植物生物技术 第六章学习资料

植物生物技术第6章原生质体培养第一节原生质体研究的发展和应用第二节原生质体的分离与纯化第三节原生质体培养及植株再生本章主要内容第6章原生质体培养名词：原生质体了解原生质体培养的应用掌握原生质体分离的步骤掌握原生质体培养的方法本章教学目的与要求第6章原生质体培养

原生质体（Protoplast）含义：去掉细胞壁的由质膜包裹、具有生活力的裸露细胞。第6章原生质体培养微丝叶绿体线粒体质膜高尔基体细胞核内质网微管细胞壁液泡第一节原生质体研究的发展和应用第一节一、原生质体研究的发展1892年，Klercker用机械法分离植物原生质体1960年，Cocking用酶法制备高等植物原生质体首次获得成功1971年，Takebe首次从离体烟草原生质体培养中获得再生完整植株1986年，单个原生质体培养获得成功二、原生质体的应用种质资源超低温保存原生质体融合，克服生殖障碍筛选突变体遗传转化基础研究：细胞壁的发生过程、膜的结构等的研究研究案例第一节第二节、原生质体分离、纯化一、原生质体分离双子叶外植体胚性细胞第2节、原生质体分离及纯化多数植物分离原生质体的经典材料-----叶肉细胞。（一）外植体来源愈伤组织或悬浮细胞。第2节、原生质体分离及纯化（二）分离方法机械分离法酶法分离法第2节、原生质体分离及纯化1、机械分离法（Machanicalisolation）优点：

（1）能排除酶的有害影响；

缺点：

（1）原生质体的产量低；

（2）方法繁琐费力；

（3）局限性大第2节、原生质体分离及纯化（1）酶的种类纤维素酶类：降解构成细胞壁的纤维素果胶酶类：降解连接细胞的中胶层，分开细胞半纤维素酶类蜗牛酶：花粉母细胞和四分体小孢子2、酶法分离（Enzymaticisolation）第2节、原生质体分离及纯化（2）酶液的配制渗透压稳定剂及pH酶的配比及浓度第2节、原生质体分离及纯化（3）分离原生质体两步分离法一步分离法方法有二：第2节、原生质体分离及纯化图示原生质体分离过程（以叶片为例）过滤、离心加果胶酶和纤维素酶第2节、原生质体分离及纯化叶片愈伤组织第2节、原生质体分离及纯化二、原生质体纯化第2节、原生质体分离及纯化1、离心沉淀法原理：应用原生质体的比重大于溶液，离心后原生质体沉于底部。步骤：第一步原生质体溶液用400目网筛过滤。第二步离心（500-1000r/min，离心5-6min）。第三步吸取上清液，洗涤液重新悬浮，再离心沉淀，如此2-3次。第四步用原生质体培养液洗1次，收集原生质体。第2节、原生质体分离及纯化2、漂浮法原理：应用渗透剂含量较高的洗涤液使原生质体漂浮在液体的表面。步骤：第一步：400目网筛过滤。第二步：离心。第三步：取上清液，洗涤液重悬，离心。2-3次。第四步：收集溶液表面原生质体，用培养液洗1次。第2节、原生质体分离及纯化3、界面法25%蔗糖溶液13%甘露醇溶液原理：选两种不同渗透浓度的溶液，其中一种溶液密度大于原生质体的密度，另一种溶液小于原生质体的密度。第2节、原生质体分离及纯化三、原生质体活力测定1、形态识别：形态上完整，呈圆形，含有饱满的细胞质，颜色鲜艳的即为存活的原生质体。2、染色识别1）0.1%酚番红或Evans蓝染色：有活力的不被染色，死亡的被染上色。2）双醋酸盐荧光素(FDA)染色法：在荧光显微镜下有荧光的即为有活性的原生质体。第2节、原生质体分离及纯化四、影响原生质体分离的因素从理论上讲，只要用适当的酶处理，就能从任何活组织中分离得到原生质体但对于原生质体培养来说，要得到活性高、能进行分裂、形成愈伤组织、最后再生完整植株的原生质体则受许多因素的影响原生质体分离时主要应考虑取材、酶的种类、纯度、酶液的渗透压、酶解时间、温度等。第2节、原生质体分离及纯化1、基因型和外植体:

生长旺盛、生命力强的组织和细胞是获得高活力原生质体的关键，并影响着原生质体的复壁、分裂、愈伤组织形成乃至植株再生用于原生质体分离的植物外植体有叶片、叶柄、茎尖、根、子叶、茎段、胚、愈伤组织、悬浮培养物、原球茎、花瓣和叶表皮等第2节、原生质体分离及纯化叶肉细胞是常用的材料,叶片很易获得而且能充分供应。取材时，一般用刚展开的幼嫩叶片愈伤组织或悬浮细胞，避免植株生长环境的不良影响，可以常年供应，易于控制新生细胞的年龄，处理时操作方便，无需消毒ABC第2节、原生质体分离及纯化2、酶液及酶解方法用来分离植物原生质体的酶制剂纤维素酶、半纤维素酶：降解构成细胞壁的纤维素果胶酶：降解连结细胞的中胶层，使细胞从组织中分开，以及细胞与细胞分开酶解花粉母细胞和四分体小孢子时还要加入蜗牛酶离析酶（果胶酶）纤维素酶浓度在1%-3%，果胶酶在0.1%-1%，但也有例外第2节、原生质体分离及纯化3.分离培养基常用的配制分离原生质体酶液的溶液以及洗涤原生质体的溶液为CPW液CPW盐成分为第2节、原生质体分离及纯化根据渗透剂的浓度和成分可分为以下几种培养基:CPW13M:CPW盐+13%甘露醇(mannitol)CPW9M:CPW盐+9%甘露醇CPW21S:CPW盐+21%sucroseCPW0M:CPW盐溶液。多数情况下，甘露醇是常用的渗透剂，可能是由于它的钝性及扩散入原生质体的速度很慢的缘故，来保证一个稳定的渗透压第2节、原生质体分离及纯化4、酶处理条件最主要的是酶处理时的温度和pHpH大于6时不利于原生质体生存高温下短时间分离的原生质体不适于培养，他们易发褐和破裂。一般常用温度是23-28℃酶处理时间一般不超过24小时酶处理时在暗处培养叶片分离原生质体可在静置条件下进行，悬浮细胞由于壁厚，培养（分离）过程中间断低速震荡有利于酶渗透第2节、原生质体分离及纯化第三节原生质体培养及植株再生一、原生质体计数第6章原生质体培养原生质体培养前必须调到一定密度,即确定每毫升培养基中含多少原生质体用CPW9M悬浮原生质体,血球计数板计数,计算稀释倍数离心,去除CPW9M,用所算体积的培养基悬起原生质体,用于培养计数室分成25个大方格（双线隔开），每个大方格分成16个小方格，共400个小方格组成。计数室边长为1mm，则计数室的面积为lmm2，每个小方格的面积为1/400mm2。盖上盖玻片后，计数室的高度为0.1mm，所以每个计数室的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为1/4000mm3。系数4X106二、培养方法第3节、原生质体培养1、液体浅层培养第3节、原生质体培养原生质体悬浮液1mm厚液体培养基2x105/ml特点：通气好，原生质体代谢物易扩散，防止有害物质积累过多造成毒害，转移添加新鲜培养基方便，便于观察和照相。操作简单，可微量培养。但原生质体沉淀，分布不均，细胞团聚集多，难成单细胞株系。2、平板培养原生质体纯化、离心、稀释后，再与1.4%琼脂或琼脂糖（37

C左右）等体积混合成0.7%，培养于培养皿（2-3mm）中。第3节、原生质体培养特点：原生质体分布均匀，利于分裂，容易获得单胞株系，可定位跟踪观察。原生质体释放的有毒物质不易扩散。3、双层培养法（固、液培养）

培养皿底部铺一层0.7%琼脂糖的固体培养基，在其上进行原生质体浅层培养。第3节、原生质体培养固体培养基特点：原生质体分布均匀，有利于分裂，易获单细胞株系，能除去抑制分裂的有害物质，细胞植板率高。4、饲养层培养方法一：X-射线杀死原生质体，与生活力正常的原生质体混合，加入0.7%琼脂，制成混合液，培养于培养皿中。第3节、原生质体培养特点：以一种植物细胞制成的平板，支持另一种植物原生质体的生长。饲喂层没有种的特异性。方法二：X-射线杀死原生质体，与0.7%琼脂混合，在培养皿中铺成平板，作为饲养层，再将生活力正常的原生质体与0.7%琼脂混合，培养于饲养层上。4、饲养层培养特点：用材少，培养液消耗少，利于通风与观察，可做原生质体不同密度的培养对比试验，进行单细胞培养。第3节、原生质体培养三、原生质体培养基MS,KM8P,WPM第3节、原生质体培养四、原生质体培养及植株再生1、细胞壁再生

培养初期仍然为圆球形，随着培养时间的延长，逐渐变为椭圆形，此时表明已经开始再生细胞壁不同植物原生质体培养再生细胞壁所需时间不一样，从几小时到几天简单的鉴别壁的再生的方法是用荧光增白剂专染纤维素,在荧光灯下发出荧光第3节、原生质体培养一些因素影响壁的再生①碳源②培养条件——固体培养时细胞壁再生比液体培养时快③渗透剂的种类第3节、原生质体培养第一次分裂第二次分裂第三次分裂多细胞团第3节、原生质体培养2.原生质体的分裂肉眼可见细胞团愈伤组织器官发生途径胚胎发生途径植株第3节、原生质体培养3.细胞团形成及植株再生五、影响原生质体培养及植株再生的因素1、原生质体来源分离原生质体所用外植体的生理状态与原生质体的质量和其后的分裂频率有着密切的关系在小麦原生质体培养中，3-6月龄的悬浮细胞系分离的原生质体分裂率比1月龄的原生质体高第3节、原生质体培养2.基因型同一植物不同基因型的原生质体脱分化与再分化所要求的条件不一样，在相同条件下的再生能力也会不同第3节、原生质体培养3.培养基即使来源于同一种基因型的原生质体，在不同培养基中的再生能力也不一样MS,KM8P，MS-KM等培养基培养基中的附加物质也会影响到原生质体培养效果，如激素、无机盐组成、氨基酸、有机酸等。生长素过量使用易使液泡长大或增加新液泡，从而使细胞破裂第3节、原生质体培养4、渗透压调节剂培养的原生质体随发育进程需要不断降低渗透压，以促进细胞分裂。不同植物对调节剂的反应不一样有些物种以蔗糖和果糖作碳源和渗透压稳定剂时，细胞不能持续分裂，而用葡萄糖时，原生质体能持续分裂并形成细胞团蔗糖或葡萄糖单独使用或与甘露醇结合作为稳定剂，一旦糖被降解，培养基渗透压降低，很利于细胞分裂第3节、原生质体培养5.培养条件和方法密度:低于一定密度不能分裂,一般培养密度为:5×103—5×106/ml

固体培养要求密度较液体培养低光:暗培养利于壁形成和细胞再生。温度:通常22-25℃第3节、原生质体培养6.微电流处理增强植物自身微电流作用降低氧化胁迫等第3节、原生质体培养六、原生质体再生植株的遗传变异及利用1.染色体方