纸片法抗菌药物敏感实验操作标准

1、纸片法抗菌药物敏感性实验操作标准4.3标准比浊管用硫酸钡比浊管(0.5麦氏比浊标准)标定接种菌液浓度。 比浊管制造方法是加入(1)0.048mol/L BaCl2、(1.175% w/v BaCl22H2O)0.5ml、99.5ml的0.18 mol/L(0.36N)H2SO4(1%v/v )溶液中作为比浊管(2)用光径1cm的分光光度计0.5麦氏标准比浊管在625nm波长下的吸收光度必须为0.08-0.1)选择与制备菌液的试管相同管径的螺旋试管，每根管分注4-6ml)拧紧试管帽，在室温的暗处保存(5)使用前，使比浊管旋转发挥作用出现大粒子时必须更换(6)每月更换比浊管或再检查比浊管的浊度。5

2、操作步骤5.1接种菌液的制备5.1.1增菌法的步骤如下： (1)至少选择琼脂平板上形态相同的菌落45个，用接种环选择其顶部，转移到4-5ml肉汁或大豆酪蛋白消化液； (2)在35下培养菌液浓度达到比浊管浓度(通常26小时)，或浓度达到约1-2108CFU/ml)用生理盐水或肉汁校正菌液浓度，使之与比浊管相同。 可用光电比浊。 目测比浊必须在适当的光线下反射黑色的线。5.1.2直接菌悬浊液法的步骤如下： (1)进行通常的药敏试验，将培养一晚的菌落(通常必须使用琼脂培养基等无选择培养基平板)直接用盐水或肉汁调制接种菌液。 将菌液浓度调节到0.5麦氏管(2)该方法适用于在肉汤培养基中难以生长的细菌，

3、例如嗜血杆菌、淋病奈瑟菌和链球菌及葡萄球菌的甲氧西林或苯并重氮青霉素的耐性试验(3)用该方法进行复方磺胺药的试验，则从平板上直接选择菌落5.2接种平板的步骤如下： (1)校准的菌液应在15分钟内使用。 在无菌棉样品上涂上菌液，用上端的管壁旋转按压几次，除去多馀的菌液(2)用样品涂布琼脂平板的整个表面，反复多次涂布，每次使平盘旋转60度，保证均匀涂布。 (3)打开培养皿盖35分钟，吸收培养基表面的水分。 然后贴药敏感纸(4)注意：不要使用浓厚的菌液，禁用未稀释菌和其他非标准菌液的接种平板。5.3密封片(1)在接种平板后，粘贴药敏片。 用镊子或针尖按住纸片，使其贴紧培养基表面。 纸片必须均匀粘贴，

4、纸片和纸片的中心距离必须在24mm以下。 原则上，在直径150mm的平板上贴12张纸片，在直径100mm的平板上贴5张纸片。 贴纸后请不要移动。 有些药物很快就会扩散(2)贴上纸片，在15分钟内，必须将平板放入35的恒温槽中。 静菌环的解释标准是在普通的环境中规定的，除了好血菌和淋病菌，平板不能放在高CO2环境中。 CO2和某些因子的作用能增大抗菌环。5.4将读取结果(1)培养16-18小时后，观察结果。 菌液浓度适当，涂得很好，抗菌环规则，细菌融合生长。 如果出现单一菌落，就需要说明接种量少，重新进行试验。 测定抗菌环径，应包括纸的直径：从背面目视手平的盘子，检查各平板，根据反射光(黑色无放

5、光背景)，用游标卡尺、普通尺或特制的模具测定抗菌环径，单位为毫米。 培养基中有血液时，要打开平皿盖，反射光从正面抑制菌轮。 如果是葡萄球菌和肠球菌，培养24小时后，用注射光检查苯二氮青霉素和万古霉素抗菌环内的耐性株的生长。 抗菌环内有什么样的生长表现表明是抗性株。 (2)肉眼不明显生长细菌的区域是抗菌环的边缘，有很难判别的小菌落。 如果在静菌环内生长着大量细菌，必须再移植、再鉴定，再次进行药敏试验。 变形菌在特定的抗菌药纸片周围扩展到细菌抑制区域，如果细菌抑制环的边缘清楚，扩散性的生长就不可计数。 甲氧西林和磺胺拮抗剂支撑着细菌的生长，所以测定该药时可以忽略轻微的生长(80%以上被抑制)，将浓

6、密的生长区域作为抗菌环的界限。 在加血的培养基上测定链球菌，测定抗菌环时，不含溶血环。 (3)参考表2的标准说明抗菌环的大小，以敏感、中介或耐药性的形式说明结果。6水灵的细菌Mueller-Hinton培养基只适用于快速生长的细菌，一般不适合测定柔软细菌。 用纸的方法进行水嫩细菌的药敏试验时，培养基、质量控制方法、解释标准都要修改为符合细菌。 以下介绍的纸片方法用于流感菌、淋病菌、肺炎链球菌等软细菌，结果准确。 其他细菌必须用稀释法测定。 厌氧菌不能用纸张扩散法测定抗菌药敏感性。结果的说明8.1抗菌环解释标准抗菌环解释标准如表2、2A、2B和2C所示。 表中所述的敏感分类首先是将抗菌环的直径与

7、用肉汁或平板稀释法测定的最低抗菌浓度(MIC )进行比较，从已知的敏感抗菌株的抗菌环或MIC的集团分布中得到的。 并结合MIC与抗菌环径的相关分布，结合常用药物量的临床药物代谢动力学关系进行分析。 最终结合临床疗效综合评价体外试验和药理数据。8.2灵敏度等级8.2.1敏感显示被检菌株感染用该抗菌药的常用剂量治疗是有效的。 排除禁忌症。8.2.2中介是指MIC接近药物血液浓度和组织液浓度的治疗效果比敏感菌低。 另外还显示，测定的菌株通过增加-内酰胺类药物等的给药量而得到抑制，或者通过药物的生理浓缩部位(尿等)得到抑制。 中介者还显示“缓冲区”，防止微小的技术因素失控，引起很大的误会(例如，某些菌

8、种对某些药物敏感，抗菌环不在该测定范围内，或者培养基的差异影响药物，药物中毒界限狭窄)。8.2.3耐性被检菌被认定为耐性是指抗菌药的常用给药量不受组织液内或血液中的浓度的抑制，或者由于具有特定的耐性机制(如-内酰胺酶)，临床治疗效果差。8.3灵敏度相关的MIC边界点的抗菌环直径与用标准方法(一般为肉汁稀释法)测得的MIC呈负相关。 表2、2a、2B和2C显示了与抗菌环的灵敏度边界点相关的MIC边界点。 与这些抗菌环直径相应的MIC边界点基于抗菌环和MIC的相关性研究和药物代谢动力学和临床治疗效果分析，基于NCCLS M7标准(messolationfordilivitionantimicrob

9、ialsssceptibititytestsforb 但是，方法论上与原始数据的不同，有偶然的细微差异。9质量管理方法9.1目的质量管理的目的是监测以下几个方面： (1)药敏试验操作的精度和精度。 (2)试验中的试剂的情况。 (3)作业者的工作。 只要使用遗传稳定的参考菌株，就能达到上述目的。9.2质量控制株要控制药敏试验的精度和精度，必须从可靠的来源中获得告发株。 质量控制株有： (1)大肠菌ATCC 25922、(2)大肠菌ATCC 35218、(3)绿脓菌ATCC 27853、(4)黄色葡萄球菌ATCC 25923、(5)大便链球菌ATCC 29212、(6)流感嗜血菌ATCC 4924

10、7 (表3A的HTM用) 流感杆菌ATCC 49766 (表3A的HTM用)，(8)淋病菌ATCC 49226 (表3B的GC琼脂用)，(9)肺炎链球菌ATCC 49619 (表3C的羊血mh琼脂用)。大肠杆菌ATCC 35218只用于内酰胺酶抑制剂的质量控制。 粪肠球菌ATCC 29212 (或ATCC 33186 )用于测定培养基中磺胺嘧啶抑制剂的水平。 粪肠球菌ATCC 29212也用于高浓度庆大霉素纸的质量控制。质量管理股的检查和保存方法如下(1)用与临床分离菌相同的抗生素测定质量控制株。(2)日常用的质量控制株最好在大豆酪蛋白消化液琼脂(M-H琼脂)上(普通株)或增强的巧克力琼脂上(

11、新鲜细菌)以4-8保存，每周继承一次，如果有长期保存的条件，则长期保存为好。 使用合适的保护剂，例如50%牛犊血清肉汁或脱纤维羊血，在-20以下保存。 以上方法不会改变细菌的抗菌药物敏感性。(3)日常使用的质量控制株至少要一个月更换一次，从冷冻干燥保存菌种中移植，或者购买新菌种。(4)测定时，先把菌种接种到肉汁中，培养4-18小时后，制成平板，得到单一菌落。(5)按推荐的方法选择菌落，调制接种菌液。(6)如果用该质量管理株测定的抗菌环的平均值没有出现明显的差异，该株就可以继续监视精度和精度。 平均直径有明显的变化，其差异不是方法学上的，如果显示质量控制株的污染和敏感性发生了变异的话，必须交换新

12、的株。9.3抗菌环的质量控制界限表3、3a、3B和3C显示了质量管理结果所认可的最大和最小抗菌环直径。 通常，每20个测量结果中只能允许一个失控(即，超过了列表所列精度的控制范围)。 20个连续测量中，有多少个以上的失控结果必须修正操作(例如，如果出现第二失控结果，就立即修正)。 另外，一个质量管理结果超过了质量管理界限范围的中间值的上下4个标准偏差范围的情况下也必须进行修正。 修正后，对连续20次测定的结果进行了观察。注意：本节是如何应对失控情况的，请勿与实验条件稳定时进行的每周一次的质量管理项目混淆(参照9.43节)。9.4质量管理测定的次数每批新的M-H琼脂或新的抗菌药纸片必须用质量控制

13、株检查。 质量控制股每天和常规工作一起测量，检查整个操作过程。 在实验结果被要求之前，不能减少检查次数。 实验是否满足要求，可以从以下几个方面来判断。 (1)与普通标本一起连续30天测定质量控制株。 (2)每种药物在每种细菌30个抗菌环中(如一种药物对每种细菌连续30天测定的结果)，超过表3所示范围的在3个以下。注意：这个过程是为了建立稳定的电影扩散法药敏试验的质量控制方法，为了最终达到每周能监视一次的目的，一定不要和9.3节的失控修正措施混淆。达到以上要求后，必须每周测量一次以上。 试剂有变动时，必须连续监视。 每周监测一次，如果发现不符合要求的结果，必须立即改为每天监测，寻找原因解决。 以

14、下方法调查原因： (1)连续5天测定质量控制株。 (2)每种药物对每种细菌测定的5个抗菌环不得超过表3的精度范围。 各药物对每种细菌连续测定的5个抗菌环的范围不得超过表3、3a、3B和3C的精度范围。必须满足上述要求(一个抗菌环直径超过精度范围，或者抗菌环的范围超过精度允许范围的情况下)，必须继续每天的监测。 今后连续30次测定质量管理株，只有在结果合格后才能改变为每周的监测。9.5误差的常见原因，只要质量管理结果超过表3、3a、3B和3C的允许范围，就应该从以下各方面寻找原因。 (1)记录有无质量管理结果的错误记录(2)测定抗菌环时有无读取错误(3)质量管理株的污染或其他变化(4)接种菌液过

15、浓或过薄(5)比浊管没有不均(6)孵化温度或孵化环境差(7)M-H琼脂批次间差如果发现结果失控，首先仔细检查平板，往往容易解决。 如果没有发现明显的操作错误，就要连续5天，每天测量质量管理股。 如果这五个连续的结果都在容许精度的范围内，所有的值都不超过容许精度的最大范围，可以以周为单位进行监视。 但是，如果一个抗菌环超过了精度的范围或精度的允许范围，就必须进行每天的监测。 用9.4节的方法进行30次质量管理达到要求后，可以恢复每周的监视。10方法的界限10.1对各种细菌的适用性本文将纸方法鉴定为快速生长的病原菌，菌株包括肠杆菌科、葡萄球菌、肠球菌、绿脓假单胞菌、不动杆菌。 经过适当的改变，可以测定嗜血杆菌、淋病菌和链球菌。 没有表中没有记载的细菌，例如使用的培养基的差异、孵化环境的差异、增长率的差异等再现性好的标准方法。 这种细菌的实验结果很难解释，所以不用纸片法测定。10.2容易引起误解的结果用特定的抗生素测试特定的细菌，可能会产生严重的误解，主要包括(但不限于)以下情况：第一、第二代头孢菌素和氨基糖苷类的沙门氏菌和志贺氏菌； 所有-内酰胺类抗生素(苯并唑啉、甲氧西林、乙氧西林除外)测定耐甲氧西林葡萄球菌头孢菌素、氨基糖苷类(高水平耐性试验除外)、