液相色谱仪器.ppt

1、液相色谱基础知识,（一）色谱起源,色谱知识,色谱法(Chromatography)：利用组分在两相 间分配系数不同而进行分离的技术 流动相：携带样品流过整个系统的流体 固定相：静止不动的一相,液相色谱基础知识,液相色谱：以液体作为流动相的色谱分离方法 适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分析,液相色谱基础知识,液相色谱基础知识,色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。,液相色谱流程图

2、,输液泵,进样器,色谱柱,柱温箱,检测器,贮液瓶 （流动相）,数据处理,计算机控制系统,岛津LC2010高效液相色谱仪,岛津LC2010高效液相色谱仪,一. 贮液瓶(流动相),流动相的作用: 1.携带样品 2.分离样品,采用 “HPLC” 级溶剂 避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂 对试样有适宜的溶解度 溶剂粘度要小 与检测器相匹配,流动相的选择应注意,溶 剂 等 级,水的等级 纯化水 蒸馏水 去离子水,波长 (nm),纯化水,去离子水,因为不纯物的存在，去离子水的吸光率较高,纯化水中去除了无机和有机的污染物,吸光率,溶 剂 等 级,溶剂的等级 HPLC级 优级纯 分析纯,都经过蒸馏和

3、0.45u的过滤(除纤维毛,未溶解的机械颗粒,优级纯的纯度比分析纯大,但里面含有防腐剂和抗氧化剂,HPLC级经过0.2u的过滤,且除去有紫外吸收的杂质,微量分析、梯度洗脱,流动相的前处理,1. 过滤：0.45um或更小孔径滤膜 目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其在使用无机盐配制的缓冲液时 过滤膜种类: 1.水系过滤膜 2.有机系过滤膜 3.混合系,流动相的前处理,2.脱气(用超声波) 目的：除去流动相中因溶解或混合而产生的气泡 气泡产生原因：温度上升 、 压力下降 、 溶剂混合 3.贮存： 应贮存于玻璃容器中。不能贮存在塑料容器中。 因许多有机溶剂如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增

4、塑剂，导致溶剂受污染。,液相色谱流程图,输液泵,进样器,色谱柱,柱温箱,检测器,贮液瓶 （流动相）,数据处理,计算机控制系统,二.输液泵,作用:高压输送流动相. 种类：恒压泵 恒流泵 恒流泵按结构又可分为： 1.螺旋注射泵 2.柱塞往复泵 3.隔膜往复泵,输液泵柱塞往复泵,泵的维护,1.防止固体微粒进入泵体。(流动相严格过滤) 2.防腐蚀.(流动相不应含有任何腐蚀性物质) 3.防空泵运转.(泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，否则空泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环，最终产生漏液) 4.防压力过高.(输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变形，产生漏液。) 5.防气泡

5、.流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性，如果有大量气泡，泵就无法正常工作。,液相色谱流程图,输液泵,进样器,色谱柱,柱温箱,检测器,贮液瓶 （流动相）,数据处理,计算机控制系统,三.进样器,自动进样器 手动进样器 自动进样的特点： 1、超高的进样精度 2、超快的进样速度 3、可以进行批进样,液相色谱流程图,输液泵,进样器,色谱柱,柱温箱,检测器,贮液瓶 （流动相）,数据处理,计算机控制系统,四.色谱柱,作用:分离样品 分离原理: 1.液固色谱法 2.液液色谱法 (正相和反相) 3.离子交换色谱法 4.离子对色谱法 5.排阻色谱法,四.色谱柱,填料: 多孔硅胶以及以硅胶为基质的

6、键合相、氧化铝、有机聚合物微球（包括离子交换树脂）、多孔碳等 填料粒度: 一般为3,5,7,10m 内径: 2-5mm（常用4.6mm，国内有4mm和5mm） 柱长: 10-30cm,四.色谱柱,柱的发展方向： 更短,柱长3-10cm 填料颗粒更小,粒径2-3m,色谱柱的使用注意点,1）避免柱压过高（根据不同的柱子要求不同） 2）柱温在40左右,一般不超过50 3）一般ODS柱流动相PH使用范围为27.5 4) 流动相有机溶剂比例过低, 柱效下降快 5）避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。 6）应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱，不应直接从有机溶剂改变为全部是水，反之亦然。,色谱柱的使用

7、注意点,7）样品进样前必须经过微孔膜过滤 8）经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。如果用缓冲溶液作为流动相，分析结束时必须先用纯水冲洗10分钟，再用甲醇-水冲洗，绝不能让缓冲溶夜留在柱子中过夜。 9）使用保护柱可延长柱子寿命。保护柱应经常更换。,柱温箱,柱温控制的优点：,1、控制温度，保证分析结果重现性 2、升高温度，降低了流动相的黏度，降低柱压，保证色谱系统的稳定性。,液相色谱流程图,输液泵,进样器,色谱柱,柱温箱,检测器,贮液瓶 （流动相）,数据处理,计算机控制系统,五.检测器,检测器是HPLC仪的三大关键部件之一。其作用是把洗脱液中组分定量转变为电信号。 HPLC的检测器要求：

8、 灵敏度高 噪音低（对温度、流量等外界变化不敏感） 线性范围宽 重复性好 适用范围广,紫外可见检测器（UV/VIS） 二极管阵列检测器（PDA） 示差检测器（RID） 电导检测器（CDD） 荧光检测器（RF） 电化学检测器（L-ECD） 质谱检测器（MS） 蒸发光散射检测器（ELSD）,常用检测器,紫外可见检测器,原理：基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收 优点：1）对温度和流速变化不敏感 2）可用于梯度分析 缺点：仅适用于测定有紫外吸收的物质,紫外可见检测器,紫外可见检测器,示差折光检测器,原理：连续测定流通池中溶液折射率变化以测定 试样各组分浓度。 优点：通用型检测器 缺点：1）对温

9、度和压力变化敏感 2）不能用于梯度分析,原理：基于被分析组分发射的荧光强度进行检测 优点： 1）灵敏度极高，是最灵敏的检测器之一 2）选择性好 3）对温度和流速不敏感，可用于梯度洗脱 缺点：仅适用于测定可产生荧光的物质,荧光检测器,液相色谱流程图,输液泵,进样器,色谱柱,柱温箱,检测器,溶剂,数据处理,计算机控制系统,六.数据处理和计算机控制系统,计算机控制系统的作用： 采集信号、分析数据； 控制色谱仪,基本概念和术语,1、色谱图(chromatogram)样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线。 2、基线(base line)经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流

10、出曲线。一般应平行于时间轴。 3、漂移(drift)基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。,基本概念和术语,4、色谱峰(peak)组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分 5、峰面积(peak area，A)峰与峰底所包围的面积 6、保留时间(retention time，tR)从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。,数据处理,1.定性：保留时间 2.定量方法： 内标法 外标法 面积归一法,糖的色谱图,Analytical Conditions Column : Shim-

11、pack CLC-NH2 Mobile phase : Acetonitrile / water = 7 / 3 Flow rate : 1.0 mL/min Temperature : Ambient Peaks 1. 甘油 2. 木糖 3. 果糖 4. 葡萄糖 5. 蔗糖 6. 甘露糖 7. 乳糖,数据处理,标准曲线的制作: 曲线点数：一点、两点及多点 曲线计算：线性范围、线性回归、折线、 二次曲线、三次曲线,外标法,公式：,优点： 1）不需所有峰都流出或被检测到 2）只对所测组分作校正 缺点： 1）进样量必须准确 2）仪器必须有良好的稳定性,Ai,Ci,Ci=FiAi,面积归一化法,公式

12、：,优点： 1）无需做校正，简便，快速 2）进样量不严格要求,缺点： 1）所有组分都流出且被检测到 2）所有组分的检测灵敏度都相同,内标法,公式：,优点： 1）进样量不严格要求 2）只对所测组分作校正 3）减少前处理影响 缺点： 1）必须在样品中加一内标组分 2）操作较为繁琐 3）选择内标物困难,Ai/Ais,Ci/Cis,液相色谱流程图,输液泵,进样器,色谱柱,柱温箱,检测器,溶剂,数据处理,计算机控制系统,维生素B族含量的测定,一、色谱条件： 检测器：紫外检测器 色谱柱：ODS 150mm4.6mm 粒度5.0m 流动相：甲醇-已烷磺酸钠溶液 30:70 波长：280nm 流速：0.8ml/min 柱温: 30,维生素B族含量的测定,二.所需主要仪器、试剂和耗材 1.仪器：岛津LC2010AH液相色谱仪、真空泵、超声波清洗机、抽滤装置、离心机等 2.试剂：甲醇（色谱级）、超纯水、己烷磺酸钠、二乙胺、磷酸、维生素B1及B6标准品 3.耗材： 0.45um有机系微孔滤膜、无机系针孔滤膜,维生素B族含量的测定,三、操作步骤： 1.流动相前处理：脱气 过滤 2.打开液相色谱仪及计算机，打开液相色谱仪控制软件 3.设定所需的色谱条件，并下载到色谱仪，运行，等待基线平衡（一般需要30min以上）,维生素B族含量的测定,4.样品前处理：