基因克隆技术.ppt

1、2008.11.28,基因克隆的技术方法探讨,基因工程所用到的酶系,（一）限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）,能识别双链DNA分子的特定序列，并在识别位点或其附近切割 DNA的一类内切酶。简称为限制性酶（restrition enzyme）。,取微生物属名的第一个字母和种名的头两个字母组成三个斜体字母加以表示，遇有株名，再加在后面。如果同一菌株先后发现几个不同的酶，则用罗马数字加以表示。,EcoRI,表示大肠杆菌属名第一个字母,E：,表示种名头两个字母,co：,表示株名,R：,表示该菌中第一个被分离出来的酶。,I：,Hind III的识别序列：,5-A A G

2、 C T T-3 3-T T C G A A-5,5-A A G C T T-3 3-T T C G A A-5,切割后形成具有粘性末端（cohesive end）的DNA片段：,限制性酶一般不在识别序列的对称轴上切割，而是交错切割结果形成5 或3单链突出的粘性末端的DNA限制片段。,二个具有互相匹配的粘性末端的DNA片段可以通过碱基 的互补及DNA连接酶的作用而重新连接起来。,HpaI的识别序列：,5 - G T T A A C - 3 3 - C A A T T G - 5,5 - G T T A A C - 3 3 - C A A T T G - 5,切割后形成具有平末端（blunt e

3、nd）的DNA片段：,限制酶在识别序列的对称轴上切割，形成的DNA片段 没有突出的单链。,具有平末端的DNA片段也可以在DNA连接酶的 作用连接起来,（三）DNA连接酶（DNA ligase） DNA连接酶可以将两个DNA片段的3-OH与5-P连接起来,（二）DNA聚合酶 具有催化DNA链从53方向聚合反应的活性，还具有从53(其小片段)和从35(大片段)的外切核酸酶活性。,三、基因工程所用到的克隆载体,以扩增外源DNA为目的载体-克隆载体（cloning vector）,（1）载体在细胞中必须能够进行独立自主地复制,（3）载体必须具有可供选择的遗传标记,（2）载体应具有酶切位点，便于外源DN

4、A的插入,a）低分子量；,还应具备的特点：,b）具有较高拷贝数；,c）易于导入细胞；,d）具有安全性；,穿梭载体,表达载体,基因工程的基本过程,1. 基因分离或合成：,2. 体外重组,3. 重组载体导入受体细胞,4.特定克隆子的筛选,构建基因文库（目的基因所在菌株）,导入缺陷型菌株或突变菌株,筛选能功能互补的克隆,获得目的基因,鸟枪法克隆新的目的基因,有机磷水解酶基因的克隆,文库构建,Total DNA extraction,Sau3AI partial digest(gatc),Recovery of 2-4kb fragments,ligation,载体脱磷,puc19载体 BamH I

5、酶切,puc19载体提取,转化,挑选转化子,筛选阳性克隆,在理论上，构建的基因文库采用 Clarke的统计公式计算： N=ln（1-p）/ln（1-x/y） P是从建成的文库中可能筛选出某个基因的概率， x指该文库中每个独立克隆所含有外源DNA片段的平均长度， y是该生物基因组的大小， N是该文库应含的克隆数目。,Positive clones and puc19,阳性克隆在含有相应农药的平板上产生水解圈,如何做亚克隆?-以四氢嘧啶降解相关基因为例,设计一个功能验证的策略,设计一个片段分解的策略,选择合适的载体,选择内切酶种类和设计引物,载体双酶切,片段PCR克隆,双酶切,酶连转化 大肠杆菌DH5,三亲杂交到KT,功能验证,内切酶的选择,只有Apa I和EcoR I可供选择,5-CGCTGAATTCGTGAAGTT