动物细胞工程.ppt

1、动物细胞工程应用,动物细胞培养,动物细胞融合,单克隆抗体技术,核移植,动物细胞工程常用技术,皮肤烧伤，如果创面很小（不大于硬币）只要保持清洁，甚至深度烧伤，也可能自愈。如果下层真皮受损面积较大，常常需要植皮。植皮需要的健康皮片。植皮需要的健康皮片，可以取自烧伤病人自身未烧伤的部位（自体植皮），也可取自其他活人或尸体（异体植皮）等。自体植皮是永久性的，取自其他人或动物的植皮是暂时性的，是在创面愈合过程中为保护创面而采取的措施，1014天后就要被身体排斥。,如果一个大面积烧伤的病人来说，自体皮肤有限，其他渠道的皮肤来源不足。如何才能获得大量的自体健康皮肤？,人耳鼠,“人耳鼠”再出风头 2001年，

2、一只特别的活老鼠在北京引起轰动这是有着一对红眼睛的、尾巴长长的、浑身没毛的小白鼠。值得一提的是，这只小白鼠的背上，竟长着一只几乎与身子一般大小的“人耳”。这只老鼠背上的“人耳”是由上海市第九人民医院副院长、整复外科主任曹谊林教授利用组织工程技术复制出来的。,在京展出的数天，尽管门票高达20元，但还是有将近20万人，心甘情愿地掏钱一睹“人耳鼠”的风采。,人耳鼠的出现，透露了怎样的信息？,动物细胞培养和核移植技术,一、动物细胞培养,1.发展历史: 20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问题展开了激烈的争论。1907

3、年，美国生物学家哈里森(Harrison)从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后，在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物细胞培养。,2、动物细胞培养的应用和概念：,动物细胞培养就是从动物有机体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞,然后,放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和增殖.,动物细胞的培养过程,幼龄动物,取动物器官 和组织,剪碎组织,胰蛋白酶处理,细胞培养,单个细胞,动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术

4、的基础,剪碎组织的目的？,胰蛋白酶处理的目的？,3、动物细胞培养过程：,动物胚胎或幼龄动物的组织、器官,细胞悬浮液,胰蛋白酶,10代细胞,原代培养,传代培养,无限传代,单个细胞,加培养液,动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。,（分解弹性纤维）,有关概念,原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。（分装前的细胞培养） 传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。,有关概念,细胞株：传代培养的细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到405

5、0代，这种传代细胞为细胞株。 细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。 细胞株和细胞系的区别： 细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。,动物组织细胞培养要求,一 体外培养特点: 大多数动物细胞要附在物体上表面生长，动物细胞培养对营养要求更严格，除氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖外，还需要血清。对环境适应性差，对环境敏感，包括：PH、溶解氧、温度、剪切力等比微生物要求更高。,二 培养工具:,培养瓶、培养皿、培养管、多孔培养板等。,细胞培养以玻璃器皿为主。 器皿应选择透明度好

6、、无毒、 中性硬度玻璃制品。,根据培养细胞种类要求不同培养瓶的形态各异，用于细胞传代培养的细胞要求瓶壁厚簿均匀，便于细胞贴壁生长和观察，瓶口要大小一致，口径一般不小于1cm，允许吸管伸入瓶内任何部位。,三、培养条件细胞在体外培养中所需的条件与体内细胞基本相同。,【讨论】 多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，讨论以下问题： 1.体外培养细胞时需要提供哪些物质？ 提示：充足的营养供给、适宜的温度、适宜的pH和气体环境。 2.体外培养的细胞需要什么样的环境条件？ 提示：无菌、无毒的环境。,1）恒定的温度:37 ，,维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。人体细胞培养的标准温度为36.50.5

7、，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。培养细胞对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过39时，细胞代谢与温度成正比； 人体细胞在39-401小时，即能受到一定损伤，但仍有可能恢复； 在40-411小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有可能恢复； 41-421小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个别细胞仍有恢复可能； 当温度在43以上1小时，细胞全部死亡。低温下会使细胞代谢速率降低,2）PH：7.2-7.,当PH低于6或高于7.6时的生长会受到影响，甚至死亡。 用来检测PH的变化：红色-pH7.4， 橙色-pH7.0，黄色-pH6.5，蓝红色-pH7.6，紫色-pH7.8。,

8、3) 气体：,有调节PH的作用。 气体是人体细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧气参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中。,4）营养培养基：,在保证细胞渗透压的情况下，培养液里的成分要满足细胞进行代谢所需要的各种营养，如包括十几种必需氨基酸及其他多种非必需氨基酸、维生素、碳水化合物及无机盐类等。只有满足了这些基本条件，细胞才能在体外正常存活、生长。 动物细胞的培养基一般分为天然、合成、无血清培养基几种，此外细胞培养还需要一些常用的溶液。,合成培养基,1951年厄尔开发了供动物

9、细胞体外生长的人工合成培养基(MEM)。合成培养基的种类相当多。合成培养基成分已知，便于对实验条件的控制。但与天然培养基相比，有些天然的未知成分尚无法用已知的化学成分所替代，因此，细胞培养中使用的基础合成培养基还必须加入一定量的天然培养基成分，以克服合成培养基的不足。最普遍的作法是加入小牛血清。 人工合成培养基，如109培养液、DMEM、199、 RPMI-1640，IMEM，MEM培养液等。,天然培养基,直接采用取自动物体液或从组织中提取的成分作培养液，主要有血清、组织提取液、鸡胚汁等。 血清是天然培养基中最有效和最常用的培养成分。它含有许多维持细胞生长繁殖和保持细胞生物学性状不可缺少的未知

10、成分。 使用最普遍的天然培养基是血清，基本以小牛血清最普遍。血清由于含有多种细胞生长因子、促贴附因子及其多活性物质。与合成培养基合用，能使细胞硕利增殖生长。,常用的动物血清主要有牛血清和马血清。牛血清分为胎牛血清和犊牛血清，前者来源少，价格高；后者要求刚产下尚未哺乳的小牛，因为哺乳后的小牛血清中可能含有更复杂的成分。血清中已知的成分主要有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等。蛋白质主要是白蛋白和球蛋白。,氨基酸是细胞合成蛋白质的基本成分，氨基酸中有12种是细胞本身不合成的，必须由培养液提供。激素有胰岛素、生长激素和多种生长因子如表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、增殖刺激因子(MSA)、类胰岛素生长因

11、子(IGFl、IGF2)等。 水解乳蛋白、胶原是另外两种较好的天然培养基成分。水解乳蛋白是乳白蛋白的水解产物，呈蛋黄色粉末状，富含氨基酸。一般配制成05溶液，微酸性。胶原是从动物真皮中提取的，具改善细胞表面特性促使其附着生长的作用。,无血清培养基,动物血清成分复杂，各种生物大小分子混合在一起，有些成分至今尚未搞清楚。血清对细胞生长很有效，但后期对培养产物的分离、提纯以及检测造会成一定困难。另外高质量的动物血清来源有限，成本高，限制了它的大量使用。 无血清培养基不加动物血清，在基础培养基中加入细胞生长有效因子，激素等。,5) 细胞培养溶液,平衡盐水（BSS）： Hanks 液和Earle液是常用

12、的BSS基础溶液。 PH调整液： NaHCO3溶液、HEPES溶液（二羟乙基哌嗪乙烷磺酸） 细胞消化液: 胰蛋白酶溶液EDTA溶液胶原酶溶液,抗生素溶液： 1)青、链霉素:每毫升培养液含100U青霉素和100ug链霉素. 2)卡那霉素：终浓度为50ug/ml培养液。 3）制霉菌素：浓度25U/ml，小瓶分装，每瓶一次用完。,6)、无污染环境,培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要条件。当细胞放置于体外培养时，与体内相比细胞丢失了对微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代谢物质积累等，可导致细胞死亡。因此在进行培养中，保持细胞生存环境无污染、代谢物及时清除等，是维持细胞生存的基本条件。,四

13、细胞培养设施,1、实验室设计细胞培养是一种无菌操作技术，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害因素的影响。细胞培养室和设计原则是防止微生物污染和有害因素影响，要求工作环境清洁、空气清新，干燥和无烟尘。 细胞培养室的设计实施原则一般是无菌操作区设在室内较少走动的内侧，常规操作和封闭培养于一室，而洗刷消毒在另一室。,细胞培养实验室,1.准备室 2.缓冲室,准备室,风淋,3.培养室,培养室,专用于组织细胞培养的空间，应包括更衣间、缓冲间、操作间。 内设超净工作台、培养箱等细胞培养的必要设备，应具备紫外消毒、通风及温控设施。 操作间放置净化工作台及二氧化碳培养箱、离心机及倒置显微镜等。

14、缓冲间可放置电冰箱、冷藏器及毒好的无菌物品等,风淋室： 风淋室是生物洁净室的理想配套设备，它不仅可以清除人体和物品表面附着的尘埃，减少带入洁净室的灰尘量，而且兼有气闸室的功能，可防止非洁净空气的侵入。风淋室的板壁采用轻质隔热夹芯钢板，吹淋板采用进口不锈钢制作，吹淋口方向可调，风淋时间可在30-99秒间的调整。风淋室可以配合加热器，冬天可以加热，温度可调，一般控制温度在30-35较为适宜。,超净工作台,也称净化工作台，分为侧流式、直流式和外流式三大类。,CO2培养箱,哺乳动物离体细胞培养和体内细胞一样,需要在恒足温度下才能生存,温差变化一般不应超过0.5度，因此培养箱对温度应具有较高灵敏度。 C

15、O2培养箱的优点在于能恒定地供应一定量的CO2,一般5%即可维持培养液PH值稳定。,冰箱,细胞培养的冰箱应特别注意清洁，防止污染。,水纯化装置细胞培养对水的质量要求较高。一般需要使用重蒸或三蒸水配置各种培养用液。,过滤装置,各种培养用液只能用过滤的方法进行除菌消毒处理。微化滤膜滤器是目前应用最广泛的过滤装置。,细胞冷冻贮存器 细胞冷冻贮存具有经济、省力和较好保持细胞生物学特性的优点，目前各实验室主要使用液氮容器贮存细胞。,培养器皿 培养器皿包括各种规格的玻璃、塑料培养瓶，培养皿，吸管，离心管等。,洗刷消毒间： 烤箱、消毒锅、蒸馏水处理器及酸缸等。 分析间： 显微镜、计算机及打印机等。,无菌操作

16、的要领,由于体外培养的细胞缺乏机体抗感染功能，所以在一切操作中要努力作到最大限度的无菌，防止污染。 超净工作台消毒打开紫外线杀菌灯照射消毒2030分钟，然后关闭紫外灯，打开风机，流入的空气是经过除菌板过滤的空气，工作台可保持无菌环境。 洗手 操作时因整个前臂伸入工作台内，所以洗手一定要刷洗到肘部，然后用0.2%新洁尔灭或75%的酒精棉球擦拭。,火焰消毒,所使用物品均应经过烧灼，所用瓶口等开启或封盖时均需迅速旋转过火焰进行消毒。注意金属器械不能在火焰上烧灼时间过长。 烧过的用具均要待冷却后再接触组织细胞。 吸取营养液后的吸管不能再经火焰烧灼,否则会烧焦形成炭膜,再用时会将有害物质带入培养液。,合

17、理布局 右手使用方便的用品放右侧，左手使用方便的用品放左侧。 酒精灯置于中央，打开的培养液、培养瓶等应保持斜立或平放（瓶口长时间开口直立,易增加落菌机会）。 吸取各种用液应分别使用吸管，不能混用。,3.动物细胞培养 的条件,1.无菌无毒的环境 2.营养 3.温度和pH 4.气体环境,应该加入哪些物质？这些物质如何调配？,在使用合成培养基时通常需加入血清、血浆等天然成分，目的是什么？,4.动物细胞培养技术的应用,蛋白质生物制品的生产 如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体 健康细胞培养 培养健康细胞用于烧伤病人皮肤移植 细胞的生理、药理、病理研究 用于筛选抗癌药物,植物组织培养和动物细胞培养的比较,细胞

18、的全能性,细胞增殖,固体培养基,液体培养基,蔗糖 植物激素,葡萄糖 动物血清,植物体,细胞株、细胞系,快速繁殖、培育无病毒植株,获得细胞或细胞分泌蛋白,思考：,2、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？,1、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培培养基有何独特之处？,3、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？,4、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？,主要成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。独特之处有：1、液体培养基 2、成分中有动物血清等,因为这些组织或器官上的细胞生命力旺盛，分裂能力强,成块组织不利培养，分散了做成细胞悬浮液利于

19、培养,不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体,动物细胞融合与单克隆抗体,一、动物细胞融合,细胞融合是正常的生命活动,两个细胞正在融合,受精作用,动物细胞融合,细胞A,细胞B,杂种细胞,灭活的病毒,物理法 化学法,仙台病毒 疱疹病毒 新城鸡瘟病毒,用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程,细胞融合与融合诱导细胞融合物质,诱导剂：仙台病毒 聚乙二醇 电融合 诱导细胞融合的仙台病毒必须灭活。,二、单克隆抗体,什么是抗体？ 抗体是机体受抗原刺激后产生的、并能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。 B淋巴细胞产生抗体。,B淋巴细胞与抗体,B淋巴细胞受抗原刺激后，可以产生抗体。 动物

20、体内的B淋巴细胞可以产生百万种以上的抗体，每种抗体对特定的抗原具有特异性免疫作用。 每一个淋巴细胞只能产生一种抗体。,单克隆抗体,由单个B淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。 特点： 特异性强、灵敏度高,如何大量生产单克隆抗体？,利用淋巴细胞产生抗体的功能 利用肿瘤细胞无限增殖的特性 利用细胞融合的技术将两种细胞融合获得具有淋巴细胞和肿瘤细胞特性的杂交瘤细胞 利用动物细胞培养技术大量培养杂交瘤细胞,单克隆抗体制备过程,细胞融合、筛选,足够数量的、能产生特定抗体的细胞群,单克隆抗体,思考：,1、本过程利用了哪些原理？

21、,免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理,2、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合？,这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体,单克隆抗体的应用,与常规抗体相比，单克隆抗体产量高，特异性强，灵敏度高，优越性十分明显。,应用主要有：,1、临床诊断,2、作为载体，运载抗癌药物，形成“生物导弹”治疗肿瘤,资料：目前世界各国已经研制出数以百计的单克隆抗体。许多缺乏良好诊断手段的传染病、免疫性疾病、血液病、内分泌疾病和遗传病，用单克隆抗体作为诊断手段，是一个必然趋势。另外，用单克隆抗体做体内诊断，借以鉴别和定位体

22、内“病灶”也引起人们的注意，目前，主要用于肿瘤追踪及心肌梗塞的诊断。,植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较,动物的胚胎移植,解决某些妊娠时间长、每胎产子数量少的优良种畜的繁殖速度问题。,胚胎移植技术,试管动物（婴儿）培养过程,受精卵,一、动物体细胞核移植技术和克隆动物,1、动物细胞全能性的表现程度不同,受精卵,胚胎干细胞,多能干细胞,单能干细胞,体细胞,核移植,胚胎细胞核移植,体细胞核移植（难度高）,2、动物体细胞核移植是将动物的一个细胞的细胞核,移如入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中.使其重组并发育成一个新的胚胎,这个新的胚胎最终发育为动物个体。,3.培育过程,母体子宫,4、原理,动物体细胞核具

23、有全能性,细胞质,细胞核,细胞核移植,多莉羊的培育过程,克隆羊的成功证明了什么？,1、动物体细胞核具有全能性； 2、细胞质具有调控细胞核发育的作用。,动物体细胞核移植是一种无性繁殖技术，用核移植的方法得到的动物称为克隆动物。,其意义： 1、有利于遗传疾病的治疗，优良品种的培育 2、对物种的优化、濒危动物的保护和转基因动物的扩 群有重要意义 3、降低畜牧业的成本，缩短育种年限，提高生产效率,体细胞核移植技术存在的问题：,许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，如体型过大，异常肥胖，发育困难，脏器缺陷，免疫失调等。,动物细胞特点？ 分化潜能变窄：随着细胞分化程度的提高而逐渐受到限制，分化潜能变窄，这是指

24、整体细胞而言。 细胞核仍具有全能性：细胞核，它含有保持物种遗传性所需的全套基因，而且并没有因细胞分化而丢失基因，因此高度分化细胞的细胞核仍具有全能性,根据动物细胞核仍具有全能性的特点,怎样将动物细胞的全能性表达?,利用动物体细胞核移植技术,动物核移植：,将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体。,用核移植的方法得到的动物。,克隆动物：,多莉羊的培育过程,无性生殖,2.体细胞核移植技术的应用前景,克隆动物的研究意义,1.克隆动物作为生物反应器，生产医用蛋白 2.改良动物品种 3.治疗人类疾病，作为供体 4.保护濒危

25、动物,体细胞核移植技术存在的问题,1.许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，如体型过大，异常肥胖，发育困难，免疫失调等。 2.成功率非常低及克隆动物食品的安全性问题。,小结,两个过程,动物细胞培养过程,单克隆抗体制备过程,三个“一”,一个诱导细胞融合的新方法 灭活病毒,一个新细胞杂交瘤细胞,一个优势单克隆抗体特异性 强、灵敏度高的优势,植物细胞工程,植物细胞工程的基本技术和理论基础,植物细胞工程的理论基础是： 植物细胞的全能性,概念：细胞的全能性是指生物体的细胞具有使后代细胞形成完整个体的潜能。 原因：是生物体的每一个细胞都含有该物种所特有的全套遗传物质及发育为完整个体所必需的全部基因。,细胞的全

26、能性,当植物细胞脱离了原来所在植物体的器官或组织而处于离体状态时，在一定的营养物质、激素和其他外界条件的作用下，就可能表现出全能性，发育成完整的植株。,在生物的个体发育中，由于基因在特定时间和空间下选择性地表达而形成不同器官，因此，要实现细胞的全能性，首先必须使生物体的细胞处于离体状态。,植物组织培养的概念,植物组织培养就是在无菌和人工控制条件下，将离体的植物器官、组织、细胞，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其产生愈伤组织、丛芽，最终形成完整的植株。,植物组织培养的过程,离体的植物器官、组织或细胞,脱分化（又叫去分化）,愈伤组织（排列疏松而无规则，高度液泡化的呈无定形状态的薄

27、壁细胞）,再分化,根或芽等器官,植物体,二、植物组织培养,植物组织培养过程,相关问题,1、在植物组培过程中，为什么要进行一系列的消毒，灭菌，并且要求无菌操作？ 2、为什么切取胡萝卜根的形成层，其他部分也能培养成小植株吗？,植物体细胞杂交的概念,将不同种植物的体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新的植物体的技术。 （不同种生物之间存在着生殖隔离，所以用传统的有性杂交方法是不可能做到这一点的）,相关问题,（1）要想让两个来自不同植物的体细胞融合在一起，遇到的第一个障碍是什么？ （2）有没有一种温和的去细胞壁的方法？ （3）为什么两个原生质体能发生融合，这与细胞膜的什么特性有关？ （4）如果两个来源不同的原生质体发生融合形成了杂种细胞，下一步该对此细胞做何种处理？ （5）如何将杂种细胞培育成杂种植株？,植物体细胞杂交过程,杂合的原生质体,杂种细胞,愈伤组织,杂种植株,植物体细胞杂交过程,原生质体制备（酶解法去细