细胞重组课件.ppt

1、第十四章 细胞重组及动物克隆技术,动物克隆:是一种通过核移植过程进行无性繁殖的技术。 发育早期的动物胚胎细胞或成年动物的体细胞核经显微手术移植到去掉细胞核的卵母细胞中之后，在适当的条件下，重新发育成正常胚胎。这种胚胎被移植到生殖周期相近的母体之中，可以发育成为正常动物个体。 克隆动物，其遗传结构与核供体母体完全相同。 这项技术是以核移植技术为基础的。细胞重组技术之一,第一节 细胞重组技术,概念 重组技术的发展 重组技术,第一节 细胞重组技术,一、概念： 细胞重组（cell reconstruction）：应用一定的实验方法和技术从活细胞中分离出细胞器（组分）并在体外条件下进行异源装配形成具有生

2、物活性的新细胞或细胞器的技术。 根据重组的方式，细胞重组可分为三种：核移植技术、胞质重组技术和微细胞杂交。,第一节 细胞重组技术,一、概念（细胞重组方式） 1、核移植技术：即胞质体和核体的重组，包括一个细胞的核移入另一个细胞；两个细胞的核质交换（细胞拆合）。 胞质体（cytoplast）：去核细胞 核体（karyoplast）：从细胞中分离得到的细胞核，一般带有少量细胞质并有质膜包裹。 核移植技术是动物克隆技术的基础。例克隆羊多莉。,第一节 细胞重组技术,一、概念（细胞重组方式） 1、核移植技术： 2、胞质杂种（cybrid）：胞质体与完整细胞组合 3、微细胞杂交：微细胞与完整细胞融合 微细胞

3、（microcell）：仅有一条或几条染色体的细胞。 微细胞杂交一般用于细胞遗传和基因定位研究。,核移植技术是动物克隆技术的基础，核移植是通过显微操作技术实现的。,第一节 细胞重组技术,二、细胞重组技术的发展 细胞重组技术的起始研究为细胞核遗传的全能性。 1938年 德国科学家HansSpemann 建议用成年的细胞核植卵子的方法进行哺乳动物克隆。 1952年，英国的Briggs和King 沿用Spemann的思路和实验技术克隆青蛙。,核供体为囊胚期的胚胎细胞实验成功 核供体为原肠胚期的中胚层和内胚层细胞实验失败,1958年到1962年，英国剑桥大学的John Gurdon和Machineer

4、利用爪 蟾原肠内胚层细胞核移植，培育出可育的非洲爪蟾。 1970年John Gurdon以同样的方法，用青蛙脚蹼角质化细胞进行移核 试验，蛙卵发育成了蝌蚪。（两牺类成功）,二、细胞重组技术的发展,从1961年开始，童第周等 以金鱼和鳑鮍鱼为材料，进行鱼类不同亚科间的细胞核移植获得成功，用以研究杂交细胞核与纯种细胞核在发育功能上的差异，以及细胞质对细胞核的影响。（鱼类成功） 1980年，中国科学院武汉水生生物研究所 鲫鱼移核试验成功。 1989年 童第周、牛满江 将鲫鱼胚胎细胞核移入鲤鱼去核的未受精卵中，成功地无性繁殖了“鲤鲫核鱼”新品种。,二、细胞重组技术的发展,1981年，瑞士日内瓦大学和美

5、国杰克逊实验室合作，首次对小鼠卵进行移核试验获得成功。将囊胚内细胞团细胞的核移入去核的受精卵中，获得了两雌一雄仔鼠，并且可育。 1986年，丹麦科学家Willadsen 用胚胎细胞克隆出1只羊 1997年 英国人IanWilmut 成功获得体细胞克隆羊“多利” 这是世界上第一例利用成年体细胞核获得的克隆动物 1998年 一个多国联合科学小组 人的腿部细胞与奶牛的卵细胞结合，成功克隆了1个人的胚胎，但只“生活”发育了12d就被有意毁掉。 1998年1999年，美国人White用珍稀动物盘羊的体细胞核与牛卵结合；我国学者陈大元将大熊猫体细胞核与兔卵结合，均成功克隆出早期胚胎。,熊 猫 克 隆,二、

6、细胞重组技术的发展,2000年，美国科学家 克隆出首例灵长类动物 恒河短尾猴“泰特拉（Tetra）” “泰特拉”未用细胞核移植技术，而是采用胚胎分解的方法（将受精卵培育卵裂至8个细胞时将其分离，植入受体母亲）。 2000年6月22日，张涌（ 西北农林科技大学） 雌性体细胞克隆山羊“阳阳” “阳阳”经自然受孕后，于2001年8月8日产下一对混血儿女，雄性叫“欢欢”，雌性叫“庆庆”， 是“阳阳”与世界首批胚胎克隆山羊交配的后代。证明体细胞克隆山羊和胚胎克隆山羊具有与普通山羊一样的生育繁殖能力。 2001年，美、意科学家联手展开克隆人的工作，遭到国际社会的普遍反对。,第一节 细胞重组技术,三、细胞重

7、组技术 这里主要介绍的是非动物克隆用途的重组操作技术，动物克隆技术的操作方法与此有差异，在动物克隆里面讲。 胞质体的制备和核体的制备 微细胞的制备 重组方法（细胞融合、显微注射）,三、细胞重组技术,1、胞质体的制备（试剂） 细胞松弛素（cyochalasin）：可以干扰胞质分裂，引起细胞表面形状改变，诱导细胞排核。目前发现的细胞松弛素种类很多，应用最广泛的为细胞松弛素B（CB）。 CB 的脱核效率较低（20%），时间较长（824h），且对某些细胞无作用，现广泛结合离心技术，效果较好。脱核率为8095%左右。,三、细胞重组技术,1、胞质体的制备（制备过程） （1）：细胞培养：细胞培养在内径略小于

8、离心管的培养板上。 （2）：CB处理：待细胞汇合后，向离心管中加入37的CB溶液。 塑料板：加入CB约离心管体积的1/5，细胞面朝下放入溶液，再加圆形栓固定细胞板，1100015000r/min离心20min。 玻璃板：先在离心管中加入脱核环，再加CB溶液，细胞面朝下放入细胞板，离心。,三、细胞重组技术,2、核体的制备 离心后组分：完整细胞；核体；胞质体；碎片 （1）去完整细胞 离心 贴壁纯化 反复两次 去掉完整细胞 贴壁纯化：完整细胞贴壁快（12h），核体慢（510h）。3h后转移上清再次贴壁。 （2）核体与胞质体的分离 密度梯度离心 1%6% Ficoll/蔗糖密度梯度离心，分层收集 也可

9、以直接用密度梯度离心的方法分开四种成分。,三、细胞重组技术,3、微细胞的制备 培养细胞 秋水仙素长时间处理（48h以上） 解抑制 核膜包裹部分染色体 CB和离心技术分离微核 梯度离心纯化 细胞融合 4、重组方法（细胞融合、显微注射）,三、细胞重组技术,5、去核细胞的性质 胞质体：去核后细胞可存活1636h，这段时间内细胞的一些基本生命活动特征同去核前一样，但代谢活性下降。 核移植一般在制备后数小时内进行。,第二节 动物克隆技术,核移植克隆动物的技术操作过程主要包括： 核受体和核供体的制备 核移植 重组胚激活 重组胚的体外或体内培养 胚胎移入代孕母畜（寄母）,第二节 动物克隆技术,1、胞质体（核

10、受体细胞）的制备 去核卵母细胞常作为核移植的受体细胞。这是因为在卵母细胞的细胞质含有某种特定的因子，可以使移植核中的基因表达程序发生重新排列，使已经分化了的细胞重新回到发育过程的原点，同受精卵一样开始个体发育过程。 一般用激素对雌体进行超排处理获得体内成熟的M卵母细胞。也可体外培养卵母细胞至成熟。,第二节 动物克隆技术,2、核供体的制备 细胞核供体细胞首先必须是完整的二倍体，必须保持有供体动物完整的基因组。 供体细胞主要有两大类：胚胎细胞和体细胞，体细胞又包括干细胞和一般体细胞。 对应的动物克隆也分为胚 胎 克 隆（使用的核供体细胞如果来自多细胞阶段的胚胎）和体细胞克隆（使用的核供体细胞来自动

11、物体）。,第二节 动物克隆技术,3、核移植 常用的核移植方法有两种，即胞质内注射和透明带下注射。 胞质内注射：是用一个外径58m 的注核针吸取供体核后直接注射进卵母细胞胞质内的方法。 透明带下注射：是把供体细胞核注射在透明带与卵母细胞之间的卵周隙中，核移植后用电刺激进行细胞融合。,3、核移植,3、核移植,1 切开卵母细胞透明带 2 挤出卵母细胞细胞核 3 注入供体细胞核 4 电融合仪融合,第二节 动物克隆技术,4激活 核移植产生的重组胚，需要人工启动胚胎发育程序，称为胚胎激活。 激活原理是通过电刺激、钙离子载体等方法，使卵母细胞从M期中解放出来，并转到“受精”的状态。 方法：电激活、化学激活如

12、乙醇、钙离子载体处理。,第二节 动物克隆技术,5、重组胚的体内或体外培养 体内培养：重组胚用琼脂包埋后移入同种或异种动物的输卵管中体内培养4-7d，发育至桑椹胚和囊胚。例：羊和牛的重组胚 体外培养：重组胚在培养液中培养至囊胚期，再转入动物动物输卵管中。大鼠、小鼠和兔的核移植胚多作体外培养。,第二节 动物克隆技术,6、胚胎移植 重组克隆胚胎移植的受体母畜要选择皮毛颜色与供体品种不同、繁殖性能强、体格稍大的当地品种，进行同期发情处理，按常规方法移植代孕母畜（寄母）的子宫中，待其发育到产仔。,例：克隆羊的产生,例：克隆羊的产生,例：克隆羊的产生,4 新的卵细胞植入羊的结扎的输卵管内 6天后发育为桑椹

13、胚或囊胚 （816个细胞）。,5 将此早期胚胎移入假孕母羊子宫中 产下多利即为6岁母羊的复制品 白色,第三节 细胞重组的意义及局限性,一、核 移 植 技 术 的 应 用 细胞治疗 异种器官移植 生产治疗性蛋白 保护濒危物种 培育各种疾病动物模型,1 异 种 器 官 移 植,可移植器官短缺 猪的器官大小、结构和功能上与人体器官相近 急性免疫排斥反应 基因敲除半乳糖基转移酶 核移植 基因敲除SPF克隆猪 器官移植,2 生 产 药 用 蛋 白,1997 年底,英国Roslin 研究所和PPL 公司通过克隆转基因体细胞，获得了6只整合neo 或neo 和F2IX 基因绵羊,这标志着核移植介导的转基因技术成功问世。 2000 年,英国PPL公司将人AAT 基因(天冬氨酸氨基转移酶)定点整合到胎儿成纤维细胞的1 原胶原( Procollagen) 基因座位,而后用转基因细胞进行核移植,生产出世界首例基因打靶绵羊,其乳中AAT 蛋白含量达到了650 mg/ L ,远高显微注射法18 mg/ L 的水平。 2004 年，台湾培育带有治疗血友病的“第八凝血因子”的体细胞克隆羊。2005 年，这只克隆羊产下一只同样带有第八凝血因子的公羊。,2 生 产 药 用 蛋 白,第三节 细胞重组的意义及局限性,二、局限性 1、理论问题 分化的