分子生物学-转录.ppt

1、1,第 十 六 章,RNA的生物合成 RNA Biosynthesis,2,掌握：DNA复制和转录的区别 掌握：转录模板的特点和所需的酶 理解：原核和真核生物转录的过程及二者间的差异 熟悉：真核生物mRNA的加工过程（掌握断裂基因、内含子、外显子的概念） 了解：tRNA和rRNA的加工,学习目标,3,在生物界，RNA合成有两种方式：,一是DNA指导的RNA合成，也叫转录，此为生物体内的主要合成方式，也是本章介绍的主要内容。 另一种是RNA指导的RNA合成(RNA-dependent RNA synthesis)，也叫RNA复制(RNA replication), 由RNA依赖的RNA聚合酶(R

2、NA-dependent RNA polymerase)催化，常见于病毒，是逆转录病毒以外的RNA病毒在宿主细胞以病毒的单链RNA为模板合成RNA的方式。,4,转录 (transcription) 生物体以DNA为模板合成RNA的过程(原料、原则、酶、方向） 。,转录,5,复制和转录的相同点,酶促的核苷酸聚合； DNA为模板； 依赖DNA的聚合酶； 生成3，5磷酸二酯键； 5 3方向聚合； 遵从碱基配对规律。,6,复制和转录的区别,引物 需要 不需要,7,参与转录的物质,原料: NTP (ATP, UTP, GTP, CTP) 模板: DNA 酶: RNA聚合酶(RNA polymerase,

3、 RNA-pol) 其他蛋白质因子,8,模板和酶 Templates and Enzymes,第一节,9,5 3,3 5,模板链,编码链,编码链,模板链,一、转录模板,不对称转录,10,不对称转录(asymmetric transcription),在DNA分子双链上某一区段，一股链用作模板指引转录，另一股链不转录 ； 模板链并非永远在同一条单链上。,11,DNA分子上能转录出RNA的区段，称为结构基因(structural gene)。 DNA双链中按碱基配对规律能指引转录生成RNA的一股单链，称为模板链(template strand)，也称作无意义链或Watson链。相对的另一股单链是编

4、码链(coding strand)，也称为有意义链或Crick链。,12,5GCAGTACATGTC 3,3 c g t g a t g t a c a g 5,5GCAGUACAUGUC 3,NAla Val His Val C,编码链,模板链,mRNA,蛋白质,转录,翻译,13,Roger Kornberg Won Nobel Prize for chemistry 2006.,二、 RNA聚合酶,14,（一）RNA聚合酶催化RNA链合成的机制,RNA合成的化学机制与DNA依赖的DNA聚合酶催化DNA合成相似。,( NMP )n + NTP ( NMP ) n+1 + PPi,RNA,延长

5、的RNA,15,DNA聚合酶在启动DNA链延长时需要引物存在，而RNA聚合酶不需要引物就能直接启动RNA链的延长。,16,（二）原核生物的RNA聚合酶（1种）,17,核心酶 (core enzyme),全酶 (holoenzyme),参与转录延伸,参与转录起始,18,19,利福平和亚基结合抑制RNA聚合酶,20,（三）真核生物的RNA聚合酶 （3种）,均由多个亚基构成，抑制剂鹅膏蕈碱（毒蘑菇“死亡之伞”）,21,Amanita phalloides （death cap）,-amanitin,22,真核生物RNA聚合酶的结构比原核生物复杂，所有真核生物的RNA聚合酶都有两个不同的大亚基和十几个

6、小亚基. RNA聚合酶由12个亚基组成，其最大的亚基称为RBP1。 RNA聚合酶最大亚基的羧基末端有一段共有序列(consensus sequence)为Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser的重复序列片段，称为羧基末端结构域(carboxyl-terminal domain, CTD)。 CTD对于维持细胞的活性是必需的。,23,原核生物的转录过程 The Process of Transcription in Prokaryote,第二节,24,（一）转录起始,一、原核生物的转录过程,起始 延长 终止,25,2. DNA双链局部解开，形成开放转录复合体(open trans

7、cription complex) ；,1. RNA聚合酶全酶(2)与模板结合，形成闭合转录复合体(closed transcription complex) ；,3. 在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应，形成转录起始复合物：,RNApol (2) - DNA - pppGpN- OH 3,转录起始复合物:,5-pppG -OH + NTP 5-pppGpN - OH 3 + ppi,转录起始过程：,4. 亚基脱落,26,1、模板上酶的辨认、结合,调节序列,转录是不连续、分区段进行的。 每一转录区段可视为一个转录单位，称为操纵子(operon)。操纵子包括若干个结构基因及其上游(upstr

8、eam)的调控序列。 调控序列中的启动子是RNA聚合酶最先结合模板DNA的部位，也是控制转录的关键部位。,27,原核生物以RNA聚合酶全酶结合到DNA的启动子上而起动转录，其中由亚基辨认启动子，其他亚基相互配合。 对启动子的研究，常采用一种巧妙的方法即RNA聚合酶保护法。,28,RNA聚合酶保护法（Footprinting）,29,30,开始转录,T T G A C A A A C T G T,-35 区,(Pribnow box),T A T A A T A T A T T A,-10 区,原核生物启动子保守序列,RNA-pol辨认位点 (recognition site),31,RNA聚合

9、酶全酶在转录起始区的结合:,32,E.coli开放转录复合体的形成,33,2. DNA双链局部解开，形成开放转录复合体(open transcription complex) ；,1. RNA聚合酶全酶(2)与模板结合，形成闭合转录复合体(closed transcription complex) ；,3. 在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应，形成转录起始复合物：,RNApol (2) - DNA - pppGpN- OH 3,转录起始复合物:,5-pppG -OH + NTP 5-pppGpN - OH 3 + ppi,转录起始过程：,4. 亚基脱落, cycle,35,（二）转录延长,

10、1. 亚基脱落，RNApol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移；,2. 在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链不断延长。,(NMP) n + NTP (NMP) n+1 + PPi,36,Unwinding generates supercoils in the DNA that can be relieved by DNA topoisomerases. Actinomycin D was the first antibiotic to find therapeutic application in tumor chemotherapy. It binds to the

11、DNA template and interferes with the movement of RNA polymerase along the DNA.,37,转录空泡(transcription bubble)：,RNA-pol （核心酶） DNA RNA,38,5,3,DNA,原核生物转录过程中的羽毛状现象,核糖体,RNA,RNA聚合酶,在同一DNA模板上，有多个转录同时在进行； 转录尚未完成，翻译已在进行。,这种形状说明：,39,原核生物的边转录边翻译电镜照片,40,识别转录起始部位。 与模板链结合，并使DNA双链打开。 催化NTP的聚合。 缺乏外切酶活性,无校对功能。 不同的识别不

12、同的转录起始位点。,RNA聚合酶作用特点,41,依赖Rho ()因子的转录终止 非依赖Rho因子的转录终止,（三）转录终止,指RNA聚合酶在DNA模板上停顿下来不再前进，转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来。,分类,42,1. 非依赖 Rho因子的转录终止,DNA模板上靠近终止处，有些特殊的碱基序列，转录出RNA后，RNA产物形成特殊的结构来终止转录，这种方式较普遍。,反向重复序列与发夹 Inverted repeats and hairpins,5NNGAATGCCNNNGGCATTCNN3 3NNCTTACGGNNNCCGTAAGNN5,5NNGAAUGCCNNNGGCAUUCNN3,4

13、4,茎环/发夹结构,45,茎环结构使转录终止的机理,使RNA聚合酶变构，转录停顿； 使转录复合物趋于解离，RNA产物释放。,46,A T P,2. 依赖 Rho因子的转录终止,相对少见，主要见于噬菌体。,47,Rho factor: ATPase activity helicase activity 易与polyC结合,48,真核生物的转录过程 The Process of Transcription in Eukaryote,第三节,49,（一）转录起始前的上游区段,不同物种、不同细胞或不同的基因，转录起始点上游可以有不同的DNA序列，但这些序列都可统称为顺式作用元件(cis-acting

14、element)。,一、真核生物的转录起始过程,真核生物的转录起始上游区段比原核生物 多样化，转录起始时，RNA-pol不直接结合模板，其起始过程比原核生物复杂。,50,顺式作用元件包括启动子、启动子上游元件(upstream promoter elements)或promoter-proximal elements)等近端调控元件和增强子(enhancer)、沉默子等远隔序列。,51,一个典型的真核生物基因上游序列:,起始点上游多数有共同的TATA序列，称为Hognest盒或TATA盒(TATA box)。 TATA盒和Inr一起通常被称为核心启动子。,52,TATA盒的作用在于决定转录的起

15、点，序列的改变会使转录位点偏移；缺失TATA盒，转录将在许多位点上开始。 TATA盒决定转录的效率： 如鸡蛋清蛋白基因启动子的TATA变为TAGA后，转录效率大大下降,53,转录起始点,TATA盒,CAAT盒,GC盒,增强子,顺式作用元件(cis-acting element),AATAAA,切离加尾,转录终止点,修饰点,外显子,翻译起始点,内含子,OCT-1,OCT-1：ATTTGCAT八聚体,54,（二）转录因子,能直接、间接辨认和结合转录上游区段DNA的蛋白质，现已发现数百种，统称为反式作用因子(trans-acting factors)。,反式作用因子中，直接或间接结合RNA聚合酶的，

16、则称为转录因子(transcriptional factors, TF)，或基本转录因子/通用转录因子。,55,参与RNA-pol转录的TF,稳定TFD-DNA复合物，结合RNA pol 促进RNA pol结合及作为其它因子结合的桥梁 解螺旋酶，结合TFH 解旋酶，作为蛋白激酶催化CTD磷酸化,56,（三）转录起始前复合物 (pre-initiation complex, PIC),真核生物RNA-pol不与DNA分子直接结合，而需依靠众多的转录因子。,57,TFF,A,B,由RNA-Pol 催化转录的PIC（pre-initiation complex),H,E,TBP,TAF,TFD-A-

17、B-DNA复合物,TATA,A,B,TBP,TAF,TATA,H,E,PIC组装完成，TFH解开双螺旋并使CTD磷酸化,58,型基因中的四类转录因子,59,RNA聚合酶II与启动子的结合、启动转录需要多种蛋白质因子的协同作用。通常包括多种顺式作用元件与反式作用因子的作用、因子和因子之间互相辨认、结合，以准确地控制基因是否转录、何时转录以及转录的效率。,60,PIC的形成,61,（四） 拼板理论(piecing theory),为了保证转录的准确性，不同基因需不同转录因子。 拼板理论(piecing theory) ：少数几个反式作用因子（主要是可诱导因子和上游因子）之间互相作用，再与基本转录因

18、子、RNA聚合酶搭配而有针对性地结合、转录相应的基因。,62,二、转录延长,真核生物转录延长过程与原核生物大致相似，但因有核膜相隔，没有转录与翻译同步的现象。,RNA-pol前移处处都遇上核小体。,转录延长过程中可以观察到核小体移位和解聚现象。,63,RNA-Pol,RNA-Pol,RNA-Pol,核小体,转录延长中的核小体移位,转录方向,64,5-AAUAAA-,5 -AAUAAA-,核酸酶,-GUGUGUG,RNA-pol,AATAAA GTGTGTG,转录终止的修饰点,5,5,3,3,3加尾,AAAAAAA 3 mRNA,三、转录终止, 和转录后修饰密切相关。,65,复制与转录特点比较,

19、66,真核生物的转录后修饰 Post-transcriptional Modification,第三节,67,真核生物转录生成的RNA分子是初级RNA转录物(primary RNA transcript)，几乎所有的初级RNA转录物都要经过加工，才能成为具有功能的成熟的RNA。 加工主要在细胞核中进行。,68,几种主要的修饰方式,1. 剪接(splicing),2. 剪切(cleavage),3. 化学修饰(modification),4. 添加(addition),5. 编辑,69,一、真核生物hnRNA的加工包括首、尾修饰和剪接,（一）hnRNA在5-末端加 “帽”,大多数真核mRNA的5

20、-末端有7-甲基鸟嘌呤的帽结构。 这个真核mRNA加工过程的起始步骤由两种酶，加帽酶(capping enzyme)和甲基转移酶(methyltransferase)催化完成。,70,帽子结构（5 m7GpppGp）,71,5 pppGp,5 GpppGp,帽子结构的生成,72,m7Gppp m7GpppN1mp,73,m7GpppN1mpN2mp,74,帽子结构功能： (1)保护mRNA免受核酸酶水解 (2)与帽结合蛋白质复合体结合，并参与mRNA 和核糖体的结合，与翻译起始有关 (3)与mRNA向核外的转运有关 (4)增强mRNA剪接效率,75,尾结构：polyA 加尾过程：先由核酸外切酶

21、切去3 末端一些过剩的核苷酸，然后加入polyA,（二）前体mRNA在3端特异位点断裂并加上多聚腺苷酸尾,76,多聚腺苷酸聚合酶（poly(A) polymerase, PAP）,77,利用polyA纯化mRNA,78,尾功能：（1）保护RNA，防止被水解 （2）与翻译起始有关 （3）与mRNA向核外的转运有关 注意：并不是所有基因的转录产物都有polyA尾。,79,断裂基因（外显子和内含子）,why,what,hnRNA,HOW,二次转酯反应,（三）hnRNA 的剪接,TOOL,snRNA, 剪接体,80,1993年诺贝尔生理学或医学奖得主,罗伯茨 Richard J. Roberts 美国

22、贝弗莉新英格兰生物实验室 1943年-,夏普 Phillip A. Sharp 美国麻省理工学院癌症研究中心 1944年-,why,81,82,鸡卵清蛋白成熟mRNA与DNA杂交电镜图,DNA,mRNA,目 录,why,83,真核生物中的结构基因由若干个编码区和非编码区相互间隔，但又连续镶嵌而构成，因此真核生物的结构基因称为断裂基因。,断裂基因(split gene),编码区 A、B、C、D,why,84,外显子 在断裂基因及其初级转录产物上出现，并表达为成熟RNA的核酸序列。 内含子 隔断基因的线性表达而在剪接过程中被除去的核酸序列。,注意：并不是所有外显子均表达，所有内含子均不表达。,wh

23、y,85,86,内含子的分类,根据基因的类型和剪接的方式，通常把内含子分为4类。,I：主要存在于线粒体、叶绿体及某些低等真核生物的 rRNA基因； II：也发现于线粒体、叶绿体，转录产物是mRNA； III：是常见的形成套索结构后剪接，大多数mRNA基因有此类内含子； IV：是tRNA基因及其初级转录产物中的内含子，剪接过程需酶及ATP。,87,剪接体（spliceosome）,WHO,2015年8月，酵母剪接体的高分辨率结构 2016年12月又陆续报道了酵母剪接体在不同工作状态下的高分辨结构 2017年5月12日，人源剪接体的原子分辨率结构,88,tool,snRNA (small nucl

24、ear RNA) 种类：U1 ,U2 ,U4 ,U5 ,U6,GUAAGU,AG,UACUACA,共有序列,支点序列,5,3,exons（外显子） introns（内含子）,hnRNA,HOW,内含子的结构,90, IVS-2-654(CT)剪接突变是 -地中海贫血的一种最常见的基因 突变,据统计，1/3以上的遗传性疾病与RNA剪接异常有关。,91,U1 snRNP与U2 snRNP的识别结合,HOW,92,SnRNPs 对内含子的识别结合,branch site sequence,U1 snRNA,U2 snRNA,A,5splice site,U1 snRNP,U2 snRNP,3spli

25、ce site,剪接体,U1,U2,U5,U4/U6,U4,5,3,5,5,5,3,3,3,U5,U4/U6,lariat form （套索状结构）,剪接过程,HOW,第一次转酯反应,第二次转酯反应,剪接的机制二次转酯反应,HOW,鸡卵清蛋白基因,hnRNA,首、尾修饰,hnRNA剪接,成熟的mRNA,鸡卵清蛋白基因及其转录、转录后修饰,96,选择性剪切 选择性剪接,前体mRNA分子可发生可变剪接和可变剪切,97,剪接小结,对象,hnRNA,原因,工具,断裂基因、外显子 、 内含子,剪接体 (snRNPs、snRNA),过程,套索状结构,机制,二次转酯反应,99,（三）. mRNA的编辑(mRNA editing),概念：对 mRNA外显子的加工过程， mRNA转录后通过插入、缺失或替换（碱基），改变