病毒宏基因组学

1、2020/7/10,读书报告,汇报人：李小阳,2103年1月4日,病毒宏基因组学概述及其应用,研究背景,宏基因组学简介,病毒宏基因组学,研究策略与技术路线,研究成果与前景展望,Here We Go！,2020/7/10,一大难题,在人类生产生活中，致病的微生物众多，其中病毒性疾病占据大多数，而现有的诊断方法不可能囊括所有的病毒。因此，从宏观上把握致病性病毒的潜在数量种类以及致病机理变得尤为重要。,2020/7/10,案例1：,Electron micrographs of the human fecal sample. (a) Rod-shaped particles negatively s

2、tained with potassium phosphotungstate in 2003. (b) Icosahedral (open arrows)and short rod-shaped particles (filled arrow) recently stained with ammonium molybdate, from the second fraction of the sucrose gradient. Scale bars = 50 nm.,2013年6月巴西圣保罗阿道夫鲁茨研究所的西尔瓦娜等人利用病毒宏基因组学对人面部潜在微生物进行研究。,案例2：,2002年Brei

3、tbart应用鸟枪测序法（shotgun sequencing）首次对美国加州海岸的2处海洋中病毒群体进行研究，发现374-7114个潜在的新病毒。遗憾的是无法对其进行归类。,两个案例,病毒宏基因组学何以横空出世,四大瓶颈,很多病毒缺乏特异的细胞系或者生长过程中观察不到细胞病变(CPE)。,用电镜来观察病毒其灵敏性相对较低。,血清学反应，高效的特异性抗体很难获得，有的出现交叉反应而影响结果。,PCR法必须基于基因序列，对于未知序列的病 毒和变异性大的病毒此法难以实施。,宏基因组学,宏基因组学研究的对象是特定环境下所有生物遗传物质的总和，它包含了可培养的和不可培养的微生物的基因总和。研究热点：细

4、菌和病毒宏基因组学。,宏基因组学(Metagenomics)是将环境中全部微生物的遗传信息看作一个整体, 自上而下地研究微生物与自然环境或生物体之间的关系。,宏基因组学(Metagenomics)是将环境中全部微生物的遗传信息看作一个整体, 自上而下地研究微生物与自然环境或生物体之间的关系。,2020/7/10,病毒宏基因组学,病毒宏基因组学：宏基因组学的一分支，指研究特定环境中的病毒群落一门学科。,应用,解释未知病因,挖掘新的活性物质,分析特定环境中的病毒群落,发掘潜在的新的病毒性疾病,病毒宏基因组学,2005年,Edwards首次提到病毒宏基因组学这一概念，其描述的是环境中的病毒群落噬菌体

5、。,2007 年, Delwart 再次提到病毒宏基因组学这一概念,并对宏基因组学挖掘新病毒的方法进行了阐述； 该文侧重于人和动物机体中的真核病毒群落。,最早应用宏基因组学理论分析病毒群落的科学家是Breitbart教授，他于2002年应用鸟枪测序法（shotgun sequencing）首次对美国加州海岸的2处海洋中病毒群体进行研究，发现374-7114个潜在的新病毒。,2006年，Zhang等应用宏基因组学在人的粪便中发现了大量的植物病毒。,2010 年，Li 等分析了蝙蝠粪便中的病毒群落。该研究发现了大量新的哺乳动物病毒和昆虫病毒。,2020/7/10,研究策略与技术路线,2020/7/

6、10,研究策略与技术路线,VIS:Very Important Step,2020/7/10,研究策略与技术路线,遗传物质的分离与富集,2020/7/10,研究策略与技术路线,基因组cDNA文库：cDNA文库中的外源DNA片段，是互补DNA。cDNA是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的双链cDNA 。,基因组DNA文库：将生物体的全部基因组用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度的DNA片段，与合适载体体外转化至宿主细胞所获得的阳性菌落。,基因文库：某个生物的基因组DNA或cDNA片段与适当的载体在体外通过重组后，转化至宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到

7、大量的阳性菌落(或噬菌体),所有的菌落或噬菌体的集合。,2020/7/10,2020/7/10,研究策略与技术路线,根据宏基因组学文库筛选方法和研究目的的不同，构建宏基因组学文库的载体和方法也各有不同。构建的宏基因组学文库分为载体克隆文库和基于新一代测序技术的加接头的文库。,常用构建文库的载体为：大片段插入载体细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC）和粘粒（coamid）载体、表达载体(pBluescript SK+)、穿梭载体(Cosmid pOS700)及普通克隆T载体。,2020/7/10,研究策略与技术路线, 载体的制备。 高纯度大分子量

8、基因组 DNA的提取。 高质量大相对分子质量 DNA 的部分酶切与脉冲电泳分级分离。 载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞。 重组克隆的挑取和保存。,基因组 DNA 文库的构建程序：,连接,转化,筛选阳性克隆,2020/7/10,研究策略与技术路线,载体的种类 可装载的外源DNA 质粒（plasmid） 10kb 噬菌体（ phage） 0-23kb 粘粒载体（cosmid） 45kb 细菌人工染色体BAC 100kb 酵母人工染色体YAC 300kb-1.2Mb,虽然载体种类众多，但基于研究的目的基因大小以及相关文献的报道，质粒载体和BAC的选用较为频繁。,2020/7/10,研究策略与

9、技术路线,宿主选择-常用的宿主主要有大肠埃希菌以及链霉菌属或假单胞菌属。,DH5 E. Coli,测序与序列分析：选取大小不等的片段测序，分析测序的结果质量，将测序波峰良好的序列进行载体和引物的去除及拼接。在NCBI数据库中，应用blastn和blastx工具，分别进行核苷酸序列和6框架阅读翻译的氨基酸序列比对。,2020/7/10,研究策略与技术路线,基因组cDNA 文库的构建：,2020/7/10,总RNA,Oligo(dt)纤维素柱或磁珠分离,Oligo(dt)+reverse transcriptase,RNase H,DNA ploymerase DAN ligase,TdT加尾,第

10、一步：mRNA的分离。,第二步：第一条cDNA链的合成。,第三步：第 二条cDNA 链的合成。,第四步：克隆双链 cDNA至载体并导入E.coli,2020/7/10,研究策略与技术路线,筛选宏基因组学文库的技术,功能 性筛 选法,底物诱 导基因 表达法,稳定性 同位素 技术筛 选法,荧光原 位杂交 技术法,能有效的筛选到具有活性的物质和新型抗生素。,受限于表达型的宿主菌株、工作量大及效率低。,直接测序法,序列拼接-拼接的contigs或者单序列通过不同的数据库进行核苷酸和氨基酸的比对-筛选有用的目的信息。,罗氏公司454焦磷酸测序技术和Illumina公司推出的Solexa测序技术,高通量测

11、序,2020/7/10,研究成果与前景展望,在我国腹泻儿童粪便中首次发现HBoV2、HPeV、Aichi virus、Klassevirus/salivirus和Human cosavirus 等新发病毒（单同领，2011）。,在美国猪群中发现了kubovirus,sapovirus,sapelvirus,猪肠道病毒9和猪肠道病毒10，星状病毒，Teschovirus，PBoV3,环病毒，新的微小核酸RNA病毒等。其中星状病毒和 PBoV3为新的种；环病毒、Rosavirus1 和Rosavirus1 可能为的新的病毒属或者新的病毒科（单同领，2011）。,对患有肠道病毒性肠炎的火鸡群，进行病

12、毒宏基因组学分析，发现了大量的呼肠孤病毒、小病毒、星状病毒等，系统描述了多种病毒共同感染火鸡，导致火鸡生产性能降低的可能性（Day，2010）。,对采集北美的蝙蝠粪便进行病毒组学研究，结果发现蝙蝠体内携带的病毒种类十分丰富，不仅含有大量的动物病毒，而且还有植物和昆虫病毒（Li，Donaldson，2010）。,应用病毒宏基因组学技术结合高通量测序和生物信息学分析我国腹泻仔猪粪便内的病毒群落，初步鉴定出此次腹泻的主要病因为变异PEDV；分离和鉴定1 株变异PEDV（JS-2013），其可作为研发疫苗的候选毒株（单同领，童光志，2013）。,前景展望,前景展望,面临的挑战,运用病毒宏基因组学，已经成功地从多种环境样品中鉴定出多种病毒，使人们了解到不同环境