抗体酶在生物催化领域的应用.ppt

1、抗体酶在生物催化中的应用，讲座内容，抗体酶，制备，问题与展望，酶：一种具有生物催化功能的聚合物。抗体：在抗原刺激下，由B淋巴细胞或记忆细胞分化的浆细胞产生的免疫球蛋白，能与相应的抗原特异性结合。共性：一是蛋白质；两者都可以高度选择配体并特异性结合靶分子。区别：抗体特异性结合抗原，帮助巨噬细胞吸收和破坏抗原；酶以高选择性结合底物，并以高效率催化反应。如果抗体能被赋予酶的催化作用，酶的种类无疑将大大扩展，其前途和功效是不可估量的。抗体酶简介，抗体的结构，定义，抗体酶是由抗原诱导的具有催化能力的抗体，它在结构上与抗原高度互补，并能与抗原特异性结合。它的本质是一种具有催化能力的免疫球蛋白，但它在可变区

2、被赋予了酶的属性，因此也被称为“催化抗体”。抗体酶主要来自IgG抗体分子。抗体结构分析表明， IgG分子由两条相同的重链和两条相同的轻链通过二硫键连接而成。木瓜蛋白酶作用于抗体后，产生三个片段，其中相同的两个片段为FabFab中的抗原结合位点是高度可变区(F v)，该位点的广泛结构和序列变化决定了抗体对外来物质的识别特征，其中电荷互补和立体互补是其分子识别的主要特征。第二，抗体酶的作用原理是抗体与抗原在结构上高度互补，并能与抗原特异性结合，抗体酶是生物体中抗原诱导的具有催化能力的抗体。通过设计化学反应过渡态或中间类似物作为半抗原，可以诱导机体产生抗体，抗体可以特异性识别过渡态分子，降低反应活化

3、能，达到催化反应的目的。抗体酶像所有抗体一样，由两条轻链和两条重链组成。抗原与轻链和重链的可变区特异性结合，因此可变区的氨基酸序列决定了抗体分子的特异性。其实质是一种具有催化活性的免疫球蛋白，其可变区赋予其酶的性质，故又称催化抗体抗体酶，可催化趋势反应和非趋势反应。后者可分为两种情况。另一种情况是降低反应中过渡态的能垒。然而，抗体酶缺乏天然酶的韧性或变形性，并且不具有天然酶的底物去稳定功能，但只能稳定过渡态。抗体酶可以催化酯水解反应、羟化酶重排反应等。在抗体催化的反应中，酯水解反应是研究最广泛的，所以这里只介绍酯水解反应的原理。酯水解反应的过渡态为带负电荷的四面体结构。以MOPCI67催化的碳

4、酸盐水解为例。首先用化学方法合成了硝基苯磷酸胆碱酯，它是一种过渡磷酸酯的类似物，作为半抗原与牛血清白蛋白偶联，然后将抗原注射到动物体内，在动物血液中产生了能与过渡碳酸酯特异性结合的抗体MOPCl67。然后用单克隆技术分离纯化MOPCI67。在抗体催化的碳酸酯反应中，MOPCI67和过渡碳酸酯的结合提高了反应物过渡态的稳定性，降低了反应的活化能，加速了水解反应。反应产物的速率常数l(c)达到(o40004)/min，米氏常数Km为208431摩尔。)、三。抗体酶的制备、通过免疫动物产生血清多克隆抗体、细胞工程阶段，即通过杂交瘤技术产生单克隆抗体、通过基因工程表达和修饰抗体、第一阶段、第二阶段和第

5、三阶段、诱导方法是用过渡态类似物的半抗原免疫小鼠，制备单克隆抗体并筛选具有高催化活性的单克隆抗体。由于半抗原无免疫原性，需要将设计好的半抗原分子与载体蛋白(如白蛋白)偶联制成完整的抗原，然后免疫动物，按照单克隆抗体制备程序获得杂交瘤，分泌单克隆抗体，经筛选纯化后获得特异性抗体酶。制备方法：(1)过渡态类似物：的构建由于准确的过渡态难以确定或合成，用于制备抗体酶的半抗原是过渡态类似物，这是关键步骤。(2)抗原：的制备人工设计和构建的过渡类似物(半抗原)与载体蛋白化学连接形成完整的抗原，然后用于免疫动物。(3)利用单克隆抗体筛选技术制备抗体酶，该杂交瘤细胞能产生单个抗体，并能在细胞培养条件下快速繁

6、殖，并能制备大量单个抗体。(1)诱导法，提取脾细胞进行培养，用过渡类似物免疫小鼠，提取骨髓细胞进行培养，细胞融合培养，ELISA效价检测和筛选，杂交瘤细胞亚克隆，亚类鉴定，细胞株冷冻，腹水制备和纯化，制备工艺；(2)复制法，主要是根据抗体生产过程中抗原-抗体的互补性而设计的(如图)。首先，用已知的酶作为抗原免疫动物，用单克隆技术获得抗酶抗体。然后用抗体作为抗原免疫动物，再用单克隆技术筛选纯化后获得具有原始酶活性的抗体酶。由于抗原与抗原产生的抗体互补，酶活性位点的信息经过两次复制后被复制到抗体酶上，使得抗体酶活性中心的空间结构与原酶的形状完全一致，保证了对同一底物的特异性。为了将催化基团或辅因子

7、引入抗体的抗原结合位点，通常有两种方法：选择性化学修饰和基因工程定点突变。(3)抗体结合位点的修饰。化学修饰抗体酶可以通过化学修饰进行修饰。抗体酶结构修饰的关键是找到一种匹配方法，在抗体结合位点或其附近引入酶的催化基团或辅助基团。如果引入的催化基团和底物的结合位点正确定向并排列在适当的空间，可以产生高活性的抗体酶。为了提高抗体酶的催化能力，可以利用邻近效应、静电催化、菌株和官能团催化在抗体结合位点引入催化基团。基因工程定点突变随着基因工程技术的发展。利用基因工程技术制备新的抗体酶是一种很有前途的方法。对于产生的单克隆抗体，先分析抗体结合位点的氨基酸序列或相应的碱基序列，然后对抗体结合位点的氨基

8、酸对应的基因序列进行位点突变，改变抗体酶的催化效率。这就是基因工程产生抗体酶的原理。利用聚合酶链反应技术克隆了一套完整的免疫球蛋白可变区基因，建立了分别产生重链和轻链的噬菌体文库。然后，基因的轻链和重链通过每个载体中的不对称限制性位点随机结合。这些含有数百万个高水平表达的轻链和重链片段的文库在大肠杆菌中表达和组装，并且可以大量生产Fab片段。该文库在保留亲本单克隆抗体的识别和亲和特性的基础上，利用了免疫因子的多样性。这样，我们可以从数百万种可能性中选择抗体酶。(4)免疫反应因子基因，(4)抗体酶催化反应，酰胺键形成反应，脱羧反应，酯水解反应，氧化还原反应，分子重排反应，DielsAlder反应

9、，区域选择性催化反应和消除反应。舒尔茨用N-甲基卟啉诱导的抗体能催化平面卟啉的金属螯合反应。例如，如果使用原卟啉或亚卟啉作为底物，它不仅不能显示出催化活性，这表明金属螯合反应和光致反应包括光聚合和光解。这两种反应在植物中特别重要。脱氧核糖核酸的修复也涉及光诱导反应。Cochran研究了胸腺嘧啶二聚体的光解，发现天然光尤文化酶的活性中心是色氨酸，从而发现了相应的抗体酶IgG15F13B1，该抗体的转化数(t.n .)与光尤文化酶相似。配平研究了光聚合酶的抗体。虽然诱导法获得的抗体酶催化效率不高，但反应速度提高了2。五次。光致反应，5。抗体酶催化技术的应用，(1)在天然酶不能催化的有机合成反应中的

10、应用，如克莱森重排和第尔斯-阿尔德反应，Oxy-Cope重排是一种可逆的热重排反应，它改变了分子结构，如在分子中引入共轭基团或羟基以增加产物的稳定性，但迄今为止自然界中还没有酶能催化这种反应， 在3-对甲氧基苯基-4-羟基-1，5-己二烯(1)的重排反应产生6-对甲氧基苯基-5-烯-己醛(2)中，由作为半抗原的化合物3诱导的多克隆抗体可以催化该反应，使得在较高温度下发生的反应可以在室温下进行。 与普通化学反应相比，具有不利能量的反应抗体酶的一个重要方面是它能选择性地稳定具有不利能量的高能过渡态，因此它能催化不利的化学反应，如顺式消除、外(外)Diels-Alder反应等。一个例子是内吡喃衍生物

11、7的形成。根据鲍德温环化规则，环氧醇5分子内亲核取代的180过渡几何构型的主导产物应为呋喃衍生物6。Janda等人用8作为半抗原产生抗体酶，催化5产生6元环7而不是6元环6，违反了鲍德温法则(不利能量)。根据型乙酰酶的烯胺机理，通过反应免疫获得抗体酶38C2。位于底物结合位点疏水口袋中的活性赖氨酸残基、LYS和抗体酶38C2可催化羟醛缩合、逆羟醛缩合和逆迈克尔反应，并能接受多种底物，因此可作为前药的激活剂。Shabat等人设计了一种全新的前药释放系统，该系统可以通过顺序的反向羟醛缩合和反向Michael反应去除前药中的保护基团，释放活性药物。该策略已成功应用于喜树碱、阿霉素、依托泊苷等抗肿瘤药

12、物和胰岛素的前药设计(如图所示)。(2)在前药设计中的应用；(3)在药物康复领域中的应用药物滥用是困扰许多国家的难题，特别是在吸毒成瘾之后，很难放弃，并且没有发现抗体能直接拮抗可卡因成瘾。另一种方法是阻断可卡因、鸦片和受体的结合。Landry等人用可卡因作为半抗原水解了过渡类似物单磷酸单酯。产生的单克隆抗体能催化可卡因的分解，其催化活性与丁酰胆碱酯酶催化血液中的可卡因相似，水解的可卡因片段失去其刺激可卡因的功能。因此，人工抗体酶被动免疫可以阻断可卡因成瘾，达到解毒的目的。(4)在医学领域的应用目前正在开发一种称为抗体介导的前药疗法的技术，该技术成功地激活了前药，提高了肿瘤治疗的选择性，显示出良

13、好的应用前景。其原理是将催化前药转化为肿瘤细胞毒素的酶与肿瘤细胞特异性抗体偶联，通过与肿瘤抗体的结合，酶存在于肿瘤细胞表面。当前药扩散到肿瘤细胞表面或其附近时，抗体酶将快速水解前药并释放抗肿瘤药物。这大大增加了肿瘤细胞附近的局部药物浓度，增强了对肿瘤细胞的致死性，并降低了对正常细胞的杀伤作用。6.一种对甲状腺素，3，5，3，5-四碘甲状腺原氨酸，也称为甲状腺素(T4)脱碘进行催化的抗体酶。在人类和动物中，它在生长发育、基础代谢以及脑和器官形成中起着重要的调节作用，这主要是通过其降解产物3，5，3-三碘甲状腺原氨酸(t 3)与其受体之间的相互作用来实现的。生物体中的T3主要由脱碘酶催化的T4脱碘

14、作用产生，这种转化主要由含硒的碘甲状腺原氨酸脱碘酶同源家族完成。型碘甲状腺原氨酸脱碘酶(DI)起主要作用，而DI的缺乏会导致严重的甲状腺疾病。对型脱碘酶的酶学性质、催化机理、空间结构和生理功能进行了系统研究。证实它是一种分子量为27 ku的含硒酶，含有硒代半胱氨酸催化基团，可催化T4降解为T3和rT3。研究表明，如果硒代半胱氨酸突变成其他氨基酸，酶活性几乎完全丧失。基于脱碘酶的结构和初步催化机理，通过单克隆抗体技术和化学修饰制备了一种新型脱碘酶抗体酶，并对其动力学性质进行了研究。步骤1，抗原的制备和纯化以及半抗原结合能力的测定，抗甲状腺单克隆抗体细胞系的制备和纯化，抗体性质的测定，亚硒酸钠的制备，含硒催化抗体的制备以及硒含量、催化脱碘和T3含量的测定，步骤2，步骤4，步骤3，步骤5，步骤6和步骤7，实验方法和结果：1。含硒抗体酶Se-4C5的最大酶活为270molmin-1mg-1。2.含有天然脱碘酶的肾匀浆的Km(T4)比催化抗体高6倍以上，而催化抗体Se-4C5的Km(DTT)和Vm比含有脱碘酶的肾匀浆高3.6和8倍。二硫苏糖醇是硒-4C5的竞争性抑制剂。6.问题与展望：抗体酶是化学和生物研究成果在分子水平交叉渗透的产物，是抗体多样性与酶分子巨大催化能力相结合的新策略。尽管抗体酶的研究已经取得了很大的进展，但离实际应用还有很长的