,选择新鲜的幼嫩组织,选择处于生长旺盛的时期收集细胞,选择新鲜、生长旺盛的组织,可将新鲜血液先进行红细胞裂解，得到白细胞， 然后加入一定量的TRNzol，-70保存较长时间,去掉培养基，加入一定量TRNzol -70 保存较长时间,推荐使用专门的RNA样品 储存液进行储存,液氮保存，避免反复冻融,样品前处理实验材料

3、的保存,液氮研磨,匀浆或液氮研磨,应用红细胞裂解液处理,直接裂解或胰蛋白酶处理,样品前处理处理方式,Q-1：样品量是否越多越好？ A-1：不是。在试剂盒规定内增加，若过度增加样品处理量会影响RNA得率； 如增加样品起始量，则后续实验中各溶液量均要相应按比例增加。,样品前处理常见问答,Q-2：如何保证研磨过程和匀浆中RNA不被降解？ A-2：研磨过程要迅速，同时尽量避免外源RNA酶污染； 匀浆过程中一定要保证组织和裂解液充分接触，尽量在匀浆前将组织低温切割成小块加入裂解液中，可确保RNA不被降解。,样品前处理常见问答,细胞裂解释放RNA,异硫氰酸胍/酚TRNzol、TRNzolA总RNA提取试剂

4、,独特配方-RNAplant植物RNA提取试剂,胍盐/-巯基乙醇RNAprep pure系列RNA提取试剂盒,RNA纯化与获得 纯化要求,RNA纯化要求,1 纯化后不应存在对酶(如逆转录酶)有抑制作用物质 2 蛋白质、多糖和脂类分子等的污染降低到最低程度 3 排除DNA分子的污染,使用试剂（以TRNzolA为例） 使用试剂盒（以RNAprep pure试剂盒为例）,实验举例及注意事项,操 作 流 程,样品前处理、细胞裂解,试剂,试剂盒,抽提,沉淀,加入吸附柱,洗涤,溶解RNA沉淀,获得RNA产物,加去蛋白液 和DNase I,漂洗,RNA洗脱收集,样品处理量与加入的TRNzol-A+的量要对应

5、 1ml TRNzol-A+对应： 血液 0.3ml 动植物组织30-50mg 贴壁细胞：每10cm2培养面积 悬浮细胞：5-10106细胞,TRNzol-A试剂法提取加量,细胞,细胞选择,贴壁细胞 悬浮细胞,TRNzol-A试剂法提取提取动物培养细胞,等体积异丙醇沉淀,75乙醇洗涤沉淀,晾干溶解,RNA吸附柱,去蛋白液,漂洗,洗脱,水相 RNA,传统方法：有机溶剂抽提，得率高,柱纯化法：纯度高,TRNzol-A试剂法提取提取动物培养细胞,图片说明： M: TIANGEN Marker III A: A公司同类产品提取动物细胞结果 T: TIANGEN公司TRNzol-A提取动物细胞结果,试验

6、材料： Hela cell/106 实验方法： TIANGEN公司 TRNzol-A+ A公司同类产品 试验结果： 得率：TRNzol-A+得率与A公司同 类产品略高 纯度： 经TRNzol-A+纯度较高， 无明显DNA、蛋白残留,M,T,A,1 2 3 4 5 6,TRNzol-A试剂法提取实验举例,前处理,裂解,沉淀,洗涤,抽提,溶解,RNA降解,处理样品量,上清吸取，杂质去除,适量异丙醇,乙醇，盐离子残留,RNA不宜太干,TRNzol-A试剂法提取注意事项,操 作 流 程,样品前处理、细胞裂解,试剂,试剂盒,抽提,沉淀,加入吸附柱,洗涤,溶解RNA沉淀,获得RNA产物,加去蛋白液 和DN

7、aseI,漂洗,RNA洗脱收集,RNAprep pure试剂盒提取处理样本量,植物组织 30-50mg 动物组织 10-20mg 悬浮细胞 107 贴壁细胞 10cm2 血 液 0.5-1.5ml,RNAprep pure试剂盒提取动物组织,动物组织,研磨或匀浆,胍盐、-巯基乙醇 裂解细胞灭活RNase RNA在高盐低pH值条件下与硅胶膜结合 RW1除去蛋白残留 RW除去盐离子 在漂洗过程中利用DNase 除去基因组DNA RNA在底盐高PH条件下被洗脱 用经DEPC处理过的水或专门的试剂来洗脱或溶解RNA,裂解,结合,漂洗,洗脱,RNAprep pure试剂盒提取动物组织,胍盐、-巯基乙醇

8、裂解细胞灭活RNase RNA在高盐低pH值条件下与硅胶膜结合 RW1除去蛋白残留 RW除去盐离子 在漂洗过程中利用DNase 除去基因组DNA RNA在底盐高PH条件下被洗脱 用经DEPC处理过的水或专门的试剂来洗脱或溶解RNA,裂解,结合,漂洗,洗脱,RNAprep pure试剂盒提取动物组织,胍盐、-巯基乙醇 裂解细胞灭活RNase RNA在高盐低pH值条件下与硅胶膜结合 RW1除去蛋白残留 DNase I去除基因组污染 RW除去盐离子 RNA在底盐高PH条件下被洗脱 用经DEPC处理过的水或专门的试剂来洗脱或溶解RNA,裂解,结合,漂洗,洗脱,RNAprep pure试剂盒提取动物组织

9、,胍盐、-巯基乙醇 裂解细胞灭活RNase RNA在高盐低pH值条件下与硅胶膜结合 RW1除去蛋白残留 DNase I去除基因组污染 RW除去盐离子 RNA在低盐高PH条件下被洗脱 用经DEPC处理过的水或专门的缓冲液洗脱或溶解RNA,裂解,结合,漂洗,洗脱,RNAprep pure试剂盒提取动物组织,试验材料：大鼠肝脏/10mg 实验方法： TIANGEN公司 RNAprep pure Kit A公司某柱式RNA提取试剂盒 试验结果： 得率：RNAprep pure 得率比A公司产品高15左右 高纯度：纯度较高，且无盐份残留,TIANGEN A公司,TIANGEN A公司,M,TIANGEN

10、,A,RNAprep pure试剂盒提取实验举例,裂解,结合,漂洗,洗脱,控制提取样品量,防止堵柱或漏柱,盐离子去除,得率控制,RNAprep pure试剂盒提取注意事项,RNA相关知识及提取方法原理 RNA提取流程 特殊组织RNA的提取 RNA的评价、鉴定与保护 TIANGEN公司RNA提取产品选择指南,一些特殊组织的RNA提取,纤维组织 蛋白/脂肪含量高组织 核酸/RNase含量高组织 植物组织/真菌组织,彻底破碎,多次氯仿抽提,减少处理量，多次氯仿抽提,多次氯仿抽提，特殊试剂,RNA相关知识及提取方法原理 RNA提取流程 特殊组织RNA的提取 RNA的评价、鉴定与保护 TIANGEN公司

11、RNA提取产品选择指南,RNA的评价与鉴定,纯度（ OD260 /OD280 ）： 紫外分光光度计进行测量（选择正确的稀释倍数，确保OD260 值在0.11.0之间，通常离心柱法稀释10倍左右；溶液裂解法稀释4050倍） OD260 /OD280 2.1说明有部分降解 得率 紫外分光光度计进行测量； Yield OD260稀释倍数40ng/ul 电泳检测 1琼脂糖，6V/cm，15min，上样13 ul,M 1 2 M 1 2,RNA的保护RNA的不稳定性,内因：核糖残基的2和3位置带有羟基，易被水解 外因：内源、外源RNA酶含量丰富，加热后仍能够正确折叠恢复活性，不易失活,RNA的保护常用的

12、RNA酶抑制剂,焦碳酸二乙酯（DEPC） 异硫氰酸胍 RNasin 氧钒核糖核苷复合物 SDS、尿素、硅藻土等,RNA的保护提取前的保护,材料样品中的RNA保护 RNA提取工作区RNase的清除 实验耗材，器皿的RNase清除,塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡4-10小时，再灭菌 玻璃器皿可在180烘烤4小时 塑料制品和枪头避免交叉污染,组织破碎 细胞裂解 实验人员,适当的破碎方法,适量的裂解液,正确的操作和防护措施,RNA的保护提取过程中的保护,保存过程 RNAsafe 后续实验 RNasin,RNA的保护提取后的保护,RNA相关知识及提取方法原理 RNA提取流程 特殊组织RNA的提取 R

13、NA的评价、鉴定与保护 TIANGEN公司RNA提取产品选择指南,TIANGEN公司RNA提取试剂/盒,硅胶膜吸附法,沉淀法,DP315 TIANamp病毒DNA/RNA提取试剂盒,DP421 TRNzol-A总RNA提取试剂,RNAprep pure 系列试剂盒,DP430 RNAprep pure培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒,DP431 RNAprep pure 动物组织总RNA提取 试剂盒,DP432 RNAprep pure 植物总RNA 提取试剂盒,DP433 RNAprep pure 血液总RNA 提取试剂盒,DP420 RNAprep pure 微量总RNA 提取试剂盒,TR

14、NzolA 总RNA提取试剂,RNAprep pure 总RNA提取试剂盒,1 样品预处理方式相同 2 裂解原理不同 3 RNA纯化原理不同： TRNzol-A：有机溶剂抽提，异丙醇沉淀 RNAprep pure：硅基质吸附膜分离纯化,分析比较,RNA提取结果比较,TIANGEN公司RNA相关试剂/盒,RNA样本保存试剂,RNA保护试剂,RNA纯化试剂盒,DP408 RNAstore 组织样本保存液,DP412 RNAclean RNA纯化试剂盒,DP409 RNAsafe （用于保存RNA）,DP418 RNasin （用于RT等下游实验）,RT系统,TIANGEN BIOTECH (BEI

15、JING) CO.,LTD,“从RNA提取到荧光定量PCR”解决方案,RT-PCR原理简介 RT-PCR技术中的关键点 TIANGEN公司RT产品选择指南,RT-PCR原理简介,RT-PCR两种方法,二步法,一步法,RT-PCR两种方法,RT-PCR原理简介 RT-PCR技术中的关键点 TIANGEN公司RT产品选择指南,模板：总RNA，mRNA，体外转录的RNA 引物：随机引物，Oligo dT，基因特异性引物(GSP) 反转录酶：AMV M-MLV Quant Reverse Transcriptase,RT反应体系,逆转录酶的选择,AMV：禽成髓细胞瘤病毒，逆转录酶和RNA酶H活性。最适42。 MMLV：Moloney 鼠白血病病毒，逆转录酶，RNA酶H活性较弱。最适37或42。 Quant Reverse Transcriptase 全新高效逆转录酶，与RNA模板的亲和力强， 对GC含量高的模板通读效果好，质量