菌种操作规程.ppt

1、菌种操作规程,（Master Operation Procedure for ARA Production Strain） CA/WA0012004版,1目的 建立菌种操作规程，确保菌种保藏、自然选育、生产供种操作规范性，提供优质高产的生产菌种。 2 范围 生产一部菌种组。 3 责任 菌种组操作人员负责本操作规程的实施。,安瓿管的制备,空白安瓿管的制备 安瓿管有三种：手榴弹形、球形、直形。任意选取一种放于重铬酸钾-浓硫酸溶液（100g/mL）中浸泡10h，然后取出用自来水反复冲洗多次，最后用蒸馏水洗二次，烘干。将写有菌种编号及制备膜的标签放入安瓿管内，将有字的一面向管壁，塞上棉塞，121灭菌1

2、小时。,脱脂牛奶的制备,将买来的新鲜牛奶倒入离心管中以3000转/分离心15分钟，去掉上层的脂，下层即为脱脂牛奶。 脱脂好的牛奶倒入试管（18200mm）或250mL三角瓶中，置消毒锅中灭菌，灭菌温度110、时间20分钟。 按10%的抽样率抽取灭菌好的脱脂牛奶作无菌实验，每支肉汤倒入约1mL左右的牛奶。然后置37恒温间培养48h观察肉汤变化情况，判定是否染菌，如无染菌，即可使用。,孢子悬浮液的制备,将经过摇瓶考察指标符合要求对照的斜面孢子，制成高浓度的孢子悬浮液，用无菌的毛细吸管或注射器将菌液分装于安瓿管底部，每管装0.30.5mL,预冻及速冻,灌装好的安瓿管置25冰箱预冻1h，然后置-30温

3、度下速冻1h后取出，置真空干燥器内。,真空干燥,将装在安瓿管的真空干燥器接入真空泵上，在-15温度下，抽真空68h。然后再在室温抽4h。,封口 将抽好的安瓿管在酒精喷灯上进行熔封（边抽真空边封口）。 安瓿管的泄漏测定 用高频火花测定仪进行测定。测定方法：将测定仪照着安瓿管管壁打一枪，如果各壁呈紫色的光即为合格，如果没有颜色，呈白光，即是不合格产品。 保藏 合格安瓿管置25冰箱保藏，保藏期为110年。 记录 安瓿管在保藏过程中应控制温度，每天查看温度并填写温度、湿度原始记录，在使用过程中应填写安瓿管使用记录。,砂土管的制备,砂的处理 普通黄沙用稀酸（1N的HCL或H2SO4）或稀碱（1NNaOH

4、）浸泡12小时后,倒去酸水，用自来水充分冲洗至PH中性，烘干后用磁铁吸去铁屑，经60目筛过筛后备用。 土的处理 取离地面1公尺以下的黄土，（不含有机质）打碎，加适量水充分搅拌，将上层混浊液倒出静置（下层成块的土弃之）使土沉淀，倒出上层清液后，再加适量水搅拌，沉淀。如此反复洗涤直到PH呈中性。沉淀出来的土烘干，碾碎，经80目筛过滤后备用,砂土管的制备 方法,将处理好的沙和土按2：1(或其它比例)混合均匀，分装于10mm100mm硬质玻璃试管中，每支砂土管装量为1.5克，用新做的棉塞塞好，并外包牛皮纸，123125湿热灭菌30min，间歇灭菌6次，每隔24小时一次，最后一次消好后置135145烘箱

5、干烘一小时，然后进行抽样无菌检查，每10支砂管抽1支，将沙土倒入肉汤培养基中，3638培养48小时，若仍有杂菌，则需要全部重新灭菌，再作无菌试验，直至证明无菌，方可备用。,砂土孢子的制备,斜面孢子的选择及质量标准 取经选育的单菌落制备的大试管斜面孢子或生产良好的茄氏瓶斜面孢子，具以下条件：孢子层生长丰满，较均匀，孢子数量较多，少水，孢子呈淡黄色。斜面孢子一般培养79天，孢子成熟。经无菌试验检查正常。发酵摇瓶试验生产能力符合要求。 生产能力试验： 原则上每批斜面孢子应作生产能力试验，尤其在大生产不正常情况下，为配合发酵工艺寻找异常原因，每批斜面应作摇瓶考察。 7-9天 11天 斜面孢子 摇瓶发酵

6、 放瓶 指标要求： DW（对照）94%；TL（对照）94%；AA 45%，指标符合要求，方可使用，并填写摇瓶考察配制记录和原材料摇瓶考察。,生产斜面的制备,生产斜面 分为子斜面和母斜面，其PDA培养基配方如下：,生产斜面,选择无芽马铃薯去皮后用蒸馏水洗干净，称量所需重量，并切成边长0.5厘米左右的方形。 将马铃薯碎块放在铝锅内，加入一定量的蒸馏水，置于电炉上煮沸30分钟，边煮边搅拌，防止马铃薯结底。 用双层纱布滤出马铃薯原液，然后按照配方将称量好的葡萄糖加入溶解，再用吸管吸取KH2PO4、 MgSO4溶液加入，用量筒定容至所需体积，PH自然。 将定容后的培养液放置电炉上加热，将称量好的琼脂，边

7、搅拌边加入，待琼脂全部融化后，取下培养基进行分装。 母斜面用30200mm的大试管分装，每支大试管约20mL；子斜面用茄子瓶分装，每支约60mL，装好后，塞好棉塞，用双层纱布扎口后，再用牛皮纸扎口，放置在不锈钢筐中，盖上牛皮纸，准备消毒。 将准备好的不锈钢筐放在消毒车上推入消毒柜内，按蒸汽消毒柜使用方法用蒸汽消毒，119121，保温30分钟，接种用具保温60分钟。 消毒结束后，取出斜面待温度降至4050时，将大试管或茄子瓶摆成斜面，空白斜面培养12天，观察无杂菌生长后，包装好备用，并填写PDA斜面配制记录和培养基接种用具消毒记录。,母斜面接种及培养,母斜面接种由两人操作，一人为主操作安瓿管，一

8、人为辅操作大试管。首先用消毒好的砂轮在安瓿管上端1/4处划痕，用纱布包住，掰开上端。 用毛细吸管吸取0.5mL左右的无菌蒸馏水加入安瓿管中，搅拌均匀，然后吸取0.10.2mL接入大试管斜面中，每支安瓿管接3支大试管。 用无菌铲将种液在斜面上划线，使之均匀分布，然后塞上棉塞，用双层纱布扎口，并将接种铲在肉汤培养基中蘸一下做无菌试验，将肉汤放置37培养间培养。 将接种后的母斜面放置培养间，温度28，湿度5070%，培养79天，观察生长情况，并填写母斜面生长记录和温度湿度原始记录。 母斜面生长成熟后，取下，无菌试验正常则用0.1%新洁而灭溶液灭菌后再用牛皮纸扎口后放置冰箱低温保藏备用温度28，保藏期

9、不超过15天；无菌试验不正常则按废样液处理办法处理并填写废样液处理记录。,子斜面接种及培养,子斜面接种由两人操作，一人为主操作，一人为辅操作。首先将子斜面和母斜面的双层纱布解去，将绳子和纱布放在超净台左边待用。主操作将母斜面和子斜面的棉塞逐个打开，并在酒精灯火焰上烧瓶口至无水雾为止。 主操作用无菌铲将母斜面上的孢子和菌丝刮下，接种于子斜面中，利用子斜面的冷凝水，将孢子和菌丝打散，均匀涂布于子斜面表面，然后塞上棉塞，用双层纱布扎口，并将接种铲在肉汤培养基中蘸一下做无菌试验，将肉汤放置3638培养间培养。一支母斜面接种一般接12支子斜面。 将接种后的子斜面放置培养间，温度28，湿度5070%，培养

10、79天，观察生长情况，并填写子斜面生长记录和温度湿度原始记录。 子斜面生长成熟后，取下，无菌试验正常则用0.1%新洁而灭溶液灭菌后再用牛皮纸扎口后放置冰箱低温保藏备用，保藏期不超过15天；无菌试验不正常则按废样液处理办法处理并填写废样液处理记录。,母瓶菌丝的制备,母瓶培养基配方,配制称量时，一般将不溶或难溶物质（如酵母粉等）和易溶解物分开称，根据母瓶培养基配方称取所需葡萄糖和酵母粉重量，葡萄糖用蒸馏水溶解，酵母粉直接按配比分装于三角瓶内。 定容后用10N的NaOH调节PH至8.28.8，按每瓶100mL的量分装于500mL直口三角瓶内，塞好棉塞，用双层纱布扎口后，再用牛皮纸扎口，放置在不锈钢筐

11、中，盖上牛皮纸，准备消毒。 将准备好的不锈钢筐放在消毒车上推入消毒柜内，按蒸汽消毒柜使用方法用蒸汽消毒，119121，保温30分钟，接种用具保温60分钟并填写母瓶配制记录和培养基接种用具消毒记录。,母瓶接种及培养,母瓶接种由两人操作，一人为主操作子斜面，一人为辅操作母瓶，主操作用接种铲取孢子于茄氏瓶中，一支铲子只能用于一只子斜面，将35支子斜面的孢子接入装有80mL无菌水的带玻璃珠三角瓶中，放置摇床上180220转/分钟摇1015分钟制成孢悬液。 用10mL吸管吸取5mL孢悬液接种于母瓶，接种后塞上棉塞，包扎纱布，置180220转/分摇床上，281培养4450小时左右，待菌丝长好后取下，准备并

12、瓶。 并瓶前应按5%的比例对母瓶进行抽查，观察菌丝的外观，测定菌浓和PH，并进行镜检，合格后才可并瓶。 母瓶进罐前，要在无菌条件下并瓶，一般情况下1012瓶合并为一个种瓶，约1000200mL。 种瓶并好后，将瓶口包扎纱布和牛皮纸，等待进罐，若母瓶不进罐，并瓶后应置于28冰箱保存，期限不超过2天。 并瓶后，每五个三角瓶残液并为一瓶，接种于肉汤培养基中做无菌试验；在接种小罐后将种瓶中的残液接种于肉汤培养基中做无菌试验，将肉汤培养基放置3638培养间培养，观察变化情况，作为一种无菌监测，为事后分析作准备。 在发酵水平出现连续异常时，应对母瓶摇瓶进行跟踪实验。,母瓶菌丝质量标准,外观 浅黄色至棕黄色

13、、刺球状或花状。 菌浓 不小于25%。 菌丝阶段 阶段。 PH 5.57.0。 镜检 没有污染杂菌。,小罐接种操作,本工艺采用菌丝进罐和倾倒式接种法。 接到消毒人员通知后接种。首先准备好无菌石棉手套、白工作服和帽，再准备好工业酒精、火焰圈和打火机。 接种人员穿好衣服后，一人将浸泡工业酒精的火焰圈套在小罐接种口上，一人拆开种瓶包扎的牛皮纸和纱布，待消毒人员通知后点燃火焰圈，燃烧一分钟左右，当接种帽旋下后，在火焰圈内迅速打开种瓶棉塞，将种液倾倒入小罐内，残余种液在超净台接种肉汤培养基，作无菌监测，接种完毕后填写种瓶生产进罐记录和培养基接种用具消毒记录。,摇瓶试验,发酵摇瓶配方 发酵摇瓶配制 发酵摇

14、瓶接种操作,发酵摇瓶配方,发酵摇瓶配制,称量时，一般将不溶或难溶物质（如酵母粉等）和易溶解物分开称，根据发酵摇瓶培养基配方称取所需葡萄糖和酵母粉重量，葡萄糖用自来水溶解，酵母粉直接按配比分装于三角瓶内。 定容后用10N的NaOH调节PH至8.28.8，按每瓶100mL的量分装于500mL翻口三角瓶内，塞好专用夹心纱布，用牛皮纸扎口，放置在不锈钢筐中，盖上牛皮纸，准备消毒。 将准备好的不锈钢筐放在消毒车上推入消毒柜内，按蒸汽消毒柜使用方法用蒸汽消毒，119121，保温30分钟，接种用具保温60分钟并填写摇瓶配制记录和培养基接种用具消毒记录。,发酵摇瓶接种操作,发酵摇瓶接种由两人操作，一人为主操作

15、子斜面，一人为辅操作摇瓶，主操作用接种铲取孢子于茄氏瓶中，一支铲子只能用于一只子斜面，将35支子斜面的孢子接入装有80mL无菌水的带玻璃珠三角瓶中，放置摇床上摇1015分钟制成 接种后将摇瓶瓶口纱布扯平扎紧，置180220转/分摇床上，281湿度50% 70%的条件培养11天后，下摇瓶测生物量、总油和AA的含量并填写原材料摇瓶考察结果记录。,菌种选育和复壮,自然分离 初筛、复筛,自然分离每年进行一次。先将菌株作分离培养，挑出若干个单孢子菌落，将这些菌落初筛和复试，选出比出发菌株高产的优良菌株,孢子悬浮液制备：取斜面孢子于适量的有玻璃珠的无菌水的三角瓶中，放置小摇床上，时间一般为15分钟即可。

16、分离培养基为马铃薯培养基（PDA）。 在灭菌好的培养皿内，加入约15mL灭菌好的马铃薯培养基，置水平凝固后，一支1mL无菌吸管从孢子悬浮液中吸取1mL注入盛有9mL无菌水的试管中，吹吸三次，使充分混和，然后用一支1mL无菌吸管从此试管中吸取1mL注入另一盛有9mL无菌水的试管中，以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4 、10-5各种稀释度的孢子悬浮液（注：稀释液最好提前准备，空白培养12天为好）。 将上述各种稀释度的溶液按照10-1、10-2、10-3、10-4 、10-5的顺序，用无菌的涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀。 将其放于281，温度50%70%的恒温间培养48小时左右，待

17、菌落长好后挑出若干个单孢子菌落接于斜面上，待斜面长好后，要进行摇瓶考察，初筛结果好的斜面用于生产埋砂土管，若初筛不好，需复筛，直到选出比出发菌株高产的菌株,初筛、复筛,由单孢子菌落接种的斜面孢子 摇瓶发酵 下摇瓶测试DW、TL、AA、（以母株作对照）选出较高菌落将其斜面埋砂土 复筛（每株用三个摇瓶、重复三次）最后选出比出发菌株高的菌株作生产菌种，或是选出一个较高的新变种作进一步选育之用。,废液样处理方法,菌种废母瓶、废悬浮液，化验样余样，菌种观察菌丝及测PH多余发酵液等均不得直接倒入下水道，必须升温至100左右煮沸30分钟后，再放入下水道并填写废样液处理记录。,染色剂的配制,美兰（亚甲苯基兰，

18、一种碱性染料） 取0.3克美兰溶于30mL 95%酒精中，再加蒸馏水至100mL过滤即得。 酚红配制 方法一：称取1克酚红于研钵中，用0.05N氢氧化钠调成糊状，研磨，再分次加入氢氧化钠溶液（总量为57mL）研磨，充分溶解后，加蒸馏水至100mL，过滤即成。 方法二：称取1克酚红于研钵中，用43mL的95%的酒精溶解后，再次加入总量为57mL的0.05N氢氧化钠，待其充分溶解后，过滤即成。 碳酸品红染色剂 碱性品红酒精饱和液：品红1克、溶于9mL 95%酒精 5%石碳酸溶液：石碳酸4.5克，溶于90mL蒸馏水中 两种溶液混合，搅匀，过滤即得。,消毒剂配制,1.52.0%来苏尔溶液：150200

19、mL来苏尔加蒸馏水至10000mL。 75%酒精：95%酒精79mL加蒸馏水至100mL。 甲醛熏烟：40%甲醛50mL，高锰酸钾20克盛于牛皮纸中包好，带入无菌室混合，紧闭无菌室经12天后，借送风设备将甲醛高锰酸钾气体排出。 丙二醇50mL加热熏烟灭菌。 0.1%新洁尔灭菌溶液：1mL新洁尔溶液加蒸馏水至1000mL。 1%2%来苏尔溶液：将10%的来苏尔溶液稀释510倍。 重铬酸钾浓硫酸（100g/mL）（洗液）配制：称取化学纯重铬酸钾100g于烧杯中，加入100mL蒸馏水，微加热，使其溶解。把烧杯放于水盆中冷却后，慢慢加入化学纯硫酸，边加边用玻璃棒搅拌，防止硫酸溅出，开始有沉淀析出，硫酸加到一定量沉淀可溶解，加硫酸至溶液总体积为1000mL,细菌培养基,肉汤培养基 固体培养基,肉汤培养基配制,配方,配制 为了称量方便，一般称牛肉膏时放玻璃棒，其它成分分别加适量的蒸馏水溶解之，混合后加足水量，再加酚红溶液，搅拌均匀，用10N的氢氧化钠调PH到7.007.40。 分装 将配制好的肉汤培养基分装于18180mL试管中，装量每支约为8mL，塞棉塞，装入有牛皮纸的不锈钢筐中。 消毒 在0.1MPa蒸汽压力，119121下灭菌30分钟，灭菌后置3638恒温室培养24小时后检查无杂菌生长，溶液清亮无沉淀，消后PH为7.0左右，每批使用期不超过7天，肉汤培养基配制记录和培养基