PCR技术的原理、操作及应用.ppt

1、聚合酶链反应技术的原理、操作和应用，黄逸炜，湖南省疾病预防控制中心微生物实验室，什么是聚合酶链反应，聚合酶链反应：聚合酶链式反应，即聚合酶链式反应是80年代中期发展起来的一种体外核酸扩增技术，以及聚合酶链式反应技术的发展历史。关于聚合酶链式反应的文章首先由美国科学家凯利穆利斯等人在科学杂志上发表，报道了耐热DNA聚合酶Taq(一种从生活在温泉中的水生嗜热杆菌中提取的耐热DNA聚合酶)的发现，标志着分子时代的到来。12月，科学杂志将它所用的聚合酶命名为第一个“年度分子”。1993年，凯利穆利斯因发明聚合酶链反应获得诺贝尔化学奖。聚合酶链反应技术原理1。遗传物质：核染色体DNA(由脱氧核糖核酸、磷

2、酸链和碱基组成)的碱基(A、T、C、G)排列成双链螺旋，碱基序列的长度和排列顺序决定了生物的多样性。例如，人类体细胞中有31亿个碱基对。根据上述0.1%的差异，人与人之间有300万个碱基对的差异。聚合酶链反应的基本工作原理是用待扩增的脱氧核糖核酸分子作为模板，用一对与模板互补的寡核苷酸片段作为引物。在脱氧核糖核酸聚合酶的作用下，它按照半保守复制的机制沿着模板链延伸，直到新的脱氧核糖核酸合成完成。聚合酶链反应的基本组分包括七个基本组分：模板脱氧核糖核酸、特异性引物、热稳定脱氧核糖核酸聚合酶、脱氧核苷三磷酸、二价阳离子、缓冲溶液和一价阳离子。基本的反应步骤是变性-退火-延伸。最后，脱氧核糖核酸用电

3、子束等染料染色，然后用紫外线灯检测。聚合酶链反应技术原理3、重复13个步骤和2535轮，靶基因片段扩增100多万次，脱氧核糖核酸双螺旋、脱氧核糖核酸单链和引物复性，脱氧核糖核酸变性形成两条单链，亚链延伸的脱氧核糖核酸加倍。与聚合酶链反应相比，逆转录聚合酶链反应的原理在初始阶段增加了步骤：核糖核酸合成，这是一个从单链到双链的过程。实时定量聚合酶链反应原理1。实时定量聚合酶链反应是指在聚合酶链反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个聚合酶链反应过程，最后用标准曲线定量分析未知模板的方法。常用荧光定量聚合酶链反应试剂：SYBR Green I Taqman水解探针，实时荧光定量聚合酶链

4、反应原理2。基线是指在聚合酶链反应扩增反应的最初几个循环中，荧光信号变化很小，并接近一条直线，这条直线就是基线。光阈值的设定一般以前15轮聚合酶链反应的荧光信号作为荧光背景信号，荧光阈值为3-15轮聚合酶链反应荧光信号标准差的10倍，荧光阈值设定在聚合酶链反应扩增的指数周期内。循环阈值表示当荧光信号达到设定的阈值时，每个聚合酶链反应管经历的循环次数。研究表明，每个模板的CT值与模板初始拷贝数的对数呈线性关系。初始拷贝数越多，联系类型值越小，反之亦然。标准曲线可以通过使用具有已知初始拷贝数的标准来制作，其中横坐标表示初始拷贝数的对数，纵坐标表示CT值。因此，只要获得未知样品的CT值，就可以从标准

5、曲线计算出样品的初始拷贝数。实时荧光定量聚合酶链反应原理3。循环数固定后，荧光信号与模板数的比例越大，荧光达到阈值所需的循环数(Ct值)就越少。初始模板的对数浓度与CT呈线性关系，根据样品的Ct值可以计算出样品中模板的含量。聚合酶链反应技术的优势，优势：是具体的，敏感的，快速，简单，易于自动化等。由于聚合酶链反应技术的局限性，为了构建特异性引物和选择性扩增特异性的脱氧核糖核酸序列，操作时避免使用气雾剂，特别注意阳性样品的处理，使用一次性耗材，戴手套并经常更换，在最后一步总是添加核酸，并单独使用液体。引物设计合理，Taq酶扩增的错误率高，镁离子浓度约为1/100碱基对/20次循环对反应效率的影响

6、，如仪器稳定性、升温和降温速率、管道密封性等。逆转录聚合酶链反应注重防止核糖核酸降解，以及聚合酶链反应技术的操作1 .以逆转录聚合酶链反应和实时逆转录聚合酶链反应检测流感病毒为例，说明聚合酶链反应技术的操作步骤。主要仪器包括聚合酶链反应仪、实时聚合酶链反应仪、微量移液器、高速冷冻离心机、电泳仪和电泳槽、凝胶电泳观察仪或成像系统、生物安全柜等。聚合酶链反应技术的操作2，1。病毒核酸的核糖核酸提取。逆转录聚合酶链反应或实时逆转录聚合酶链反应3。紫外灯检测或直接在计算机上读取结果，流感病毒核酸提取1，检测材料QIAGEN公司的Rneasy微型试剂盒(或QIAGEN公司的QIAmp病毒核糖核酸微型试剂

7、盒，具有类似的操作)-巯基乙醇70%乙醇无菌和脱氧核糖核酸，Rnase 1.5ml毫升离心管10l，20l，200l，1000l取样器和13K可调枪头微型冷冻离心机，200l待检测流感病毒，流感病毒核酸提取2，1。取200微升采样溶液(鼻拭子、咽拭子、胸腔积液等)。)或病毒培养物(鸡胚尿囊液或细胞培养液)，并将其放入1.5毫升Eppendorf试管中。2.依次加入350微升rlt溶液、3.5微升巯基乙醇和550微升70%乙醇，混合均匀。3.将Rneasy微型旋转柱放在干净的2ml收集管上。从步骤2中吸出600微升混合溶液并将其加入柱中，以12，000转/分的速度离心15秒钟，将离心液4丢弃在收

8、集管中，将柱放回收集管中，将步骤2中剩余的混合溶液吸到柱中，以12，000转/分的速度离心15秒钟，丢弃离心液5，并以12，000转/分的速度将700微升洗涤缓冲液RW1溶液加入柱中。离心15秒6。取一个干净的2ml收集管，将离心后的色谱柱移到新的收集管中，以12000转/分的速度向色谱柱中加入500微升洗涤缓冲液，离心15秒7。丢弃收集管中的离心溶液，然后以13，000-14，000转/分的速度向色谱柱中加入500微升洗涤缓冲液。离心2分钟。8.将色谱柱移至一个干净的1.5毫升eppendrof试管中，加入20-50微升不含RNAse的水，在室温下放置1-3分钟，转速为9，12，000转/分

9、，离心1分钟，收集离心液作为提取的病毒Rna。立即进行试验，或将套件保存在-20以下，作为QIAGEN公司的RNAYS迷你套件(目录#74104)。注意：在试剂盒中使用视网膜色素上皮溶液之前，应加入44毫升无水乙醇，使最终体积达到55毫升。用于扩增H5亚型禽流感病毒的引物序列为：H5-1: 5-gcc att CCA CAA cat ACA CCC-3，H5-: 5-CTC CCC TGC TCA TTG CTA TG-3，逆转录聚合酶链反应2，1，分别标记0.2毫升在每个试管中加入以下内容：5ul QIAGEN OneStep RT-PCR缓冲液，5 1ul 10mm dntps1ul酶混合

10、物0.13 ul RNase抑制剂(40u/ul) 14.3 ul无RNase水2，加入1 ul引物和5ul未知RNA或5 ul阳性对照或无Rnase水作为阴性对照。一步逆转录聚合酶链反应条件如下：50分钟30分钟(逆转录：核糖核酸)，95分钟15分钟(逆转录酶失活等)。94变性30秒55退火30秒72延伸30秒回到步骤3，34循环72 2分钟，逆转录聚合酶链反应扩增产物检测1，凝胶电泳缓冲液配方10TBE缓冲液(每升):tris 107.8克硼酸55.0克乙二胺四乙酸(Na2) 8.2克10 tae缓冲液(每升):Tris48.4g克冰醋酸11.42克0.5摩尔/升乙二胺四乙酸20毫升1.5

11、%琼脂糖凝胶用电泳缓冲液制备，和88在100伏下电泳30分钟，紫外线观察和照片记录。逆转录聚合酶链反应扩增产物检测2、逆转录聚合酶链反应扩增产物检测及结果判断、实时逆转录聚合酶链反应操作1、病毒核酸核糖核酸提取：与逆转录聚合酶链反应相同实时逆转录聚合酶链反应：以皮吉公司禽流感检测试剂盒为例，根据试剂盒操作说明，25l反应体系：逆转录聚合酶链反应溶液15l、Taq酶0.25l、N/4逆转录酶(N为聚合酶链反应管数)、10L待测核糖核酸、添加核糖核酸后400g反应条件为：4230分钟；923分钟；9210秒、4530秒和721分钟的5次循环；92 10秒，60 30秒40 40周期，60点钟设置收

12、集荧光。实时逆转录聚合酶链反应操作2，设置结果分析条件，读取检测结果。阈值设定原则是阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，结果显示为阴性；或者可以根据仪器的噪音进行调整。循环阈值表示当荧光信号达到设定的阈值时，每个聚合酶链反应管经历的循环次数。研究表明，每个模板的CT值与模板初始拷贝数的对数呈线性关系。初始拷贝数越多，联系类型值越小，反之亦然。标准曲线可以通过使用具有已知初始拷贝数的标准来制作，其中横坐标表示初始拷贝数的对数，纵坐标表示CT值。因此，只要获得未知样品的CT值，就可以从标准曲线计算出样品的初始拷贝数。基线是指在聚合酶链反应扩增反应的最初几个循环中，荧光信号变化很小，并接近

13、一条直线，这条直线就是基线。光阈值的设定一般以前15轮聚合酶链反应的荧光信号作为荧光背景信号，荧光阈值为3-15轮聚合酶链反应荧光信号标准差的10倍，荧光阈值设定在聚合酶链反应扩增的指数周期内。实时聚合酶链反应操作3，结果判断1，质量控制标准1.1，阴性对照的检测结果为阴性。1.2阳性对照的Ct值应小于或等于28.0。否则，这个实验将被视为无效。2.结果无CT值的2.1例为阴性。2.2值为30.0的样本为阳性。2.3Ct值大于30.0的样品建议重做。如果重做结果中没有值，它将为负，否则为正。应用聚合酶链反应技术、法医个体鉴定和亲子鉴定等基因克隆、测序和表达、遗传病检测、肿瘤诊断、病原体检测、基

14、因克隆和表达、DNA指纹技术1。1984年，英国遗传学家亚历克杰弗里斯在研究肌红蛋白的脱氧核糖核酸序列时，意外发现一小段脱氧核糖核酸在无功能的脱氧核糖核酸(不产生蛋白质的脱氧核糖核酸)上重复。这个包含约15个碱基的DNA片段在不同个体间重复的频率和位置有明显的差异。杰弗里斯首先研究了自己的基因，并验证了这项技术。如果我们有血缘关系，这些差异就会大大减少。杰弗里斯将这项技术命名为DNA指纹技术。DNA指纹技术2，采集血样(毛发、精液、口腔粘膜细胞)，分离DNA，通过聚合酶链反应扩增所选DNA片段，比较它们，并进行统计分析，我们可以得到它是否是凶手或是否与血液有关。分子诊断学以分子生物学理论为基础

15、，运用分子生物学的技术和方法，研究人类内源性或外源性生物大分子和大分子系统的存在、结构或表达调控的变化，为疾病的预防、预测、诊断、治疗和预后提供信息和决策依据。在分子诊断学的发展阶段，分子诊断学经历了三个阶段：(1)通过DNA分子杂交对遗传病进行遗传诊断；(2)基于聚合酶链反应技术的脱氧核糖核酸诊断，特别是定量聚合酶链反应和实时聚合酶链反应的应用，不仅可以检测宿主体内存在的各种脱氧核糖核酸和核糖核酸病原体的载量，还可以检测多基因遗传病细胞中的基因表达。(3)以生物芯片技术为代表的高通量密集检测技术分子诊断的发展方向：(1)分子诊断的内容已经从传统的脱氧核糖核酸诊断发展到对核酸及其表达产物(基因和蛋白质)的综合诊断；(2)分子诊断策略已经从分子杂交、聚合酶链反应等单一技术的诊断发展到多种技术有机结