(上课)分解尿素细菌、分解纤维素微生物分离

1、一、课题背景、一、尿素的利用、尿素是重要的农业氮肥。 尿素不会直接被农作物吸收。 土壤中的细菌将尿素分解为氨后用于植物。 2 .细菌能够利用尿素的理由，土壤中的细菌能够分解尿素是因为能够合成脲酶，课题2土壤中的能够分解尿素的细菌的分离和修正数，3 .课题目的从土壤中分离能够分解尿素的细菌，修正每克土壤样品中含有多少细菌的原因：热泉温度70800C DNA聚合酶链反应是体外大量复制(PCR )少量DNA的技术，要求该技术使用耐高温(930C )的DNA聚合酶。 筛选菌株，分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等方法：抑制多种微生物促进生长的菌株的生长结果：培养一定时间后

2、，该菌数上升，采用平板稀释等方法纯化培养分离。 2、实验室微生物的筛选原理：为人为目标菌株的生长提供有利条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制其他微生物的生长。 3、在土壤中分解尿素细菌的分离和修订数所必需的培养基：从物理性质来看，该培养基属于什么种类，固体培养基，该培养基中的哪一种是碳源、氮源？碳源：葡萄糖氮源：尿素，培养基的氮源是尿素，只有能合成脲酶的微生物分解尿素5 .培养基分解尿素选择微生物的原理，允许特定种类的微生物生长的同时抑制或阻止其他种类的微生物生长的培养基称为选择培养基，6 .如何证明该培养基具有选择性以尿素为唯一氮源的培养基，牛肉糊剂培养基分离尿素细菌， 判断该培养基有无

3、选择性，仅使尿素细菌生长，使多种微生物生长，1，显微镜直接修正数：使用血细胞修正数板(血细胞修正数板)，在显微镜下修正一定容积的试样中的微生物的数量，修正菌落数：不适合不能区分死菌和活菌的运动细菌的修正数，缺点： 2 .间接修正数法(活菌修正数法)的原理：稀释度足够高时，微生物在固体培养基上形成的菌落是单细胞繁殖的，菌落表示原来的单细胞。 常用方法：稀释涂布平板法。 在每克样品的菌落数(CV)M中，c表示以某种稀释度在平板上生长的平均菌落数，v表示涂布平板时使用的稀释液的体积(ml )，m表示稀释倍数。 说明设定重复组的重要性。 在修订实验时，为了提高实验的说服力和准确性，必须涂抹至少3块平板

4、，作为重复组。 分析实验结果时，必须考虑设定的重复组的结果是否一致，结果不一致意味着操作错误，需要再次实验。 注意事项为了保证结果正确，选择在30300平板上计数蚁群数。 为了使结果接近真值，在3个以上的平板中加入相同的稀释度，涂布、培养，计算菌落平均值。 统一的菌落多比活菌的实际数量低。 校正公式：每克样品菌株数=(CV)M，某学生在稀释倍数为106的培养基中测定的平板上的菌落数的平均数为234，每克样品的菌落数为(涂布平板时使用的稀释液体积为0.1ml)()a.2.34108主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可靠性。 例：对分解尿素的细菌进行筛选和修订菌落数的

5、实验，a先生从对应的106倍稀释培养基中筛选了约150个菌落，而其他学生在相同稀释度下只选择了约50个菌落。 分析其原因。 原因：土样不同培养基的污染和操作失误(或混入其他含氮物质)，总结：从这个事例可以看出，实验结果很有说服力，对照设置是不可缺少的。 方案1 :其他同学用与a同学相同的土样进行实验，方案2:a同学制备的培养基不加入土样进行培养，作为空白对照证明培养基是否被污染。 结果预测：如果结果与a先生一致，则证明a没有错；如果结果不同，则证明a先生的操作错误和培养基的调配存在问题。 从肥沃、酸碱度接近中性的湿润土壤中取样。 将表层土捞出3 cm左右后进行取样，将样品放入预先准备好的信封中

6、。 “微生物天然培养基”为土壤取样，数量最多，种类最多，约70%为细菌，取土铲和填土信封在使用前必须灭菌。 应该在火焰的旁边摄取10g土壤。 在稀释土壤溶液的过程中，逐步在火焰旁进行，分离不同的微生物采用不同的稀释度原因：不同的微生物在土壤中的含量不同的目的：保证菌落数在30300之间，得到适合修正数的平板，(2)样品稀释，(3)取样涂布，实验时注明培养基的种类、培养时间、稀释度。 现在还有什么减少吗？ 未接种的选择培养基，接种的完全培养基，(4) .微生物的培养和观察，菌落数时，每24h订正一次菌落数。 结果选择菌落数稳定时的记录，防止因培养时间不足而遗漏菌落数。 培养微生物常常需要不同的培

7、养温度。 细菌： 3037培养12d放线菌： 2528培养57d霉菌： 2528的温度下培养34d。 在微生物的培养和观察中，无菌操作1、铲土用的铲土样的信封在使用前需要灭菌。 2 .在火焰旁取土。 将火焰附近的土样放入锥形瓶，塞上棉塞。 3 .在稀释土壤溶液过程中，每一步必须在火焰旁操作。 2 .做上记号标明培养基的种类、培养日、稀释度等。 3修订时间，3，4 .结果分析和评价1 .对照实验表明，培养物有杂菌污染，菌落数高的培养基如果不发挥选择作用，菌落形态多样，菌落数高。 2提示：选择各平板上有30300个菌落的稀释倍数，校正每克样品菌数最佳。 相同稀释倍数的3个重复菌落数不能有差异，差异

8、大表明实验不准确。 如果得到2个以上菌落数为30300的平板，说明稀释操作比较成功，1 .在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。 培养了某种细菌后，PH值越高指示剂越红，表明可以分解尿素。 5 .课外拉伸，纤维素是地球上含量最丰富的多糖物质，植物每年产生的纤维素分布在超过70亿吨植物的根、茎、叶中，纤维素生物燃料：最希望替代石油能源，课题3分解纤维素微生物的分离，一，基础知识，一.纤维素土壤中的一些微生物产生纤维素酶，可将纤维素分解成葡萄糖进行再利用。 2 .纤维素酶纤维素酶是至少含有C1酶(外切酶)、CX酶(内切酶)、葡萄糖苷酶三种成分的复合酶，其中纤维素分解成纤维素原，第三种酶将纤维

9、素原分解成葡萄糖。 一、基础知识、(2)纤维素降解菌的筛选、一、纤维素降解菌的筛选方法此方法可通过反应直接筛选。 根据刚果红染色法、颜色、原理2，刚果红可以与纤维素形成反应，但水解后的纤维二糖和葡萄糖不能发生这样的反应。 纤维素分解时，无法形成红色复合体，出现以红色复合体为中心的红色复合体、纤维素酶、纤维素分解菌、透明层、是否形成透明层来筛选纤维素分解菌， 练习：1 .关于接下来的纤维素酶，a .纤维素酶是复合酶，至少3种b .纤维素酶可以将纤维素分解为葡萄糖c .纤维素酶去除植物细胞壁d .葡萄糖苷酶可以将纤维素分解为葡萄糖， 2 .能够用刚果红法筛选纤维素分解菌的a .刚果红能量和纤维素的红色复合体b .刚果红能量和纤维二糖的红色复合体c .刚果红能量和葡萄糖的红色复合体d培育的目的是？ 你会选择什么样的殖民地呢？ 识别培养基的特征吗？ 怎么识别？ 根据：微生物对生存环境的要求，去相应的环境中寻找，目的：增加纤维素分解菌的浓度，从样品中分离出必要的微生物，刚果染色法，1，纤维素分解菌选择培养基属于_ _ _ _ _ _ (固体，液体)培养基。 原因是： _ _ _ _ _ _ _，【资料2】如果存在，其选择机制为_ _，能够分解纤维素的微生