氨基酸的薄层层析-分离鉴定氨基酸混合液.ppt

1、如何分离鉴定氨基酸混合液？,生物化学与分子生物学实验教学中心,氨基酸的薄层层析(Thin layer chromatography of amino acids),生物化学与分子生物学实验教学中心,09年秋季学期,生物化学与分子生物学实验教学中心,实验目的,掌握薄层层析法的一般原理。 掌握氨基酸薄层层析法的基本操作技术。 掌握如何根据移动速率（Rf值）来鉴定被分离的物质（即氨基酸混合液）。,09年秋季学期,生物化学与分子生物学实验教学中心,层析技术,概念：是利用化合物中各组分的物理性质的差别（如溶解度、吸附能力、分子形状和大小、分子极性等）使各组分在两相中的分布不同，从而使各组分以不同速度随流

2、动相向前移动而达到分离的目的。 特点：分离效率高，能分离各种性质相类似的物质。不仅可用于少量物质的分离纯分，也可用于大量物质的分离纯化和制备。,09年秋季学期,生物化学与分子生物学实验教学中心,层析的基本过程,组分A 组分B,+ 流动相,固定相,吸附 溶解 结合等,解除上 述作用,反复进行,移动速度不同,09年秋季学期,生物化学与分子生物学实验教学中心,层析法的分类,气相层析（以气体为流动相的层析法） 液相层析（以液体为流动相的层析法，此为生物化学领域里常用的方法） 1.吸附层析：薄层吸附层析、吸附柱层析 2.分配层析：纸层析、柱层析、薄层层析 3.离子交换层析 4.凝胶层析：柱层析、薄膜层析

3、 5.亲和层析,09年秋季学期,生物化学与分子生物学实验教学中心,实验原理,1.薄层层析法是色谱分析技术的一种 一般是将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。当液相（展开溶剂）在固定相上流动时，由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样，不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不一样，点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同，因而可以彼此分开。（即通过吸附-解吸-再吸附-再解吸的反复进行，而将样品各组分分离开来）,09年秋季学期,生物化学与分子生物学实验教学中心,2. 氨基酸与茚三酮的显色反应 茚三酮水化后生成水化茚三酮，它与氨基酸的羧基反应生成还原茚三酮、氨及醛，与此同时，还原茚三酮又与氨及

4、茚三酮缩合生成蓝色化合物而使氨基酸斑点显色。,实验原理,09年秋季学期,生物化学与分子生物学实验教学中心,茚三酮反应(ninhydrin reaction),09年秋季学期,生物化学与分子生物学实验教学中心,实验原理,3.混合氨基酸被分离后在薄层层析图谱上的位置用相对迁移率Rf值（rate of flow）来表示。 层析中，物质沿溶剂运动方向迁移的距离与溶液前沿的距离之比为Rf值。 由于物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，故移动速率（Rf值）也是恒定的，因此可以根据Rf值来鉴定被分离的物质。,09年秋季学期,生物化学与分子生物学实验教学中心,实验材料,吸附剂：硅胶 粘合剂： 0.5%的羧甲基纤

5、维素钠 氨基酸的异丙醇溶液 丙氨酸、精氨酸、甘氨酸 展开-显色剂（正丁醇、乙酸、茚三酮溶液） 分析样品：氨基酸混合液,09年秋季学期,生物化学与分子生物学实验教学中心,器材,层析板、尺子、铅笔 烧杯、量筒 喷雾器、吹风机 毛细管、层析缸 药匙 烘烤箱,09年秋季学期,生物化学与分子生物学实验教学中心,操作步骤 薄层板的制备,1、调浆 称取硅胶3克，加0.5%的羧甲基纤维素钠8毫升，调成均匀的糊状。 2、涂布 取洁净的干燥玻璃板均匀涂层。 3、干燥 将玻璃板水平放置，室温下自然凉干。 4、活化 70烘干30分钟。切断电源，待玻璃板面温度下降至不烫手时取出。,09年秋季学期,生物化学与分子生物学实

6、验教学中心,操作步骤 点样,2cm,1cm,1、位置：用铅笔距底边2cm水平线上均匀确定4个点。每个样品间相距1cm。 2、用毛细管分别吸取氨基酸溶液，轻轻接触薄层表面点样。 3、加样后原点扩散直径不超过2mm。 4、待点样点干后再重复点一次。,Ala Arg Gly Mix,09年秋季学期,生物化学与分子生物学实验教学中心,操作步骤 展层、显色,将薄层板点样端浸入展层-显色剂，展层-显色剂液面应低于点样线。盖好层析缸盖，上行展层。当展层剂前沿离薄板顶端2cm时，停止展层，取出薄板，用铅笔描出溶剂前沿界线，用热风吹干或在85下烘干，即可显出各层斑点。,Ala Arg Gly Mix,09年秋季学期,生物化学与分子生物学实验教学中心,注意事项,1.切勿用手直接接触薄层板面。 2.点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴。 3.样品量太少，有的成分不易显示；样品量太多，易造成斑点过大，互相交叉或拖尾。,09年秋季学期,生物化学与分子生物学实验教学中心,Rf =,斑点至原点距离,溶剂前缘至原点距离,结果计算,小心量出斑点中心至原点中心距离，再量出原点中心至溶剂前沿的距离，计算出它们的 值。 根据值，鉴定出混合样品中氨基酸的种类，并绘出