口腔微生物学3牙菌斑.ppt

1、牙菌斑生物膜 (Dental Plaque Biofilm),口腔疾病研究国家重点实验室 口腔生物学教研室 李雨庆,一、牙菌斑的定义（掌握） 二、牙菌斑的分类（了解） 三、牙菌斑的基本结构（掌握） 四、牙菌斑的组成（了解） 五、牙菌斑的形成和发育（掌握） 六、牙菌斑的物质代谢（了解） 七、牙菌斑的致病性（了解）,主 要 内 容,牙菌斑（肉眼）,牙菌斑（LM）,牙菌斑细菌及EPS成分三维重建(CLSM),24h,48h,72h,玻片 树脂 玻璃离子,不同牙科材料表面口腔细菌黏附,FISH技术,一、定 义,1683年 发现牙面沉积物中有微小生物体（Van Leuwenhoek） 1890年 首次详

2、细论证了细菌、酸和龋病三者的关系（Willoughby D. Miller ） 1897年 首先提出牙菌斑的概念（James Leon Williams） 1937年 牙面上的微生物必须依赖于牙面特定的菌斑环境代谢产酸（Forsdick） 1963年 牙菌斑是附着在牙面上不易被漱口液清洗掉的软而粘的物质（Dawes）,早期对牙菌斑的认识,牙菌斑 (dental plaque),存在于牙面或牙周袋内的一个细菌生态环境，细菌在其中生长、发育和衰亡，并进行着复杂的物质代谢活动，在一定条件下，细菌及其代谢产物将会对牙齿和牙周组织产生破坏,James Leon Williams (April 18, 1

3、852 February 23, 1932) , American prosthodontist and pioneer dental histologist,各种细菌嵌于来自其自身和/或外界环境的胞外基质内，而在固相界面上结成的有着三维立体结构的微生态环境，牙菌斑就是一种经典的生物膜,JOHN WILLIAM COSTERTON (July 21st, 1934 -May 12th, 2012) “the father of biofilm”,生物膜（biofilm）,牙菌斑生物膜示意图,牙菌斑生物膜是牙面上或牙周袋内的多种菌丛构成的生态系。细菌在内生长、发育和衰亡。其复杂的结构使它能包涵对

4、氧不同敏感性的细菌，这些细菌嵌入在由多糖、蛋白质和矿物质组成的基质中。细菌在其中的代谢活动，影响着细菌与宿主之间或细菌菌属之间的动态平衡,牙菌斑生物膜,节制细菌代谢活性和保护菌丛抵抗口腔苛刻环境，使细菌在不适合的条件中仍能存留。 膜内高水平的巯基能中和氧基，保护菌细胞免受氧化损伤。 膜内的多聚物基质起约束网络作用，摄取和收藏食物，控制基质成分的移动速度。 浓缩从环境中来的营养物质和其它元素，保留一些细胞内遗漏出来的溶解物质（如eDNA）。 细菌耐药性,生物膜的作用,二、分 类,龈缘为界: 龈上菌斑 龈下菌斑：附着菌斑，非附着菌斑,（一）根据所在部位分类,1龈上菌斑（supragingival

5、plaque） 位于牙颈部龈缘以上牙面上的菌斑。包括窝沟菌斑、光滑面菌斑、邻面菌斑、颈缘菌斑。这种菌斑的结构比较完整，主要细菌是革兰阳性球菌、杆菌。随着菌斑成熟，革兰阴性球菌、杆菌和丝状菌的数量增多。,牙龈萎缩,2龈下菌斑(subgingival plaque) 位于龈缘以下，分布在龈沟或牙周袋内，分为附着龈下菌斑和非附着龈下菌斑。,附着龈下菌斑,非附着龈下菌斑,非附着龈下菌斑 位于附着龈下菌斑的表面，为结构较松散的菌群，直接与龈沟上皮和袋内上皮接触，主要为格兰阴性厌氧菌，还包括许多能动菌和螺旋体, 附着龈下菌斑 由龈上菌斑延伸到牙周袋内，附着于牙根面，其结构、成分与龈上菌斑相似，细菌种类增多

6、，主要为格兰阳性球菌及杆菌、丝状菌，还可见少量格兰阴性短杆菌和螺旋体,龈上、龈下菌斑的主要特征 特征菌 斑 龈上菌斑 龈下菌斑 生长环境 有氧、兼性厌氧 兼性、专性厌氧 优势菌 G+需氧菌和兼性菌 G-厌氧菌和能动菌 唾液清洁 + - 食物摩擦 + - 代谢底物 糖 类 血清蛋白、氨基酸、糖 宿主防卫机制 唾液Ig 血清Ig,1. 致龋菌斑 与龋病发生有关的牙菌斑，多位于牙齿的咬合面、光滑面、邻面和颈缘。主要的致病产物是各种有机酸，如乳酸。,（二）根据致病作用分类,（1）利用蔗糖的速度快，乳酸产生速度快； （2）产生多糖的速度快，接触蔗糖15分钟内 20%以上转化为细胞内多糖； （3）变链球菌

7、的数量多，而非致龋性菌斑中 血链球菌的数量多； （4）与产碱代谢相关酶（尿素酶、精氨酸脱亚胺酶）的活性较非致龋菌斑低,致龋性菌斑的主要生物学特征:,2. 致牙周病菌斑 指位于龈缘和牙周袋内，与牙周疾病发生有关的菌斑。此类菌斑因所处的生态环境不同，含更多的专性厌氧菌，如螺旋体。主要致病产物是破坏性酶和毒素,专性厌氧,产黑色素,牙周复合体,Socransky et. al. 1998. J Clin Periodontol,Most commonly found in patients with periodontal disease,Found in both healthy patients

8、and in periodontal lesions,三、基本结构,牙菌斑的基本结构（LM）,牙菌斑紧靠牙面的获得性膜，无细菌的均质性结构，HE染色呈红色，厚度一般在1-10 m,（一）基底层,Enamel crystals,Pellicle lipid/protein layers (1-10 m),牙菌斑的主体部分，由粘附在获得性膜上的丝状菌彼此平行排列，且与牙面垂直构成，丝状菌之间有大量球菌、杆菌分布或互相粘附。有时平行排列的丝状菌迫使球菌排成链状，好似栅栏，称为栅栏状结构 (palisade structure)。栅栏状结构是牙菌斑的基本结构，也为牙菌斑深层的细菌获得营养和氧气提供通道

9、。,（二）中间层,栅栏状结构（LM）,菌斑的表层结构比较疏松，细菌组成复杂，变动较大，球菌和丝状菌互相交织，短杆菌穿插其间。“谷穗状”结构(corncob)，以丝状菌为中心，周围有许多革兰氏阳性球菌粘附在其表面。以“谷穗”为中心，周围有长杆菌粘附的“瓶刷样”结构(bristle brush)。,（三）表层,谷穗状结构（SEM）,四、组 成,1. 细菌的种类繁多。 2. 不同年龄阶段微生物种类差异较大，组成呈动态变化。 3. 致病性菌斑与非致病性菌斑的细菌种类差异不大，功能差异较大。,（一）微生物组成的特点,A spectral fluorescence image of 15 differen

10、t species of human oral microbes grown in the laboratory and labeled with taxon specific probes in a CLASI-FISH experiment. (Credit: Alex Valm),Neighbor-joining tree for human oral taxa in the phylum Tenericutes and the classes Bacilli and Erysipelotrichia of the phylum Firmicutes,The Human Oral Mic

11、robiome. JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Oct. 2010, p. 50025017,世界历史分期,旧石器时代：通过狩猎和采集维持生活，制造简单石器,中石器时代：开始家畜驯养，使用打制石器,新石器时代：产生了农业和畜牧业，磨光石器流行,青铜时代：制造使用青铜器,铁器时代：制造使用铁器,中世纪,近 代,现 代,石 器 时 代,古代,封建社会,碳水化合物大量摄入,工业革命/ 食物更为精细/糖,LBK/Bell Beaker,Jewbury/St. Helen-on the Wallis/Raunds Furnells,采集自正常人群相同部位的菌斑微生物组成种类差异较大，

12、但代谢功能相似。,Nature. 2012 Jun 13;486(7402):207-14.,牙龈卟啉单胞菌的检出率明显升高 开始有变异链球菌检出,古代人口腔微生物的多样性保持相对稳定（p 0.05）,现代人口腔微生物的多样性明显减低,致龋性与非致龋性菌斑的细菌构成 致龋性菌斑 细菌数量 非致龋性菌斑 变链球菌 多 粘性放线 血链球菌 血链球菌 粘性放线 变链球菌 乳酸杆菌 少 乳酸杆菌,致牙周病菌斑与非致牙周病菌斑的细菌构成,（二）化学组成,1. 水 占菌斑体积的30%-50%，重量的80%， 其中50%在菌细胞内，30%在菌斑基质 中。基质中的水大约25%呈游离状态， 剩余部分与蛋白质结合

13、呈结合态。,2. 蛋白质和氨基酸 蛋白质占牙菌斑干重40%-50%，主要来自宿主唾液和龈沟液，少量来自细菌。细菌蛋白则包括细菌本身以及细菌产生的酶，以及免疫球蛋白和少量的氨基酸。,3. 糖 占牙菌斑千重的13%-18%，来源于食物和细菌，包括低分子可溶性糖，如单糖、双糖、低聚糖和多糖。,细胞内多糖（Intracellular Polysaccharides, IPS） 存在于细菌体内，作为一种储能形式，当外源性糖提供不足时，为菌斑细菌的新陈代谢提供能源。主要为糖原和支链淀粉。,细胞外多糖（extracellular polysaccharides, EPS） 存在于细菌体外，主要有葡聚糖、果聚

14、糖和少量的杂聚糖。细胞外多糖分为水溶性和水不容性两种。,不同底物对生物膜EPS的影响,PLoS Pathog 8(4): e1002623.,生物膜形成过程中细菌细胞与EPS组成的动态变化,PLoS Pathog 8(4): e1002623.,4. 脂质 占菌斑干重10%-14%，多位于菌斑基质中，主要有磷脂、糖脂和中性脂。菌斑中的脂质对菌斑的矿化和细菌对牙面的粘附有一定影响。,5. 无机物 占菌斑干重的5%-10%，主要有钙、磷、镁、钠、钾及少量的铜、铁等。无机物一部分位于菌细胞内，另一部分分布于菌斑液中。菌斑具有集中钙、磷、氟的能力，菌斑中钙、磷、氟含量明显高于唾液。,五、形成和发育,T

15、he Biofilm Life Cycle,1、获得性膜的形成 2、细菌的黏附和集聚 3、生物膜的成熟 4、生物膜的分散,（一）获得性膜的形成,唾液糖蛋白选择性吸附在牙齿表面所形成。,1. 形成机制,获得性膜的形成机制,Enamel crystals,Pellicle lipid/protein layers (1-10 m),2. 组成 糖蛋白、酸性富脯蛋白、富酪蛋白、白蛋白、氨基酸、脂类物质、碳水化合物、一些酶和免疫球蛋白等。,3. 生物学作用 （1）确定首先定植在牙面的细菌种类 （2）细菌代谢的营养来源 （3）保护釉质表面 （4）牙面上的离子保护库,1. 细菌的黏附：细菌在牙面上的附着

16、（1）钙桥作用 （2）氢键作用 （3）疏水作用 （4）受体粘结素作用,（二）细菌的黏附和集聚,钙桥作用,氢键作用,疏水作用,疏水基团,疏水蛋白,黏附素与受体,黏附素（Adhesin）：细菌表面的蛋白样成分，以立体化学的特异方式结合到组织表面的受体上 受体（Receptor）：组织表面与黏附素结合的物质,黏附素与受体结合模式,主要口腔细菌的黏附素和受体,2. 集聚（aggregation） 一种细菌黏附于另一种细菌的表面称之为集聚,（1）细菌间通过自身合成的细胞外聚 合物而相互粘附 （2）不同种细菌直接粘附在一起 （3）细菌与宿主的聚合物相互作用， 使细菌容易聚集在菌斑中,（三）牙菌斑生物膜的成

17、熟,牙菌斑的生长周期 成熟牙菌斑的形态结构特征,牙菌斑的发育,牙菌斑（LM）,栅栏状结构（LM）,谷穗状结构（SEM）,谷穗状结构（FISH） 组合标签和光谱成像,（四）生物膜的分散,生物膜的分散,Biofilms can propagate through detachment of small or large clumps of cells, or by a type of seeding dispersal that releases individual cells. Either type of detachment allows bacteria to attach to a s

18、urface or to a biofilm downstream of the original community,Nature Reviews Microbiology. 2012; 10(1): 39-50,生物膜的分散,分散形式： 主动分散（active dispersal）：在外来刺激下，如营养变化、代谢产物堆积、温度变化、噬菌体攻击、酰基高丝氨酸内酯(AHL)、右旋氨基酸等作用下进行；主动分散的细菌具有独特的生物学特性，如鞭毛相关编码基因被激活，细菌运动能力显著增强； 被动分散（passive dispersal）：如唾液冲刷、食物咀嚼等，菌细胞无生物学特性改变,环二鸟苷酸(c-

19、di-GMP)是生物膜分散的核心分子,Nature Reviews Microbiology. 2012; 10(1): 39-50,Essential Steps of Biofilm Life Cycle,六、物质代谢,1. 分解代谢 产生多种有机酸，如乳酸、甲酸、乙酸、丙酸、丁酸和戊酸。,（一）糖代谢,2. 合成代谢 （1）细胞内多糖：糖原、支链淀粉 （2）细胞外多糖： Soluble ECP: -1,6 糖苷键 葡聚糖(右旋糖苷) -2,6糖苷键 果聚糖(左旋糖苷) Insoluble ECP: -1,3糖苷键 葡聚糖(glucan) 变聚糖 -2,1糖苷键 果聚糖(fructan),

20、（二）碱性物质代谢 当牙菌斑处于饥饿状态时，菌斑内尿素酶能够将唾液中尿素分解为氨，二氧化碳，使牙菌斑pH上升。同时，菌斑中细菌可以利用氨基酸，使菌斑pH下降/上升。 目前认为，细菌的产碱代谢是龋病发生的保护因素，口腔主要的产碱细菌包括格式链球菌、唾液链球菌、血链球菌、内氏放线菌等。,尿素酶(urease)及精氨酸脱亚胺酶(arginine deiminase)是口腔细菌最主要的两条产碱代谢通路，对维持口腔微生态平衡具有重要意义,（三）无机物代谢 在酸性环境中，磷酸盐会变为易溶解的相，钙释放到基质中。当菌斑pH下降到临界时(低于pH5.5)，羟磷灰石就会转化为钙/磷比值低的盐： Ca10(PO4

21、)3(OH)2+8H+6CaHPO4+2H2o+4Ca2+,在酸性条件下，磷酸氢钙(CaHPO4)进一步分解： CaHPO4+H+Ca2+H2P4O 当牙菌斑pH上升，这时牙菌斑的钙/磷比值又将增高。 10CaHPO4+8OH-Ca10(PO4)3(OH)2+4HPO42-+6H2O,七、致病性,牙菌斑是造成人类两大口腔疾病-龋病、牙周病的始动因子。,（一）牙菌斑与龋病 1. 龋病是发生于牙齿硬组织的慢性细菌 性疾病，表现为牙体硬组织色、形、 质的改变。 2. 致病性 （1）产酸性 （2）合成细胞外多糖对牙面的粘附能力 （3）耐酸性,Stephan曲线,Stephan 曲线： 进食后菌斑原位p

22、H变化过程 甜食频率 vs 甜食的量 再矿化vs龋病形成所需时间,细胞内、外多糖的种类和作用 1.种类:葡聚糖、果聚糖和少量的杂聚糖以及糖原和支链淀粉 2.作用: 作为菌细胞壁成分或位于胞内。 作为菌斑基质的主要成分，构成菌斑的基本骨架。 作为细菌代谢所需的能源。 促进细菌对牙面的粘附和细菌间的聚集。,糖的种类与pH,（二）牙菌斑与牙周病 牙周病是发生在牙的支持组织的疾病，主要临床症状是牙龈出血、溢脓、牙齿松动、牙槽骨吸收以及牙周袋形成，该病是造成成年人失牙的主要原因之一。,1. 牙菌斑代谢产物的直接破坏作用 （1）酶 （2）毒素 （3）其他产物,2. 牙菌斑引起的免疫病理损害 免疫反应的类型是以细胞免疫为主，体液免疫参与，补体系统加入反应两个方面，在牙周炎症的不同阶段，各有特点。,小 结,牙菌斑,定 义,基本结构,组 成,形成和发育,代 谢,致病性,