木薯杂交种子幼胚挽救技术规程

1T/GACIXXXX—XXXX木薯杂交种子幼胚挽救技术规程本文件规定了木薯（ManihotesculentaCrantz）体细胞的有关定义、分类分级标准、繁育技术和保存的规范，适用于木薯离体器官发生的分子机理研究，建立遗传转化体系，开展分子育种技术应用的要求。本文件适用于木薯杂交种子幼胚挽救、体细胞繁育与杂交育种。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T28096木薯细菌性萎蔫病菌检疫鉴定方法GB/T36808木薯细菌性叶斑病菌检疫鉴定方法NY/T3005植物品种的特异性、一致性和稳定性测试指南（木薯）NY/T2446热带作物品种区域性试验技术规程NY/T2669热带作物品种审定规范（木薯）NY/T1943木薯种质资源描述规范NY/T1685木薯生产良好操作规范（GAP）SN/T1616非洲木薯花叶病毒检测方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1离体组织木薯成熟植株的茎尖（或腋芽）分生组织先端的原始细胞。3.2膨大组织木薯无菌离体组织接种到诱导培养基上，细胞迅速生长、增殖变大，组织部位开始膨大，出现绿色突起，促进组织分化、生长。3.3体细胞胚胎木薯离体组织在特定培养条件下，形成的胚的类似物，经过球形胚、心形胚等发育过程。3.4胚性愈伤木薯诱导的体细胞组织质地较坚实，颜色有乳白色或黄色，表面具球形颗粒，其生长缓慢。3.5非胚性愈伤3.4描述除外的愈伤。3.6繁育木薯愈伤组织在特定的培养条件下，将初生胚状体分离、继代培养，诱导次生胚状体发生和增殖，进而诱导器官成熟与萌发。2T/GACIXXXX—XXXX4产地环境4.1材料取不同成熟阶段的种子材料：（1）未成熟种子子叶（a1）、胚芽（b1）；（2）成熟种子子叶（a2）、胚芽（b2）；（3）诱导萌发种子子叶（a3）、胚芽（b3）、胚轴（c3）。4.2培养基质制备4.2.1M1：MS（含维生素MurashigeandSkoog，1962）+2.00MCuSO4+2.00％蔗糖+0.30％Gelrite，PH5.8，灭菌；4.2.2M2：M1+10.00mg/LBAP，PH5.8，灭菌；4.2.3M3：M1+4.00mg/L2，4-D或12.00mg/LPicloram，PH5.8，灭菌；4.2.4M4：M1+0.10mg/LBAP，1.00mg/LNAA或0.05mg/LBAP+0.50mg/LNAA，PH5.8，灭菌；4.2.5M5：M1+0.10mg/LBAP+0.50mg/LIBA，PH5.8，灭菌；4.2.6M6：M1+0.40mg/LBAP，PH5.8，灭菌。4.3消毒处理将木薯种子用ddH2O冲洗30s，2次；无水乙醇浸泡冲洗10s；ddH2O冲洗30s，2次；0.1％升汞浸泡冲洗1次：（1）未成熟/成熟种子，2.0min，（2）诱导萌发种子，60s；ddH2O冲洗30s，2次；75％乙醇浸泡冲洗20s，2次；ddH2O浸泡冲洗30s，2次；无菌滤纸吸干。将已经消毒材料在无菌条件下，解剖、切取2.0mm～3.0mm外植体材料：子叶（a）、胚芽（b）和胚轴（c），置于M1培养基上保湿、培养，备用。4.4膨大诱导处理将外植体置于M1上进行预培养处理3d，以无预培养材料为CK，然后转移置于诱导膨大培养基M2上，26.00。C，16.00h光/8.00h暗，光照强度为800～1000Lx培养，1周；在体视显微镜下，用无菌针头挑取无褐化或者褐化不明显的膨大材料，备用。4.5体细胞胚胎诱导发生将膨大材料转移置于体细胞胚胎诱导培养基M3上，26.00。C，24.00h/暗培养，2周。每3天在体视显微镜下观察一次胚性愈伤的发生情况，当出现球型胚、鱼雷型胚茧状嵌合体，则将其分离、继代到新鲜M3上培养。4.6体细胞胚分化、增殖将体细胞胚胎转移置于M4，26.00。C，16.00h光/8.00h暗培养，光照强度为800～1000Lx培养，诱导胚状体分化、增殖，每2周继代一次。4.7体细胞成熟及子叶器官诱导发生将2～3个体细胞胚组成的小团簇放置到成熟诱导培养基M5，26.00。C，24.00h光培养，光照强度为800～1000Lx培养，直至子叶明显长大并变绿，及时处理褐化材料，避免污染；每周一次更换新鲜培养基。4.8茎叶器官伸长及生根诱导发生将成熟不定芽或绿色子叶切取3.00～5.00cm或约0.04cm2，至于茎叶器官伸长及生根诱导培养基M5上，26.00。C，16.00h光/8.00h暗，光照强度为800～1000Lx培养，每周一次更换新鲜培养基，观察茎叶器官的伸长生长及生根发生情况。3T/GACIXXXX—XXXX4.9不定芽及再生株系的继代培养将不定芽及再生株系小苗转移至于培养基M1的培养瓶中，26.0。C，16.0h光/8.0h暗培养，光照强度为800～1000Lx，继代培养，进行无性株系繁育。4.10再生苗移栽试验4.10.1炼苗打开瓶口，逐渐降低湿度，并逐渐增强光照，降低气孔口开度，逐渐恢复气孔功能，减少水分散失，促进新根发生，以适应环境，其湿度降低和光照增强进程依植物种类、品种、环境条件而异其合理程序应使原有叶片缓慢衰退，新叶逐渐产生。初始光线应为日光的1/10，其后每3d增加10摆放室外早晚见太阳余光；中午或太阳光太强，覆盖遮阴网；3天内饱和湿度，其后每2d～3d降低5％～8％。4.10.2移栽时期经过10d～15d炼苗，将根系的琼脂去处干净，即可移栽入田间基质，保湿炼苗，但一定要避免强光照射。4.10.3移栽设施栽培容器可用软塑料容器，也可用育苗盘，苗床也可作为试管苗移栽的场所，移栽后的栽培容器放在温室中培养。4.10.4移栽基质适合移栽再生苗基质要具备透气性、保湿性和保肥的特点，且容易灭菌处理，选用用珍珠岩，蛭石，草炭土或腐殖土比例为1：1：0.5；人工小温棚培养基质细沙：草木灰：腐殖土=1：1：1，装营养杯种植。4.10.5盆栽试验栽培容器可用软塑料育苗杯，培养基质细沙：草木灰：腐殖土=1：1：1。炼苗→自来水冲洗干净根部培养基→1000×甲基托布津溶液浸泡，30～60s→1000×多菌灵溶液浸泡，45～60s→800×生根粉浸泡，60s→移栽入营养杯中→定根水→温室大棚栽培管理、观察、记录。4.10.6移栽流程自来水冲洗培养基干净→1000×甲基托布津溶液浸泡，30s→1000×多菌灵溶液浸泡，45～60s→800×生根粉浸泡，60s→移栽入营养杯或沙床上→定根水→栽培管理、观察。5体细胞材料检疫鉴定5.1按NY/T3005植物品种的特异性、一致性和稳定性测试指南（木薯）执行。5.2按SN/T1616非洲木薯花叶病毒检测方法执行。5.3按GB/T28096木薯细菌性萎蔫病菌检疫鉴定方法执行。5.4按GB/T36808木薯细菌性叶斑病菌检疫鉴定方法执行。5.5按《植物检疫条例》和《植物就安逸条例实施细则（农业部分）》中相关规定执行。5.6送种茎样本，委托具相关检疫鉴定资质机构进行测试分析，并出具报告，指导应用。6体细胞质量检测6.1诱导次生体细胞胚胎、芽器官发生以及子叶成熟与萌发。取12、16天的成熟子叶，用解剖刀切成约0.25cm2的切片，放置于M3培养基上，5皿/品种，30个/皿，26。C，暗培养，每3天在体视显微镜下观察次生胚状体的发生情况。15天后统计出胚率。将子叶切片（约0.25cm2），放置于M6培养基上，5皿/品种，30个/皿，26。C，暗培养，每3天在体视显微镜下观察次生胚状体的发生情况。21天后观察记录、统计不定芽诱导情况并统计不定芽的数目。4T/GACIXXXX—XXXX将获得带有芽原基及再生不定芽材料转移放置于M4培养基瓶，26。C，16h（800～1000Lx）光照培养，每4天观察一次，直至长成幼苗第12、16天观察、统计生根苗数。6.2不定芽生根株系培养与移栽将获得离体再生株系材料转移接种到含有M1的培养瓶中，光照培养。3周后,将生根良好、健壮的材料进行炼苗后取出，注意尽量避免不定根的断裂，清水洗净附着在根系上的培养基，然后移栽到培养基质营养杯中，盖过根系即可；放置于温室中培养，并注意定时通风换气、保温、保湿，3周后可移植到大棚中。6.3产品质量要求按NY/T3005执行，送木薯种茎样本，委托具有植物品种的特异性、一致性和稳定性测试机构进行测试分析，并出具报告，指导应用。7体细胞定级指标7.1.1愈伤组织可分为：①结构致密型，表面光滑有光泽，结构致密，多为淡黄色或白色，易于再生芽；②结构松散型，多为白色，可以用于悬浮系建立。胚性愈伤组织质地较坚实，颜色有乳白色或黄色，表面具球形颗粒，其生长缓慢。7.1.2体细胞胚胎组织随着培养时间的延长，愈伤组织逐渐增多，乳白色、表面粗糙、结构紧密的胚性愈伤组织表面可见小而光滑、透明凸起的球形胚，继而长成心形胚。继续诱导2周后，球形胚或心形胚逐渐伸长，发育成鱼雷胚由愈伤组织、细胞或器官培养中，胚状体的诱导数量比诱导芽器官多；愈伤组织分化不定芽芽较难发育成完整植株，